Методическая статья

Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

DOI:

10.3791/52823

⸱

14 мая 2015 г.

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается метод генерации нейральных предшественников из эмбриональных стволовых клеток с использованием бессывороточного монослойного метода. Эти предшественники могут быть использованы для получения зрелых типов нейронных клеток или для изучения процесса нейронной спецификации и поддаются масштабированию в многолуночном формате для скрининга соединений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность различать мышиных эмбриональных стволовых клеток (ESC), чтобы нейронных клеток-предшественников позволяет изучение механизмов, контролирующих нейронной спецификации, а также генерацию зрелых нервных типов клеток для дальнейшего исследования. В этом протоколе мы опишем метод для дифференциации ESC на нейронных клеток-предшественников с использованием бессывороточной, однослойной культуры. Метод является масштабируемым, эффективным и приводит в производстве ~ 70% нервных клеток-предшественников в течение 4 - 6 дней. Это может быть применен к ESC от различных штаммов, выращенных в различных условиях. Нейронные предшественники могут быть разрешены, чтобы дифференцировать далее в функциональных нейронов и глии или анализировали с помощью микроскопии, проточной цитометрии или молекулярных методов. Процесс дифференциации поддается покадровой микроскопии и могут быть объединены с использованием репортерных линий для мониторинга нейронный процесс спецификации. Мы предоставляем подробные инструкции по подготовке СМИ и оптимизации плотности клеток, чтобы процесс бе применяться для большинства ЭСК линий и различных культур клеток сосудов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентные клетки, полученные из ранних эмбрионов со способностью размножаться неопределенно в пробирке при сохранении способности дифференцироваться во все типы клеток взрослого следующих реинтродукции в соответствующей стадии эмбриона (путем формирования химеру), инъекции в сингенных или иммунодефицитами (путем формирования тератомы) или в пробирке субъекта к соответствующим сигналам 1. Дифференциация в пробирке мышиных эмбриональных стволовых клеток в нервных линий была впервые описана в 1995 году и предусматривал формирование многоклеточных подвески агрегатов (эмбриональных органов, EBS) в сыворотке крови, содержащей среде с добавлением морфогена ретиноевой кислоты 2-4. С тех пор множество протоколов были разработаны, чтобы позволить нервной дифференциацию 5. Многие до сих пор используют агрегацию, другие совместного культивирования с индукции типов клеток и несколько включают использование сыворотки среде. Все протоколы имеют преимуществай недостатки и точный характер нервной или нейрональные клетки продуцировали также варьируется в зависимости от используемого протокола.

Идеальным протоколом будет надежная, масштабируемая и использовать в полной мере, определенных СМИ и субстратов, поддаваться неинвазивного мониторинга процесса дифференцировки и в результате генерации чистых популяций нервных клеток-предшественников, способных быть с рисунком внешних сигналов и дифференцировать во всех нейрональных и глиальных подтипов с высокой эффективностью и выходом за относительно короткое время. В последние двенадцать лет мы используем метод для генерации нейронных клеток-предшественников и нейроны от мыши ESC в низкой плотности, свободной от сыворотки приверженцем монослоя культуры 6-10. Этот протокол отвечает многим критериям, изложенным выше: в наших руках эффективность дифференциации была вполне согласуется в течение многих лет, и разнообразие клеточных линий, его можно масштабировать вверх или вниз (мы успешно использовать сосуды из 96-луночных планшетах с 15 см диаметр диShes) и средства массовой информации, используемые хорошо определены. Процесс поддается ИНТЕРВАЛ микроскопии для мониторинга и дифференциации различных паттерна сигналы могут быть добавлены, чтобы вызвать генерацию различных типов нейрональных подтипов (например, Shh и Fgf8 для дофаминергических нейронов 6).

Тем не менее, есть некоторые проблемы для успешного применения этого протокола. Одним из ключевых аспектов является тщательная подготовка средств массовой информации. Мы всегда подготовить СМИ в доме, несмотря на наличие коммерческих альтернатив. Один из добавок, используемых (N2, см Protocol) имеет модификации по сравнению со стандартной, коммерчески доступные версии. Наконец, один из самых важных шагов для успешного применения этого метода является оптимальная плотность клеток в обшивке. Это происходит главным образом из-за в то время как природа аутокринная одного из индуцирующих сигналов (Fgf4 11) требует, чтобы достаточные клетки присутствуют для оптимального viabilность и дифференциации, при слишком высокой плотности дифференциации ухудшается (возможно, частично из-за аутокринном производства LIF 12). Поэтому важно, что препарат обе среды и клеточной обшивки выполнены тщательно и последовательно, чтобы обеспечить оптимальные результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка СМИ

Примечание: Этот протокол основан на использовании смеси двух отдельных средств массовой информации: DMEM / F12, дополненной модифицированным N2 добавки и Neurobasal с добавлением B27 добавки, как правило, в соотношении 1: 1.

  1. Подготовка модифицированный N2 дополнение смешением компонентов в 15 мл пробирку. Не вихрь или фильтровать это; перемешать переворачивая пробирку, пока раствор не станет прозрачным.
    1. Начните с помощью пипетки 7,2 мл DMEM / F12, а затем добавить 1 мл 25 мг / мл инсулина (в 0,01 М HCl) и хорошо перемешать путем обращения трубку. Это займет пару минут, пока раствор не станет прозрачным.
    2. Добавить 1 мл 100 мг / мл апо-трансферрина (приготовлен в воде), 33 мкл 0,6 мг / мл progesternone (составленные в этаноле), 100 мкл 160 мг / мл (1 М) путресцина (приготовлен в воде ), 10 мкл 3 мМ селенита натрия (приготовлен в воде) и 666 мкл 7,5% бычьего сывороточного альбумина и смешать трубки хорошо. Алиготе в 2,5 мл и хранят при -20 °С в течение 2 месяцев.
  2. Подготовка информации.
    1. К 250 мл DMEM / F12 добавить 2,5 мл N2. Все хорошо перемешать, но не трясите фильтр.
    2. Для 250 мл Neurobasal СМИ добавить 5 мл B27 дополнения. Все хорошо перемешать, но не трясите фильтр.
    3. Смешайте СМИ от шагов 1.2.1 и 1.2.2 в соотношении 1: 1. В некоторых случаях 1: могут потребоваться 3 смесь (дополнено как смесь 1: 1 в шаге 1.2.4).
    4. К смеси добавляют 0,5 мл L-глутамина (конечная концентрация 0,2 мМ) и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (конечная концентрация 0,1 мМ) и хорошо перемешать без встряхивания. Храните носители при 4 ° С на срок до 3-х недель и не подвергать на свет. Это финальный микс называется N2B27.
  3. Подготовка раствора желатина.
    1. Приготовьте 1% раствора желатина в сверхчистой воде и автоклаве при 121 ° C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 15 мин. Важно, что бутылка для этого используется полностью очистить от моющих средств или дезинфицирующих средств, поэтому рекомендуется, что новый бутылкаДля этого используется и только когда-либо промыть в сверхчистой воды между использования. Алиготе 1% раствора в 50 мл аликвоты и хранить при температуре 4 ° С в течение месяца.
    2. Теплый аликвоту 1% желатина в водяной бане при 37 ° до полного растворения и добавить к 500 мл теплой фосфатно-солевом буфере (PBS). Все хорошо перемешать и пипетки достаточно, чтобы покрыть дно каждой лунки или пластины. Разрешить желатин, чтобы покрыть поверхность, по крайней мере 30 мин.

2. Покрытие клетки

Примечание: Этот протокол равной степени применимо к мыши ESC, выращенного в 10% сыворотки с ингибирующий лейкоз фактор (LIF), сыворотки замены LIF или бессывороточной среде с LIF и костного морфогенетического белка 4 (BMP4) или МЕК и GSK3 ингибиторов (2i сред) с или без LIF. Тем не менее, сроки и эффективность дифференциации может варьироваться в зависимости от носителя и клеток (см обсуждения). Для экспериментов, показанные здесь мы использовали линию 46C мыши ESC (который имеет репортер EGFP постучал в одной из эндогенных аллелей Sox1), выращивают в GMEM с 10% сыворотки и LIF. Для получения оптимальных результатов важно, чтобы клетки диссоциируют и пересевали в средствах массовой информации N2B27; простым изменением сред из GMEM / сыворотка / LIF, чтобы N2B27 всегда приводит к снижению эффективности дифференцировки по сравнению с replating клетки.

  1. Выращивают клетки в GMEM с 10% сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 1 несущественных аминокислот, 0,1 М 2-меркаптоэтанола и 100 ЕД / мл LIF 13. Чтобы получить субконфлюентные культуру мыши ESC, плиты 1 х 10 6 клеток в T25 культуры колбу, которая состоится 2 - 3 дней.
  2. Соблюдайте клетки под ярко-поле микроскопа. Когда клетки субконфлюентные и готовы к прохождению, промойте их в два раза PBS. Добавить 1 мл клеточной диссоциации реагента и возврата в инкубаторе в течение 2 - 5 мин. Несмотря на то, трипсин и другие ферменты также могут быть использованы для клеточной диссоциации, они могут оказать негативное влияние на прикрепление клеток, так плотность обшивки должны быть AdjuSTED.
  3. Как только клетки начинают поднимать от пластины, нажмите на судно, чтобы сместить их в суспензии отдельных клеток. Сбор клеток в общей сложности 10 мл средства массовой информации и диссоциации клеток реагентом и пипетки в 15 мл центрифужную пробирку.
  4. Спин клетки при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
  5. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл подогретого N2B27 пипетированием вверх и вниз 3 - 5 раз. При пипетки подвески вниз, пипетки к стенке трубки, чтобы избежать образования пузырьков. Граф клеток с автоматизированной счетчика клеток или гемоцитометре и записывать концентрацию.
  6. Приготовьте суспензию клеток, содержащий желаемое количество клеток на единицу объема, чтобы быть покрыты на лунку в подогретого N2B27. Плотность 10500 клеток на см 2 в чашке 6-луночный (т.е., 1 × 10 5 клеток на лунку в чашке с 6-а) является оптимальным. В Таблице 1 рекомендуемое количество клеток на см 2 и плаTing объемы средств массовой информации для различных клеточных культур судов.
  7. Аспирируйте желатин из культуральной судна и пластины клеточной суспензии в соответствии с предложенной плотности и объема в таблице 1. Не водоворот пластин, так как это будет сконцентрировать клетки к центру. Поместите культур во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
  8. Изменить СМИ каждые 1 - 2 дня, заменив все СМИ со свежими N2B27. Внесите мягко, как промывка клеток может повлиять на плотность и уменьшить эффективность дифференциации в последующие дни. Где начальная жизнеспособность после посева плохое, плиты клетки в 1: 3 смеси СМИ N2 и B27-дополненных и изменить это N2B27 после первых двух дней. Клетки начинают дифференцироваться и должны показать Sox1 выражение (видимый зеленой флуоресценции репортера в клеточной линии 46C используется здесь) в течение 4 - 6 дней.

3. Окрашивание Иммунофлуоресцентное

НЕТТЕ: Протокол может быть применен к любому типу резервуара. Объем каждого реагента описано на лунку 6-луночного планшета и можно масштабировать до любого площади поверхности. Replating не рекомендуется из-за низкой жизнеспособности после этого.

  1. Удалить дифференциации среды и фиксации клеток добавлением 500 мкл 4% (объем / объем) параформальдегида, оставить на 15 мин.
  2. Мытье и клетки проницаемыми с 2 мл PBS-T (фосфатным буферным раствором с 0,5% (об / об) Tween-20) в два раза. Клетки можно хранить в PBS-T в течение 2 месяцев при 4 ° С.
  3. Заменить PBS-T 1 мл PBS-T с 10% (об / об) сыворотки (от того же вида, что и вторичного антитела). Инкубируют 1 час на пластине качалке при комнатной температуре, чтобы блокировать любые неспецифическое связывание.
  4. После 1 часа, промыть клетки дважды по 2 мл PBS-T, и инкубируют в 500 мкл мышиного IgG против βIII-тубулина (разведенного 1: 1000 в PBS-T с 10% сыворотки). Положите на пластине рокера, и оставить O / N при 4 ° С.
  5. Из этой стадии всегда защитить судноот света. Промыть клетки дважды PBS-T, затем добавить 500 мкл флуоресцентно-меченного антитела против мышиного IgG антитела (разведенного до 2 мкг / мл в PBS-T с 10% сыворотки). Положите его на тарелку рокера в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Промыть клетки дважды PBS-T, затем добавить 500 мкл DAPI (разбавляют до 0,5 мкг / мл в PBS-T) и оставить на 5 мин.
  7. Вымойте клетки раз и держать их в PBS-T. Клетки готовы быть сфотографирован и может быть сохранена в течение 2 недель при 4 ° С. Обратите внимание, что GFP сигнал затухает с течением времени, так что неуместно сравнивать интенсивность GFP фиксированной и живых клеток или клеток фиксированных в разное время.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом эксперименте мы использовали клеточную линию 46C 14, мышиных эмбриональных стволовых клеток с эндогенным Sox1-GFP репортер, чтобы отслеживать нейронную дифференциацию. С помощью этой линии клеток, экспрессию Sox1, маркера нейронов предшественников, могут быть обнаружены с помощью зеленой флуоресценции. Покрытие плотность является критическим фактором для достижения дифференцировку нейронов. Мышиных эмбриональных стволовых клеток высевали в 6-луночный планшет при различных плотностях колеблется от 10500...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронная дифференциация протокол монослоя была в использовании на протяжении более десяти лет 6. Протокол является высокоэффективным, состоит из определенной среде, и сделано в системе однослойного что делает систему более применимой для доклинических (например, скрининг лекарств) использует. Тем не менее, есть некоторые критические факторы, определяющие эффективность дифференциации. Эта статья указывает те факторы и решение для каждого препятствия.

Плотность клеток посл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа финансировалась за счет стипендии Министерства образования Таиланда для W.W. и грантов от Tenovus и Anonymous Trust для M.P.S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies10270-106
DMEM/F12Life Technologies11320-074
Нейробазальная средаLife Technologies21103-049
Реагент диссоциации аккутазных клеток StemProLife TechnologiesA11105-01
B-27 Добавка, без сывороткиLife Technologies17504-044
ИнсулинSigmaI6634Восстанавливается стерильным 0,01 М HCl
Апо-трансферринSigmaT1147Восстанавливается стерильной водой
ПрогестеронSigmaP8783Восстанавливается с этанолом
ПутресцинSigmaP5780Восстанавливается стерильной водой
Селенит натрияSigmaS5261Восстановите стерильной водой
Фракция бычьего альбумина VLife Technologies15260-037
L-глютаминLife Technologies25030-081Перед использованием убедитесь, что он полностью растворен, так как глютамин обычно отсажен
ЖелатинSigmaG1890
6-луночная чашка для культуры тканейThermo Scientific140675
24-луночная чашка для культуры тканейThermo Научная142475
96-луночная чашка для культуры тканейThermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM Раствор заменимых аминокислотLife Technologies11140-050
Пируват натрияLife Technologies11360-070
2-меркаптоэтанолSigmaM7522
Ингибиторный фактор лейкемииприготовлен на месте, как в Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20SigmaP1379
4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI)SigmaD9542Защитить от света
Мышиный анти & бета; III тубулин антитело IgGCovanceMMS-435P
Флуоресцентно меченное антитело IgG к мышамLife TechnologiesA31571Защита от света
25 см<суп>2 колба для культуры тканейThermo Scientific156367

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP SOX1III

Похожие статьи