Методическая статья

Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

DOI:

10.3791/52810

⸱

12 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1PRIMACEN, Cell Imaging Platform of Normandy, Inserm, IRIB, University of Rouen, 2Department of Neurobiology, School of Medicine, Yale University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время постнатального развития мозжечка незрелые гранулярные клетки, происходящие из зародышевой зоны, демонстрируют различные модальности миграции, чтобы достичь своего конечного пункта назначения и создать нейронные сети. Этот протокол описывает подготовку срезов мозжечка и конфокальный макроскопический подход, используемый для исследования факторов, регулирующих миграцию нейронов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во постнатального развития, незрелые клетки (гранулы возбуждающих интернейронов) демонстрируют тангенциальную миграцию во внешнем слое гранулированного, а затем радиальное перемещение в молекулярном слое и клеток Пуркинье слоя для достижения внутренний зернистый слой коры мозжечка. По умолчанию в миграционных процессах вызывает либо гибель клеток или потери нейронов, что приводит к дефициту в различных мозжечка функций. Центростремительное миграции ЗК включает в себя несколько механизмов, таких как хемотаксис и внеклеточной матрицы, деградации направлять клетки к их окончательной позиции, но факторы, которые регулируют миграцию клеток в каждом слое коры лишь частично известны. В нашем методе, острые кусочки мозжечка получают из P10 крыс, гранулы клетки метили флуоресцентным маркером цитоплазматической и ткани культивировали на мембранных вставками от 4 до 10 ч, прежде чем начать мониторинг в режиме реального времени миграции клеток с помощью конфокальной макроскопии при 37 ° С вНаличие CO 2. Во время их миграции в разных слоях коры мозжечка, ЗК могут подвергаться агонистов или антагонистов нейропептида, ингибиторы протеаз, блокаторы внутриклеточных эффекторов или даже токсичных веществ, таких как алкоголь или метилртути, чтобы исследовать их возможную роль в регуляции миграции нейронов ,

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В развивающихся мозжечка, восемь различных типов нейронов производятся последовательно между вторым эмбриональной недели и второй недели постнатального у грызунов 1. Возникнув первоначально из, первичной зародышевой зоне, незрелые ЗК (GC) Последние нейроны, чтобы быть получены от внешнего зернистого слоя (EGL), вторичного зародышевой зоне 2. В течение первых трех недель постнатального, мозжечковая кора расслаивается структура, организованная в четырех слоев, включая EGL, молекулярного слоя (МС), слой клеток Пуркинье (PCL) и внутренний зернистый слой (ИГЛ) (Рисунок 1). Через центростремительной миграции, незрелых ГК, глутаматергических интернейронов, достичь Igl в течение примерно 2 дней. К третьей недели постнатального, EGL исчезает и ИГЛ является то, что называется зернистый слой (GL) во взрослом мозжечке. В GL, ГК получить возбуждающие синаптические входы от замшелых волокон и униполярных кисти клеток, иингибирующие синаптические входы от клеток аксонов Гольджи. В ML, GC аксоны сделать возбуждающие синапсы с нейронами ГАМКергических в том числе клеток Пуркинье, корзины клеток, звездчатых клеток и клеток Гольджи 2.

В режиме реального времени наблюдение движения клеток мозжечка при острых срезов, полученных от раннего постнатального грызунов показывает, что ГК изменить свою форму одновременно с изменением модальности и скорости миграции во время их пути в коре мозжечка 3. Во первых двух послеродовых недель, предшественники GC активно размножаются в верхней части EGL. В средней части EGL, постмитотическими ГК мигрировать касательной в направлении их большей процесса. На границе EGL-ML, ГК замедлить их движение, клетки начинают вводить короткие вертикальные процесс нисходящей в ML. В ML, ГК имеют вертикально вытянутую тело клетки, тонкий процесс косую и более объемный процесс, ведущий, и мигрируют радиально вдоль глиальных волокон Бергмана. ВPCL, ГК остановить их движение, но после длительного стационарного этапа (2 ч), они пересекают границу PCL-Igl. В IGL, ГКС мигрировать к нижней части слоя в отсутствие глиальных поддержки волокна. После того, как кончики ведущего процесса подходить ИГЛ-белое вещество (WM) границы, ГК медленно и остановить их движение. Поперечные сечения мозжечка являются предпочтительными для касательных миграции исследований в то время как EGL сагиттальной ломтиками, посвященный радиальным миграции в ML, PCL и IGL. Некоторые регуляторные факторы движений ГК в том числе нейропептидов (например, соматостатин, РАСАР) были определены до сих пор, но полных механизмов, участвующих в пространственно-временной контроль ГК миграции в каждом слое коры еще в значительной степени неизвестны 1,4,5,6.

ГК миграция была изучена в течение последних 20 лет через видео- и конфокальной микроскопии с использованием либо проходящего света освещение для изолированных культивируемых клеток или флуоресцентной детекции для АМКУТе мозжечка ломтиками. Первоначально липофильные DiI, и в последнее время "Сотовый трекер" красители и клеточные выразил флуоресцентные белки были использованы для конфокальной или двухфотонного микроскопии 7,8. Успешные эксперименты зависеть от ряда конкретных процедур, которые делают простой протокол, но не так просто. В частности, острые кусочки должны быть стабилизированы при наблюдениях как правило, с самодельной нейлона ячеистой сети 9. Интенсивность света освещения должен быть как можно более низкой, чтобы избежать фототоксичность и фотообесцвечивания, предложенный сканирования многоточечной конфокальной микроскопии подхода. Кроме того, температура и CO 2 являются ключевыми параметрами окружающей среды начиная с нестабильностью могут повлиять на миграцию нейронов. Для облегчения и уточнения экспериментальных процедур, мы разработали конфокальной макроскопии протокол, который ограничивает движения ломтик, обеспечивает постоянные параметры окружающей среды, уменьшает фотообесцвечивание, увеличивает поле зрения (порядка миллиметров) и consequмому количество клеток (десятки), которые могут быть отслежены с помощью анализа изображений. Таким образом, 180 мкм срезы толщиной культивируют на мембранных вставками, и 6-луночные планшеты передается непосредственно под моторизованной цели 2X коммерческого конфокальной Макроскоп оснащен большим инкубации камеры, температуры и СО 2 контроллеров и системы контроля вибрации. Время проходит, а-Z-стеки затем выполняется в течение нескольких часов и фармакологических средств или биологически активные молекулы могут быть добавлены или доставлены в среде инкубации. Этот метод также может быть адаптирован для изучения миграции других типов нейронов в мозжечке или головного мозга на разных стадиях развития.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные (мужчина или женщина Вистар) родились и выросли в аккредитованной вивария (утверждения B.76-451-04), в соответствии с французским гидом по уходу и использованию лабораторных животных. Эксперименты проводились под руководством уполномоченных следователей (МБ, DV и LG) в соответствии с Директивой Европейского Совета сообщество (за 2010/63 / УП от 22 сентября 2010 года) и министерство сельского хозяйства Франции.

1. Подготовка медиа и инструменты

  1. В кабинете биологической безопасности, подготовки BSS 1x Хэнка (HBSS) в стерильной воде с 10-кратным маточного раствора, содержащего CaCl 2 (1,85 г / л) / MgSO 4 (0,9767 г / л) без MgCl 2. Добавить NaHCO 3 (350 мкг / мл), чтобы 1x раствор HBSS.
  2. В кабинете биологической безопасности, добавить N2 добавки (от 100-кратного раствора) и пенициллин (100 единиц / мл) -streptomycin (0,1 мг / мл) в модифицированной Дульбекко (DMEM) питательной смеси Дульбеккоры F-12 (1: 1).
  3. В стерильных условиях, готовят аликвоту (25 мкл, 2 ммоль) в цитоплазматической флуоресцентный краситель под названием Cell трекер Green в ДМСО (1,075 мл на 1 мг). Развести одну аликвоту в 5 мл DMEM в 15 мл коническую пробирку.
  4. Подготовка заполненный льдом ведро, чтобы средства массовой информации при 4 ° С.
  5. Дезактивации лабораторного стенда вершины и инструменты с 70% этанола.

2. Препарирование мозжечка от P10 крыс

  1. Быстро обезглавить крысят (P10) с изогнутыми ножницами эксплуатации за уши для того, чтобы получить начало спинного мозга.
  2. В задней части головы обезглавленной, сделать срединный разрез кожи от шеи к носу с тонкой радужной оболочки ножницами и отделить кожу от черепа с тонкой радужной оболочки ножницы и Дюмон # 3 щипцами.
  3. Используйте тонких ножниц радужной оболочки глаза, чтобы деликатно сделать две боковые разрезы от основания к ростральной области черепа. Снимите расчлененный череп с двумя # 3 щипцами. Снять бюстгальтерс любого приверженности с черепом, используя те же щипцы.
  4. Перевести мозг с конца ложки шпателя на чашку Петри (диаметром 35 мм), содержащей 2 мл ледяной HBSS среды.
  5. Поставьте чашку Петри, содержащую мозг в большей чашке Петри (диаметром 100 мм) со льдом и передачи в стадии стереомикроскопа.
  6. Под стереомикроскопа, изолировать мозжечок от мозга, dilaceration с помощью двух # 3 щипцы. Точно так же, удалить остаточный спинного мозга и мягкой мозговой оболочки-мембраны.
  7. Передача мозжечка в новом HBSS заполненный чашку Петри (диаметр 35 мм, 2 мл) с концом ложку шпателем и держать на льду.

3. Подготовка острых мозжечка ломтиками

  1. Под стереомикроскопа, вырезать мозжечка между червя и правого полушария как показано двумя головками стрелки на фиг.2А со стандартным скальпель ручкой # 3 твердое и # 15 хирургическим скальпелем.
  2. Положите одну каплю голубойoacrylate клей на vibratome образца диска и ждать 15-25 секунд, чтобы устранить токсичные пары растворителя.
  3. Собирать срезанную мозжечок с конца ложки шпателя и удалить излишки HBSS с чистыми бумажными полотенцами.
  4. Принесите мозжечок, близкий к образца диска. Закрепите отреза на образец диска и ждать 10 сек.
  5. Вставка образца диска в буферный лоток манипулятора, и повернуть его таким поперечной оси мозжечка перпендикулярно держателя ножа. Закрепите образец диска с помощью шестигранного ключа и заполнить аккуратно буфера поднос с HBSS среды до мозжечка не покрывается.
  6. Нагрузка дробленого льда в охлаждающую баню.
  7. Очистите лезвия три раза 70% этанолом, чтобы устранить любое масло.
  8. Вставьте лезвие в держатель ножа и закрепите зажимной винт.
  9. Поместите режущей кромки право позади задней кромки (от зрения пользователя) образца и определить его в качестве отправной точки. Используйте вперед команды, чтобы определить тОн конечную точку после передней кромки образца.
  10. Выберите секционирования скорость 2,5 и секционирования частоту 8. Выберите обрезки толщиной в 180 мкм. Начните ткани срезов.
  11. Встреча каждого раздела с использованием широким отверстием стекло усеченный пипетки Пастера и передачи в HBSS, содержащей чашки Петри (O 35 мм) помещали на лед.
  12. Использование двух # 5 щипцы, удалить мозговые оболочки тщательно от мозжечка, когда вмешательство с лезвием. Соберите максимум 5 ломтиков в мозжечке (рис 2, б).
  13. Удалить мозговых оболочек из мозжечка ломтиками тщательно с двумя # 5 щипцов под стереомикроскопа и отделить дольки аккуратно для лучшего нагрузки зонда.

4. Люминесцентные Окрашивание живых Интернейроны

  1. Перевести мозжечка ломтиками с широким отверстием стекла усеченного пипетки Пастера в 6-луночного планшета (макс 3 ломтика / на лунку). Аспирируйте среду HBSS.
  2. Выдержите ломтики (3 макс) в 5 мл лoading раствор флуоресцентного красителя (10 мкМ).
  3. Для защиты от света, покрытия планшет с алюминиевой фольгой. Положите его на гиро-подвижным столом при 35 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы облегчить маркировку клеток.
  4. Ломтики передачи на мембране Transwell вставить (3.0 мкм размер пор; Рисунок 2D) с широким отверстием стекла усеченного пипетки Пастера. Аспирируйте загрузки среды с пипеткой.
  5. Снимите вставку и заполнить скважину 1,9 мл DMEM. Заменить вставку и добавить 100 мкл DMEM в верхней части среза, чтобы покрыть ткань.
  6. Поместите пластину, содержащую культуру вставки в инкубаторе камере (37 ° С, 5% СО 2) в течение 2 часов, которые достаточно заметить, ШС в ML. Ли тканей плоские, чтобы вложение на вставки мембраны (рис 2E). Убедитесь, что ломтики не сушки.

5. Экс естественных изображений Через конфокальной макроскопии

  1. Передача пластины безпластиковая крышка в инкубатор прилагается к стенду конфокальной Макроскоп. Поместите стеклянную крышку на пластине вставки в Макроскоп. Поддерживать температуру в камере при 37,0 ° C ± 0,5 ° C, и поставить ломтики с постоянным потоком газа (95% O 2, 5% СО 2) через пластины вставки для поддержания постоянной рН. Подождите 2 дополнительных часа до покадровой эксперимента.
  2. Для визуализации GC миграции в срезах тканей, освещают подготовку с длиной волны света 488 нм с помощью лазерного диода через конфокальной лазерной сканирующей Макроскоп снабженной X2 сухого объектива (рабочее расстояние: 39 мм, диаметр: 58 мм, NA = 0,234), и обнаруживать излучение флуоресценции от 500 до 530 нм.
    1. Для точной решить движение ГК, получать изображения с дополнительной коэффициент оптического зума от 1,5 до 2,0. Соберите изображения GNS в одном фокальной плоскости или до 10 различных фокальных плоскостях вдоль оси каждые 30 мин до 12 ч.
  3. При необходимости, снимите стеклянную крышку и добавить небольшие объемы (1-10 мкл) биологических активаторов или ингибиторов в DMEM с 10 мкл пипетки, чтобы изучить их влияние на GC миграции.

Отслеживание 6. Сотовый

  1. Для каждого времени фильма, выполнить проекцию г-стека через режим Ecart типа в ImageJ. Модулируйте контрастность и уровень яркости этих образов, чтобы облегчить идентификацию и отслеживание меченых ГК. Карта вручную каждая позиция на опорной снимка (при Т = 0).
    1. Используйте "Руководство отслеживания" плагин в меню частиц Анализ и определить, нажав тяжести точку каждой клетки тела во время покадровой. Экспорт необработанных данных отслеживания в таблице.
  2. Реорганизовать экспортированные необработанные данные отслеживания из ImageJ с помощью смарт-домашней программы (http://primacen.fr, написанной в PHP кода), которые идентифицируют каждую клетку и соответствующие позиции. Используя программу, Calculatе общее пройденное расстояние и среднюю скорость миграции для каждой ячейки. Классифицировать и сравнить характеристики миграции клеток в контрольных и лечения условий, при соответствующих фильтров, использующих ту же программу.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В раннем послеродовом мозжечка, ГК демонстрируют существенные изменения в их режиме и скорости миграции, когда они пересекают различные слои коры 1 (рис 1). В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены путем изучения GC миграции в их естественной среде сотовой. P10 крысы ломтики мозжечковой ткани, меченные зеленым флуоресцентным красителем осматривают с помощью конфокальной Макроскоп (3А) и показано, что ГК мигрируют в радиальном направлении в ML со средней скоростью 18 мкм / ч (фиг.3В, С). На сегодняшний день, роль взаимодействий / коммуникации между нервных и глиальных клеток в том числе регулирующих факторов и молекулярных механизмов, участвующих в контроле клеточной миграции в каждом корковом слое являются в значительной степени неизвестными. Следовательно, главный вопрос заключается в определении нейропептиды, нейромедиаторы, нейротрофинов и компонентов внеклеточного матрикса, которые могли бы играть роль в этих коркового слоя-SPECIFIC изменения скорости во время их процесса миграции. Аденилатциклазу гипофиза активации полипептид (PACAP) обнаружен в основном в PCL, но также и в мл, а IGL в течение первых двух недель постнатального у грызунов 7,10,11. Применение PACAP38 (10 -6 М) в культуральную среду привело к 79% снижению скорости ГХ в ML. Например, скорость миграции ШС в ML снизилась с 11,9 мкм / ч в условиях контроля до 2,5 мкм / час после введения PACAP38 (4А). Тканевого типа активатор плазминогена (ТАП) представляет собой член протеолитическим каскадом, что приводит к деградации внеклеточного матрикса (EM) компонентов, таких как молекулы клеточной адгезии или ламинин 12,13. ТАП и плазминогена, ТАП субстрат, обнаружены в слоях коры в процессе развития послеродовой мозжечка 14,15,16. Администрация PAI-1 (10 -7 М), ингибитора эндогенного ТАП, снижается на 78% GCмиграция в ML. Например, ГК уменьшается скорость миграции в ML от 19,2 мкм / ч в условиях контроля до 4,2 мкм / ч после добавления PAI-1 (рис 4В). Эти результаты показывают, что PACAP оказывает непосредственное ингибирующее действие на движений GC и что серин-протеазы ТАП облегчает миграцию в ГК мл развивающегося мозжечка крыс.

figure-results-1
Рисунок 1: 3D представление GC миграции в послеродовом коры мозжечка. 1-4, Расширение ГК процессов и касательной миграции в EGL. 5, радиальные миграция в ML вместе Bergmann глиальных волокон. 6, Переходный стационарной фазы в PCL. 7, глиальных независимый радиальная миграция в IGL. 8, Завершение ГК миграции в IGL GC, ЗК, в красном, EGL., Внешний зернистый слой, B, Бергман глии, в темно-фиолетовый, G, Гольджи клеток, в желтом; ср, восхождение волокон, в голубой г, postmigratory зернистых клеток, в светло-зеленый; IGL, внутренний зернистый слой; MFT, моховой волокна Терминал, в темно-зеленый цвет; ML, молекулярного слоя, P Пуркинье клетки, в светло-фиолетовый; слоя клеток PCL, Пуркинье. Эта цифра была изменена с 5.

figure-results-2
Рисунок 2: Экс естественных культура P10 ломтиками мозжечка () расчлененный мозжечок от P10 крысы.. Масштаб бар = 6 мм. (Б) Микрофотографии живых 180 мкм толщиной мозжечка срез через стереомикроскопии. Масштаб бар = 3 мм. (Котвыше увеличение, четыре корковых слоев (EGL, ML, PCL ИГЛ) мозжечка уже различимы. Масштаб бар = 1 мм. (D) После флуоресцентного мечения, срезы тканей помещают на культуру вставок (диаметр 24 мм) в 6-луночный планшет. (Е) Схематическое представление культуры вставки с тканевой культуры обработанных полиэфирных мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Динамическая миграция ГК в слоях коры крыс P10 мозжечка () Macroconfocal вид (XYZ, 2D проекция) в Р10 крыс мозжечка срез, в котором ГК помечены зеленым флуоресцентным красителем цитоплазматической.. Масштабная линейка = 75 мкм. (Б) Покадровый изображений показывая GCдвижения в ML по конфокальной макроскопии в течение 4 часов в контрольных условиях. Звездочкой (*) символ отмечает GC сому. Прошедшее время (в мин) указывается в нижней части каждой микрофотографии. Масштабная линейка = 10 мкм. (С) Последовательные изменения в пройденное расстояние с помощью ГХ сомы.

figure-results-4
Рисунок 4:. Влияние нейропептида и ингибитора протеазы ГК миграции (А) ГХ отслеживается в ML с помощью конфокальной макроскопии в течение 2 ч в условиях контроля и затем в течение 2 ч в присутствии аденилатциклазу гипофиза активации полипептида (PACAP). (Б) ГХ отслеживается в ML с помощью конфокальной макроскопии в течение 2 ч в условиях контроля, а затем в течение 2 ч в присутствии ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1).

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает культуру острых P10 мозжечка крысы ломтиками в системе Transwell и флуоресцентного мечения GC с зеленым флуоресцентным красителем для изучения миграции клеток во время постнатального развития через конфокальной макроскопии. Этот протокол позволяет наблюдения миграции клеток на срок до 12 часов и тестирования возможных ролей регулирования факторы в миграции, включая агонисты или антагонисты нейропептидов, ингибиторы ферментов, клеточных сигнальных модуляторов или токсичных веществ во время эксперимента. Небольшое отверстие в мембранной вставкой с кончика пипетки необходимо упростить администрирование соединений в среде инкубации. Самодельные изогнутые пипетки могут быть использованы для облегчения доставки раствора.

Одна проблема миграции клеток исследований на живых срезах тканей является то, что движения самой ткани может сделать отслеживание трудно клеток. В то время как прежние подходы предложили мягко стабилизации SLICES с нейлоновой сеткой или тонкий слой коллагена хвоста крысы 7,17, основным преимуществом этой технологии является простой и прямой передача культуры пластины 6-а, содержащий мозжечка ломтики на мембранных вставками из СО 2 инкубаторе в цели конфокального Макроскоп. Контроллеры Интегрированная температуры и СО 2 также обеспечивают надлежащие и постоянные экологические параметры, необходимые для миграции клеток 9. Таким образом, условия культивирования хранятся при наблюдениях и движений тканей к минимуму, так как кусочки хорошо прикреплен к мембранной вставки. Стабилизация ткани проверяется следующее положение среза краев или клеток Пуркинье, которые должны быть зафиксированы ссылки во время сбора. Кроме того, мозжечка ломтиками (между 12 и 18), распределенных в 6 лунках планшета можно быстро наблюдается подробно с моторизованным этапе и оптическим зумом. Из-за большого рабочего расстояния (x2, 39 мм) в сухом цели, эпи-observation свободен от погружения и введения соединений в культуральной среде гораздо проще. Таким образом, экологические параметры и поддержки культуры сходства в СО 2 инкубаторе и конфокальной макроскопии привести к максимальному сохранению биологического образца.

Еще одним преимуществом протокола является большое поле зрения и, следовательно, большое количество ячеек, которые можно наблюдать одновременно. Например, мы уже определили, что плотность люминесцентных ГК с радиальным миграции в 1124 мл ± 138 клеток / мм 2 18. Конфокальной макроскопии (Х2, NA = 0,234) имеет нижний боковой разрешение по сравнению с конфокальной микроскопии (40х, NA = 1,25), но клетки тела ГК может быть легко отслеживаются и средняя скорость миграции сопоставимы между двух технологических подходов 7,18 ,

Кроме того, для технического совершенствования приобретений изображения, качество срезов тканей и гоE Качество маркировки являются ключевыми точками для успешных экспериментов. Всегда держите СМИ и тканей на льду во время вскрытия процессов, устранения нефть на vibratome лопаток и не использовать ломтики ткани в контакте с клеем. Сагиттальной и поперечные срезы приспособлены к радиальным и тангенциальным миграции соответственно. Использование различных длин инкубации в течение соответствующего обнаружения в различных слоях коры мозжечка. Длительное время инкубации (до 8 часов) необходимы для обнаружения миграции многочисленных ГК в PCL и IGL. С ГК миграция физиологический процесс в определенные пространственно-временных окон, положительный контроль является то, что клетки должны мигрировать должным образом. В частности, многочисленные шпинделя ГК в ML является одной из основной показатель здоровья для сагиттальной мозжечка ломтиками. Для запуска эксперименты, наблюдения движений GC в МЛ предложил. Действительно, форма GC с вертикально удлиненный корпус клеток следует рассматривать в качестве точки отсчета, чтобы начать переменногоприобрете- с последовательным контролем (2 ч) и лечения (2 ч) периоды, которые могут быть легко выполнены в ML.

Флуоресцентные красители, такие как семейства сотовый Tracker или флуоресцирующих белков, выраженных через генетических конструкций могут быть использованы в качестве индикаторов для миграции клеток исследований. Из-за медленной кинетике GC миграции (1 стека каждые 30 мин), многоцветные эксперименты также могут быть выполнены в последовательном режиме, так как 4 лазеров лучей (405, 488, 532 и 633 нм) доступны в системе. Учитывая центростремительной и центробежной радиальную миграцию, отслеживание других интернейронов также могут быть реализованы 18. В частности, за вычетом многочисленные типы клеток могут быть более легко локализованы с большим полем зрения. Наконец, этот протокол может быть использован для изучения миграции клеток на других этапах развития мозжечка, но и других областей мозга.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Институтом исследований и инноваций в биомедицине (IRIB), в ячейки изображения платформе Нормандии (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, Университета Руана, Европейского фонда регионального развития (ЕФРР - Перене, Интеррег 4А), ЛАРК-нейронаук Сеть и регионе Верхняя Нормандия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s модифицированная орлиная среда (DMEM) питательная смесь F-12Sigma-AldrichD8437
Сбалансированный раствор соли Хэнка 10xSigma-AldrichH1641
PACAP38INRS, КанадаBourgault et al., 200919
PAI-1Calbiochem528208
добавка N-2Fisher Scientific / Gibco/ invitrogenO973
Цианоакрилатный клейLoctite
Cell Tracker Green CMFDAInvitrogenC2925
Полиэстер Transwell-Clear вставкиCorning3452
Пенициллин-стрептомицинSigma-AldrichP0781
6-луночный кластер клеточных культурCorning3516
DMSOFisher ScientificBP231-100
Чашка для культуры тканей диаметром 35 ммBD Falcon353004
Чашка для культуры тканей диаметром 100 ммThermo SCIENTIFIC130182
Полипропиленовая трубка (15 мл)BD Falcon352096
этанол 70%Fisher ChemicalE/0800DF/21
Шкаф биологической безопасности вытяжной шкафThermo ScientificMSC9 Class II A2
Дозатор регулируемого объема (0,5-10 &; L)Гироскоп Eppendorf4910 000.018
инкубатор SSL3Stuart
CO2, микротом с вибрационным лезвием Hera Cell 150Thermo Scientific
, VT1000S конфокальныйLeica Microsystems
TCS LSILeica Microsystems
PeCon
CO2-контроллерPeCon
Стереомикроскоп, M205 CLeica Microsystems
Операционные ножницы, изогнутые, тупые/тупыеMedicon03.03.17
Закаленные ножницы тонкой радужной оболочки, прямые, острые/острыеFST149090-11
Дюмон #3 и #5 щипцыFST11293-00 и 11252-20
Лезвия инжектора Vibratome/однолезвийныеLeica Microsystems39053250
Стандартная рукоятка скальпеля #3 твердаяFST10003-12
Хирургическая клинка #15Swann-Morton205
, макроскоп , контроллер температуры

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
  2. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
  3. Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
  4. Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
  5. Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
  6. Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
  7. Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
  8. Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
  9. Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
  10. Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
  11. Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
  12. Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
  13. Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
  14. Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
  15. Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
  16. Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
  17. Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

imaging

Похожие статьи