Method Article

Отслеживание наркотиков изменений, вызванных в рецептора после интернализации торговле от анализа Colocalizational

DOI:

10.3791/52824

⸱

July 3rd, 2015

 , 
1Department of Anesthesiology and Perioperative Care, University of California Irvine, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Department of Pharmacology, University of California Irvine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Торговля рецепторов модулирует сигнализации и клеток реагировать с лигандами и, непосредственно, в ответ на условиях клеток, включая лиганд-индуцированной сигнализации. Здесь мы описываем мощный и гибкий метод для количественного оценки оборота рецептора медикаментозного используя иммунноокрашивания и colocalizational анализ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутриклеточный трафик рецепторов представляет собой совокупность сложных и строго контролируемых процессов. Трафик рецепторов модулирует передачу сигналов и общую реакцию клеток на лиганды и сам по себе подвержен влиянию внутри- и внеклеточных условий, включая индуцированную лигандами передачу сигналов. Оптимизированный для использования с монослойными культивируемыми клетками, но расширяемый до свободно плавающих срезов ткани, этот протокол использует иммуномечение и колокализационный анализ для отслеживания изменений во внутриклеточном трафике рецепторов после как хронических/длительных, так и острых вмешательств, включая лечение экзогенными препаратами. После медикаментозного лечения клетки подвергаются двойному иммуномечению рецептора и маркеров внутриклеточных компартментов, представляющих интерес. Затем последовательная конфокальная микроскопия используется для получения двухканальных микрофотографий отдельных клеток, которые подвергаются компьютерному анализу колокализации для получения количественных оценок колокализации. Эти оценки нормализуются, чтобы обеспечить объединение независимых реплик до статистического анализа. Репрезентативные микрофотографии также могут быть обработаны для получения иллюстративных рисунков. В данной статье мы описываем мощную и гибкую методику количественной оценки индуцированного трафика рецепторов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рецепторы, особенно G-белком рецепторов (GPCR,), которые обычно продают внутриклеточно, и из клеточной поверхности 1. Эти сложно оркестровые и плотно контролируемые процессы диктуют доступные дополнения рецепторов клеток и регулировать рецептор временную активность, десенсибилизация и сенсибилизация 2 - 4. Важно отметить, что эти процессы реагируют на клеточных средах, включая активность рецепторов медикаментозного или бездействия. То есть, действия лигандов рецепторов в можете изменить внутриклеточный оборотом этих рецепторов, тем самым изменяя клеток реагировать. Таким образом, внешние лиганды оказывают еще больше эффектов на функции клеток, даже за пределами классической посланник-к-эффектора каскадов 5,6.

Рассматривая такие изменения в индуцированной торговли рецептора трудно. Все доступные методы включают ограничения. Анализы защиты Биотин были использованы для mõniTor поверхностных рецепторов населения. Эти рецепторы биотинилированный и timecourse из иммунопреципитации выполняется для количественного определения снижения биотинилированных рецепторов с течением времени. Эта методика по существу контролирует постепенной деградации начального, снабжены населения рецепторов 7, и это очень полезно при построении временное изменение этого процесса. К сожалению, этот анализ не может контролировать любой процесс, кроме деградации исходного пула рецепторов, таких как интернализации, рециркуляции или новых рецепторов. Кроме того, добавление антител в диапазоне 150kDa с рецептором в диапазоне 50kDa может изменить оборота рецептора 8,9, и этот метод может быть трудно использовать с низкими рецепторов уровня выражений.

Другие процедуры используют различные методы, чтобы определить внутриклеточные отсеки с торговлей людьми (например, Эндосомы, и т.д.) и оценить их колокализацию с рецепторами интерес. Это включает в себя СШАе гетерологичных системах, выражающих флуоресцентный белок-меченых химерных конструктов рецепторов и купейных маркеров (например, Раб-семейные GTPases). Это потенциально позволяет использовать визуализации живых клеток, удаляя вопросы, связанные с фиксацией и проницаемости. В то время как мощный, такая стратегия страдает от тех же ограничений гетерологичных систем в целом: TAG и уровень экспрессии эффектов на поведение и торговлей несовместимость с более физиологически представительных типов клеток. Более широко, красители используются для обозначения легко внутриклеточные отсеки (например, лизосомы, якобы) 10. Красители, однако, может не хватать специфичность (все кислые органелл случае красителей для лизосом) и не оценивают с торговлей через другие отсеки. Тем не менее, эти методы позволяют значительный контроль над системой и экспериментальных условиях и может извлечь выгоду из методов анализа колокализация представленных здесь ниже.

Метод же здесь присутствует уточняет отслеживание оборота рецепторов в колокализации. Использование иммуноцитохимии (МУС), чтобы маркировать соответствующие маркеры, можно определить несколько различных внутриклеточных отсеков. Это также позволяет использовать физиологически соответствующих первичных клеточных культур вместо гетерологичных системах. Этот протокол включает в себя МТП фиксации клеток процентов до маркировки; это позволяет маркировку на определенной временной точке после лечения (ов) лекарственного средства. Это производит «снимок» глобальной ассоциации рецептор-купе в то временной точке. С несколькими моменты времени, timecourse изменений с торговлей людьми также может быть построен.

Вкратце, клетки, обработанных лекарством, помечены для рецептора и внутриклеточное пространство интерес, конфокально отображаемого, и микрофотографии проанализированы математически количественно колокализацию рецептора и отсека 11. В нашем использования, мы рассмотрели колокализацию рецептора с Раb5, Rab11 и Лизосомные связанный мембранный белок 1 (LAMP1). Эти маркеры выявления ранних эндосом, эндосомы переработка и лизосом, соответственно. Эти меры колокализационные действовать в качестве прокси для всеобъемлющих процессов интернационализации, утилизации и деградации 12.

Как и со всеми методами, некоторые ограничения должны быть рассмотрены. В связи с необходимостью к изображению каждый отдельный нейрон анализируемого, эта методика может стать весьма трудоемким в зависимости от ряда условий и временных точках, участвующих. Все иммуномечение также должны бороться с последствиями на клеточном ультраструктуры, локализации белка и эпитопной доступности, вызванных фиксацией и проницаемости 13.

Хотя первоначально оптимизирован для использования с первичных культурах первичных сенсорных нейронов, этот метод широко совместимы с другими моделями монослойной культуры покрытием.

Использование математически количественно изме колокализации является, в частности,, гораздо более методологически строгими, чем предыдущие методы, используемые для оценки изменений с торговлей людьми рецепторов, которые часто полагались на смутных субъективных мер, таких, как визуально-контролируемых многоканальных наложений 14.

Этот метод особенно полезен для его широкой совместимостью с естественных вмешательств (до первичного поколения культуры) в интервенции в пробирке (во время роста культуры), а также различные маркировки цели 15. Как таковой, он может быть адаптирован к различным исследовательских вопросов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Этот протокол является широко совместимы с различными моделями монослойных покрытием клеток / тканевых культур, схемы лечения наркозависимости, и маркировки целей. Таким образом, в реальных условиях эксплуатации, многие конкретные параметры зависят от экспериментального проектирования. Вот ссылки на эти пользовательских параметров являются общими. Пример условия, а используются для получения репрезентативных результатов, которые выделены курсивом.

1. Решения

  1. Приготовьте промывочный буфер путем смешивания 0,1 М Трис-буферном гипертонической (300 мм) физиологического раствора и 0,05% полисорбат 20; рН 7,4 при комнатной температуре.
  2. Подготовка блокирующего буфера. Для 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) Солевой добавить 0,05% полисорбат 20, 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% холодной рыбьего желатина кожи и доведения рН до 7,4 при комнатной температуре.
  3. Подготовка антител в качестве разбавител добавлением 0,05% полисорбат 20, 1% БСА, 0,1% холодной рыбьего желатина кожи до 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) физиологического раствора и довести рН до 7,4 при 4 о С.
    Примечание: рН буфера трис зависит от температуры. То есть, изменение температуры будет изменить рН раствора. Для согласованности, эти буферы всегда должны быть отрегулированным рН при температуре, при которой они будут использоваться.

2. Культура клеток

Примечание: Соответствующие протоколы клеточной культуры будет варьироваться в зависимости от типа (ов), используемого клеток. Эти процедуры должны быть отдельно оптимизирован. Подробные методики культивирования клеток легко доступны, в том числе 16 лет. Аналогичная процедура была использована для получения репрезентативных результатов, с заметные различия:

  1. Культура, спинных нейронов из взрослых животных, как описано 12. Используйте для взрослых нейронов среду роста культуры клеток. Уменьшение плотности клеток глии от перед металлизацией, чем глутамат. Это приводит к смешанной нейрон-глиальных культуры, выращенной на покровные стекла 12-круглых по крайней мере 30-60 нейронов на чашку и сопровождающих глиальных клеток выращивали до approximatЭли 40% слияния. Следует отметить, что нейроны в первичной культуре не будет копировать и будет выталкиваться от пластины с помощью совместно культивировали глии, если глии могут расти слишком. Для того чтобы избежать воздействия на нейроны, физическое уменьшение числа глиальных предпочтительнее химических / фармакологических методов.
    Примечание: Для целей настоящего Протокола, мы предполагаем, что клетки интерес вырос до их экспериментально-желаемое состояние и монослой покрытием. Мы считаем, что покрытие на стеклянных покровных 12-тур в 24-луночных планшетах наиболее удобным. Все объемы и процедуры, описанные являются подходящими для одного покровное в одну лунку 24-луночного планшета.

3. наркологическая культивируемых клеток

Примечание: Несколько последовательный или перекрытие, медикаментозное лечение возможно. Препаратов, дозы / концентрации и продолжительности воздействия используемых будет зависеть от конкретного эксперимента.

  1. Удалить оригинальный среду роста 16 и заменить его среде, содержащей препарат (ы) интерес при выбранной концентрации (ов). В этом случае используют 10 мкМ морфина растворяют в физиологическом растворе или физиологическом растворе используют в качестве контроля.
    Примечание: Важно, чтобы каждый независимый повторной (как правило, одна культура 24-луночный планшет) содержат одинаковое общее условие управления. Это позволит нормализации данных через повторов, которая исправляет для взаимного суда изменчивости.
  2. Инкубируйте клетки в первоначально условиях роста 16 в течение 48 часов.
  3. Для последующих процедур наркотиков, повторите шаги 3.1 и 3.2 с дельторфина 1 мкМ, SNC80 1 мкм, или транспортное средство и инкубировать в течение 60 мин 12. Солюбилизации дельторфина II в воде и солюбилизации SNC80 в 10 мМ в 40 мкм HCl и разрушать ультразвуком, разбавленного до 1 мМ в воде.
    Примечание: Этот протокол предполагает препарат (ы) были солюбилизированного таким образом, что они могут быть растворены в нужной концентрации (ы) в выбранной среде роста. Соответствующие процедуры длянапример солюбилизации может изменяться в зависимости от препарата в вопросе и должен быть отдельно оптимизирован.
  4. Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку. Выполнение каждой промывки осторожно аспирации жидкости из скважины, затем быстро и аккуратно, заправки и свежим раствором, по желанию (в данном случае с промывочным буфером).

4. Фиксация и Иммуноцитохимия

Примечание: Конкретные цели маркировки будет зависеть от эксперимента. В нашем использования, мы пометили дельта опиоидные рецепторы (DOR) и Rab5, Раб 11, и LAMP1, как описано. Специфические антитела использовали будет зависеть от конкретного эксперимента. Оптимальные условия маркировки зависит от конкретного антитела (страны), используемые. Гораздо полнее обсуждение этой темы находится ниже.

  1. Фиксации клеток путем погружения в ~ 300 мкл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-буферном солевом растворе в течение 10 мин при 37 ° С.
    Примечание: Важно, чтобы 4% параформальдегида быть свежеприготовленным из-за флуоресценции, вызванного использованием ранее замороженных параформальдегида.
  2. Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
  3. Инкубируйте клетки в 300 мкл блокирующего буфера в течение 2 ч при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте клетки с первичными антителами в 300 мкл антител разбавителем в течение 48 ч при температуре 4 ° С. В нашем использования, первичные антитела против ДОР (кролик анти-Дор) и один из: Rab5 (мышиное анти-Rab5), Раб 11 (мышь анти-Rab11), и ЛАМПА1 (козий анти-ЛАМПА1).
  5. Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
  6. Инкубируйте клетки с вторичными антителами, конъюгированными с различными флуорофоров (см обсуждение ниже) в 300 мкл антител разбавителем в течение 1 часа при комнатной температуре. В этом и всех последующих шагов, защищают клетки от действия света. Для получения репрезентативных результатов, используйте зеленый излучающих флуорофора-сопряженных анти-кролик и eithэр красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-мыши или красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-козел.
  7. Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
  8. Удалить 12-раундовом покровные из 24-луночных планшетах, оставив ~ 1 мл промывочного буфера в каждую лунку, планшет на ~ 45º, а рычаг покровное прочь также полу с помощью тонких щипцов. Покровное будет упираться в стену скважины, откуда легко можно удалить с помощью пинцета.
  9. Установите покровные, сотовый стороной вниз, на микроскопа слайды с анти-выцветания монтажную среду.

5. Микроскоп Настройки

  1. Использование высокого увеличения объектива (100X), сначала найдите на представительный ячейку быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
  2. Настройте параметры съемки изображения для записи 8-разрядных несжатых TIFF изображения каждой надписью канала (для обнаружения каждого флуорофора, используемого, например, 488 нм, и 594 нм), к изображению каждый канал последовательно (либо строки или кадра), и в среднем от 4 до 6 сканов для конечного изображения. Оптимальное разрешение изображения будет микроскоп конкретных, но 1024 x 1024, как правило, дает хорошие результаты.
  3. Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки.
  4. Оптимизация микроотверстий (обычно 1 блок Эри), мощность лазера, и фотоэлектронный умножитель напряжения (коэффициент усиления) и смещения для каждого канала. Сохранение / запись этих параметров. Используйте те же настройки микроскопа для визуализации всех клеток меченых для любой целевой пары в то же репликации.
    Примечание: Этот процесс, как правило, привести к достаточно фотовыцветания, что эта клетка не должна быть отображены для анализа.

6. изображений

  1. Использование высокого увеличения цели (например, 100X), сначала найдите ячейку, чтобы быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
  2. Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки. Яе доступно, использование программного обеспечения зум / культура ограничить область сканирования в ячейки интерес.
  3. Захват изображения для каждого канала с надписью, используя настройки ранее установленных. Повторите шаги 6.1 до 6.3 до изображения 15 или более клеток в состоянии за репликации для обеспечения достаточного образца.

7. Анализ колокализации

  1. Откройте пару изображений (например, "зеленый" и "красный") из ячейки в ImageJ. Используйте изображение> Цвет> Объединить каналы ... Команда для создания RGB изображение.
  2. Нарисуйте выделение вокруг клетки интерес. Используйте ImageJ плагин "PSC колокализации" (11; доступный от https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) количественно колокализации целей в выбранной ячейке.
  3. Запишите нужную колокализации меру (как правило, г Пирсона 17). Повторите этапы от 7,1 до 7,3 для каждого отображаемого клетки.

8. Нормализация данных

  1. Рассчитайте среднее записанных значений колокализации общих условиях управления каждой репликации каждого состояния маркировки.
    Примечание: Например, среднее из значений колокализации нейронов в "48-часовой автомобиля, 60-мин транспортное средство" состояние лекарственного средства в каждой из 3-х независимых повторностей в каждой из 3-х условиях маркировка (рецептор, и каждый из 3-х отсеков).
  2. Умножение средства от (-1), чтобы получить смещение для каждого репликации в каждом условии маркировки. Добавить смещение для каждого повторить в каждом маркировки состоянии каждому значению колокализации в этой репликации.
    Примечание: Это нормализовать данные так, чтобы среднее колокализация мерой общего состояния управления равно 0 в каждой повторности каждого условия маркировки.
  3. Бассейн данные из всех повторов каждого условия маркировки.
    Примечание: Изменения в колокализации теперь могут быть проанализированы по повторах. Статистические анальныйлиз будет зависеть от экспериментального дизайна, но, как правило, связаны анализ-дисперсионного (ANOVA) с последующим соответствующих испытаний после специальных (например, Тьюки). Для статистических ресурсов, смотри, например, 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя эту технику, можно количественно изменения в рецептора торговли после интернализации следующие обе хронические / длительная и острых медикаментозное лечение. После медикаментозного лечения, фиксации и маркировки, с высоким разрешением двухканальные микрофотографии захвачены в каждой ячейке интерес. Типичные изображения могут быть объединены с неправильным цветом колокализации генерировать иллюстративные фигуры (рисунок 1). После colocalizational анализ, как описано, выход количественный множес...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы оптимизировали этот протокол для анализа первичных культурах взрослых заднекорешковых ганглиев (первичные сенсорные нейроны). Она также может быть использован, практически без изменений, за монослойных покрытием широко культивируемых клеток. Colocalizational анализ можно также в срезах тканей и других подобных препаратов 11, однако компоненты лечения наркозависимости и тканей фиксация / подготовка не будет необходимости.

Интересно, что методы ICC, представленные здесь, также мо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом CIHR (MOP394808) и Канада заведующая кафедрой в CMCEWO был получателем стипендии последипломного из NSERC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma BaseSigma AldrichT1503-500G
Sodium ChlorideSigma AldrichS9888-500G
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Соляная кислотаSigma Aldrich258148
альбумин из бычьей сывороткиSigma AldrichA7906-100G
Желатин из холодноводных рыб кожаSigma AldrichG7041-100G
Corning Costar Cell Culture Планшеты: 24-луночныйFisher Scientific720084
12 кругов Микроскоп Крышка СтеклоFisher Scientific1254580
Aqua/Poly-MountPolysciences18606-20
Одноосновной фосфатнатрия Sigma AldrichS9638-500G
Натрий Фосфат двухосновнойSigma AldrichS9763-500G
ПараформальдегидPolysciences00380-1
Щипцы Dumont #5 - Standard/DumoxelFine Science Tools11251-30
Антитело кролика против DORMyBioSourceMBS316175использовано в соотношении 1:1,500
Антитело мыши против Rab5Sigma AldrichR7904Использовано в соотношении 1:750
Мышиное антитело против Rab11Millipore05-853Использовано в 1:500
Козье антитело против LAMP1Santa CruzSC8098Использовано в 1:750
Осело против кролика Alexa 488 конъюгированное антителоLife TechnologiesA-21206Использовано в 1:200 до 1:2,000
Козье анти-мышиное Alexa 594 конъюгированное антителоLife TechnologiesA-11005Использовано в 1:200 до 1:2,000
Ослик против козы Alexa 594 конъюгированное антителоLife TechnologiesA-11058Использовано в диапазоне от 1:200 до 1:2,000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
  2. Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
  3. Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
  4. Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25(2011).
  5. Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
  6. Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
  7. Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
  8. Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
  9. Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
  10. He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
  11. French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
  12. Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  14. Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
  15. Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54(2010).
  16. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
  17. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  18. Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
  19. Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22(2010).
  20. Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
  21. The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
  22. Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
  23. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor TraffickingColocalization AnalysisConfocal MicroscopyDrug TreatmentImmunolabelingIntracellular CompartmentsQuantitative AnalysisSequential ImagingDelta Opioid ReceptorRecycling Endosomes

Related Articles