Методическая статья

Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52827

⸱

15 сентября 2015 г.

 , 
1Department of Biology, Concordia University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предназначен для извлечения и концентрирования белка и ДНК из микробной биомассы, собранной из морской воды, с последующим получением триптических пептидов, подходящих для протеомного анализа на основе тандемной масс-спектрометрии.

Аннотация

Мета-омические технологии, такие как метагеномика, метатранскриптомика и метапротеомика, могут помочь в понимании структуры микробного сообщества и метаболизма. Несмотря на свою мощь, метагеномика сама по себе может пролить свет только на функциональный потенциал. С другой стороны, метапротеомика позволяет описать экспрессируемый in situ метаболизм и функцию сообщества. Здесь мы опишем протокол лизиса клеток, выделения белков и ДНК, а также расщепления пептидов и экстракции из морских микробных клеток, собранных на картриджной фильтрующей установке (например, фильтрующей установке Sterivex) и сохраненных в растворе для стабилизации РНК (например, RNAlater). В исследованиях протеомики, основанных на масс-спектрометрии, идентификация пептидов и белков выполняется путем сравнения масс-спектров пептидных тандемов с базой данных транслируемых нуклеотидных последовательностей. Включение метагенома образца в поисковую базу данных увеличивает количество пептидов и белков, которые могут быть идентифицированы по масс-спектрам. Следовательно, в этом протоколе ДНК выделяется из того же фильтра, который впоследствии может быть использован для метагеномного анализа.

Введение

Микроорганизмы вездесущи и играют существенную роль в биогеохимических циклах Земли 1. В настоящее время существует множество подходов молекулярной доступные для характеристики структуры микробного сообщества и функции. Наиболее распространенным является анализ гена 16S рРНК ПЦР-амплифицировали из ДНК окружающей среды 2 - 4. Недостатком анализа генов 16S рРНК, что это только предоставляет информацию о филогенетического идентичности и структуры сообществ, с мало информации о метаболической функции. В отличие от этого, подходов, таких как метагеномика, metatranscriptomics и metaproteomics предоставить информацию о структуре и метаболизме сообщества. Метагеномика, или анализ содержания генов в сборке организмов, дает информацию о структуре и функциональным возможностям сообщества 5 - 8. Несмотря на то, мощный, это функциональный потенциал может не соответствовать метаболическихДеятельность организмов. Генотип организма представлена ​​его генов, каждый из которых может быть транскрибируется в РНК и затем переведены на белок, в результате чего фенотип. Таким образом, чтобы помочь в понимании микробной функциональной активности в среде, после геномный анализ должен быть выполнен 9. Metatranscriptomics или анализ РНК-транскриптов является полезным, поскольку он показывает, какие гены транскрибируются в любой среде. Тем не менее, уровни мРНК не всегда совпадают соответствующие их уровни белка за счет поступательного регулирования, РНК полураспада, и в том, что несколько белков копии могут быть сформированы для каждого мРНК 10.

По этим причинам metaproteomics в настоящее время признается в качестве важного инструмента для микробиологии окружающей среды. Общие metaproteomic анализирует использовать дробовик протеомный подход, при котором рядом с полным комплектом белков в комплексе образца очищают и проанализированы одновременно, как правило, через анzymatic пищеварения в пептиды и анализа на масс-спектрометре. После тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) "пептид отпечатков пальцев" используется для определения пептидную последовательность и потенциальную белок происхождения по базе данных белков поиск (для обзора см 11). Протеомный работа долгий путь за последние 25 лет благодаря увеличению доступности данных геномной и увеличения чувствительности и точности масс-спектрометров, позволяющих идентификации белков с высокой пропускной и количественного 11,12. Так белки конечный продукт экспрессии гена, metaproteomic данные могут помочь определить, какие организмы являются активными в любой среде, и какие белки они выражают. Это выгодно, когда пытаются определить, как конкретный набор параметров окружающей среды влияет на фенотип организма или сообщества. Ранее, МС / МС на основе metaproteomic исследования в океане были использованы для выявления специфических белков в целевыхмикробные клоны, с первого исследования, посвященного света приводом протонного насоса proteorhodopsin в SAR11 морских бактерий. 13 Совсем недавно, сравнительные анализы metaproteomic выяснены дифференциальные паттерны экспрессии белка между сложными сообществами. Примеры включают в себя идентификацию временных сдвигов в обмене веществ в прибрежной Северо-Западного Атлантического океана 14 или Антарктического полуострова 5. Другие исследования описаны изменения в белковых паттернов экспрессии по пространственных масштабах, например, вдоль географического разреза от низкой питательной океана круговорота в высокопроизводительной системе прибрежного апвеллинга 15. Для дальнейших обзоров metaproteomics мы рекомендуем Шнайдер и др. (2010) 9 и Уильямс и др. (2014) 16. Целевые протеомики также использованы в последние годы для количественного экспрессии специфических метаболических путей в среде 17,18.

Therе три основные фазы в metaproteomic анализа. Первый этап подготовки образца, который включает в себя взятие проб, лизис клеток и концентрации белка. Сбор образцов в морской микробиологии часто влечет за собой фильтрацию морской воды через предварительный фильтр для удаления более крупных эукариотических клеток, частиц и частиц-ассоциированных бактерий, с последующей фильтрацией для захвата свободных живой микробных клеток, обычно с использованием картриджа 0,22 мкм Фильтрующий блок 19,20. Эти фильтры incased в пластиковом цилиндре и лизис клеток и протокол экстракции белка, который может быть выполнен в блоке фильтров будет ценным инструментом. После биомасса получена, клетки лизируют необходимо для обеспечения извлечения белка. Могут быть использованы различные способы, в том числе гуанидин-HCl лизиса 21 и натрия додецилсульфата (SDS) основе методов лизиса. Несмотря на то, моющие средства, такие как SDS являются очень эффективными на срыв мембраны и растворении многих типов белковых, КонцентрацONS цене 0,1% может помешать с выходным пищеварения белков и анализа MS 22. Серьезную озабоченность является негативное воздействие на SDS трипсина эффективности пищеварения, разрешающая способность обратной фазы жидкостной хроматографии и подавления ионов или накопления внутри источника ионов 23.

Вторая фаза фракционирования и анализ, в котором белки подвергают ферментативному расщеплению с последующим анализом ЖХ МС / МС, в результате чего AM / г структуры фрагментации, который может использоваться, чтобы установить первичный аминокислотную последовательность начальной трипсином пептида. Различные методы пищеварения могут быть выполнены в зависимости от типов используемых моющих средств, а также вниз по течению процесса массового спектрометрии. В нашем протокола, 1-D электрофореза PAGE с последующим удалением SDS из геля используется для удаления любых загрязнений моющего средства. Анализ белков, которые трудно растворить, например, мембранные белки, требует использования высокой концентратраций SDS или других моющих средств. Это приводит к проблемам совместимости с SDS-электрофореза в геле. Если цель исследования требует солюбилизации эти трудно растворить белки, система трубки-гель может быть использован 22,24. Способ трубки-гель включает белки в матрице геля без использования электрофореза. Впоследствии любые моющие средства, используемые для растворения удаляются перед переваривания белков.

Третий этап является биоинформатики анализ. На этом этапе данные пептидные MS / MS ищутся в базе данных переведенных нуклеотидных последовательностей для определения пептиды и белки присутствуют в образце. Идентификация пептидов зависит от базы данных оно искали против. Морские metaproteomic данные обычно искали с базами данных, состоящих из опорных геномов, метагеномных данных, таких как Global Ocean Sampling наборе 25, а также одноклеточные усиливается геномов из необработанной Lineages 26,27. Белки также идентификацию может быть увеличена за счет включения в метагеномных последовательностей из того же образца, как metaproteomic данные были получены 5.

Здесь мы предлагаем протокол для генерации пептидов, пригодных для МС / МС анализа на основе биомассы из микробных собирали фильтрованием и хранящихся в растворе стабилизации РНК. Протокол, описанный здесь, обеспечивает ДНК и белка, которые будут выделены из того же образца, так что все шаги, ведущей к белку и осадки ДНК идентичны. С практической точки зрения, менее фильтрации требуется, так как только один фильтр необходим для белка и экстракции ДНК. Мы также хотели бы отметить, что этот протокол был создан благодаря сочетанию, адаптации и модификации двух ранее опубликованных протоколов. Шаги лизиса клеток адаптированы из Саито и соавт. (2011) 28 и трипсина в геле переварить компонент приспособлен от ShevcheНКО и др. (2007) 29.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовьте Реагенты

  1. Подготовьте SDS-экстракционного раствора: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА и 1% SDS. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при 4 ° С.
  2. Подготовка акции реагенты, необходимые для полиакриламидном геле.
    1. Готовят 1,5 М Трис-НСl рН 8,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
    2. 0,5 М Трис-НСl рН 6,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
    3. Подготовка 10% SDS. Фильтр стерилизуют, используя фильтр и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
  3. Готовят растворы, необходимые для в геле трипсина переварить и добычи пептидов.
    1. Подготовьте 100 мМ бикарбоната аммония. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при 4 ° С.
    2. Подготовьте 1 м DTT запасов. Суспендировали в 100 мМ бикарбоната аммония и хранить при температуре -80 ° С.
    3. Подготовьте 550 мм иодацетамидом запасов. Подвесные в100 мМ бикарбоната аммония и хранить при температуре -80 ° C.
    4. Подготовьте 100 нг / мкл трипсина запасов. Аликвоты по 60 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° С.
    5. Подготовьте экстракционного раствора: 1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила.
    6. Готовят раствор ресуспендирования: 5% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты.

2. Выполните лизиса клеток в картридж фильтра блока с ячейками сохранились в РНК стабилизации решения

  1. Извергните стабилизации РНК раствор из блока фильтра картриджа (1,5 мл) и в 2 мл микроцентрифужных трубки с использованием 60 мл шприц, прикрепленный на Луера конце фильтра.
  2. Центрифуга микроцентрифужную пробирку 2 мл в течение 10 мин при 17000 х г для осаждения клеточного дебриса любой. Это делается для того, что фильтр в шаге 2.3 не закупоривает.
  3. Перевести супернатант в 10 К ultracentrifugal блока фильтра, чтобы захватить любые белки, происходящие из клеток, которые лизированных от замерзания / THAW образца. Не выбрасывайте осадок. Он будет использоваться в шаге 2.5. Выполните центрифугирование ultracentrifugal фильтрующего блока в 3270 мкг в течение 30 мин или до объема сократилось до примерно 600 мкл.
  4. Растопить кончик наконечника p10 и блокировать без сторону Луера блока фильтров патрон с открытым концом наконечника. Это будет гарантировать, что ни экстракционного буфера и биомасса не ускользает во время шагов 2,5-2,7.
  5. Приостановить осадок в 1 мл SDS-экстракционного раствора и пипеткой его в исходное блока фильтра картриджа. Самый простой способ пипетки в блок фильтра картридж укладывать чаевые P200 на кончике P1000 и использовать этот двойной наконечник для пипетки.
  6. Добавить 1 мл раствора SDS к экстракции блока фильтра картриджа так, общий объем составл ет примерно 2 мл и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре при вращении в гибридизации печи. Поместите 3 мятой лаборатории салфетки в нижней части 50 мл коническую пробирку. Парафильм оба конца блока фильтров Картридж закрытыи поставить блок фильтра картридж в 50 мл трубки. Закройте крышкой и поставить трубу в гибридизации духовке.
  7. После 10 мин месте Sterivex фильтр на поплавок пены и закрепите его на месте с 5 мл шприц на Луера конца. Поплавок и инкубировать в 95 ° C на водяной бане в течение 15 мин.
  8. Пусть блок фильтра картриджа круто поворачивать и при комнатной температуре в течение 1 часа (как на шаге 2.6).
  9. Выгнать SDS экстракционный раствор / клеточный лизат из фильтра с 60 мл шприца в то же ultracentrifugal блока фильтров, как и раньше (шаг 2.3). Добавить 1 мл свежей SDS экстракционного раствора с блоком фильтра картриджа и перемешивают в течение 30 сек вручную, а затем вытеснить в ultracentrifugal блока фильтров с использованием шприца 60 мл. Это для полоскания устройство патронный фильтр, чтобы обеспечить все белки были удалены.
  10. Выполнение центрифугирования на ultracentrifugal фильтрующего устройства в течение 45 мин при 3270 х г или до объема в блоке фильтров меньше 600 мкл,
  11. Отменить проточный и долейте ultracentrifugal блок фильтра свежим раствором SDS-экстракции.
  12. Центрифуга блок фильтра еще 45 мин при 3270 х г.
  13. Повторите шаги 2.11 и 2.12 раза больше. Обеспечить конечного объема в ultracentrifugal блока фильтра составляет не более 600 мкл на конце окончательного отжима.
  14. В этот момент, разделить на две части концентрата. Одну фракцию будет использоваться для осаждения ДНК, а другой для осаждения белка.
    Примечание: Количество фракционирования зависит от количества биомассы, которую затем фильтруют и предполагаемое использование продуктов. В нашем случае, мы разделили концентрата с 10% по отношению к осадков ДНК и 90% по отношению к осаждения белка.

3. Белки Осадки

  1. Добавить 4 объема метанола и ацетона (50:50) к одному объему концентрата и вихря в течение 10 сек. Инкубируют в течение ночи при -20 ° С.
  2. Спин вниз при 17000 мкг в течение 30 мин. Слейте супернатанти пусть осадок (может быть невидимым) в сухом виде в SpeedVac в течение 1 часа (или до сухой).
    Примечание: Не более сухой осадок, как это может сделать это трудно ресуспендирования.
  3. Приостановить осадок в 25 мкл SDS-экстракционного раствора. Дайте настояться в течение одного часа, затем ресуспендируют с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Количественно белок с использованием набора для анализа белка и инструкциям производителя.

4. ДНК Осадки

  1. Добавить в SDS-экстракционного раствора с фракцией концентрата, которые будут использоваться для осаждения ДНК, пока 500 мкл метки. Этот шаг просто увеличить объем раствора, что делает его легче работать.
  2. Добавить 0,583 объемы осаждения белков реагента (например, как MPC белка осадков реагента) и вихря в течение 10 сек. Вы должны увидеть белый осадок форму.
    Примечание: Мы также использовали фенол: хлороформ методы выделения ДНК, но это труднее из-за низких объемов. Мы получили лучшие выходы ДНК с использованиемПДК белка Осадки Реагент.
  3. Центрифуга при 17000 х г и 4 ° С в течение 10 мин.
  4. Перевести супернатант в другую 1,5 мл микроцентрифужных пробирку и добавляют 0,95 объемов изопропанола. Обратить 30-40 раз.
  5. Центрифуга в течение 10 мин при 4 ° С при максимальной скорости.
  6. Тщательно сцедить и отбросить супернатант.
  7. Промыть два раза с 750 мкл 70% этанола.
  8. Удалить столько этанола, как это возможно с помощью пипетки, то пусть воздушно-сухой.
    Примечание: Не более сухой ДНК, так как это может сделать это трудно ресуспендирования.
  9. Ресуспендируют в 25 мкл ТЕ-буфера низкой, рН 8 (10 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА).
  10. Количественная ДНК с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК и инструкции производителей. Выполнение агарозном геле (1%) электрофореза на 3 мкл ДНК, чтобы проверить его качество.

5. SDS-PAGE гель белков

  1. Подготовка образца буфера (950 мкл буфера Лэммли образца и 50 мкл β-меркаптоэтанол).
  2. Добавьте соответствующий объем для 15 мкг белка, или макс 20 мкл на равном объеме буфера для образца и варить в течение 4 мин. Образцы теперь могут быть хранили при -80 ° С до SDS-PAGE не может быть выполнена.
  3. Подготовка 10% акриламида разрешающую гель с 5% акриламида концентрирующего геля.
  4. Загрузка гель с образцами и 4 мкл белка лестницы. Бегите гель при постоянном 120 V до 250 кДа лестничной маркера только достиг разрешающую гель.
  5. Пятно гель с помощью Кумасси пятно основе в соответствии с инструкциями изготовителя.

6. В-гель Трипсин Дайджест и пептида Добыча

Примечание: Все шаги отсюда до 6.10 выполнены в кабинете биологической безопасности для минимизации загрязнения.

  1. Отрежьте лишний гель под 10 кДа лестничной знак для каждой полосы. Каждая дорожка будут проанализированы на MS / MS отдельно. Разрежьте каждый переулок в 1 мм х 1 мм квадратов для увеличения площади поверхности и поместите все squaРез из переулка в низкой связывания микро-трубки центрифуги. Повторите эту процедуру для всех полос. (1% уксусной кислоты может быть использован для предотвращения гель от высыхания и становится трудно вырезать).
    Примечание: Сведение к минимуму загрязнений важно на этом этапе, так гель нарезки выполняется в кабинете биологической безопасности на стеклянной SDS-PAGE гель формы, используемой, чтобы гель.
  2. Де-пятно
    1. Разлить по 50 мкл 100 мМ бикарбоната аммония в каждую низкого связывания трубки, рядом крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Аспирируйте и выбросить 150 мкл.
    4. Повторите шаги 6.2.1 и 6.2.2.
    5. Аспирируйте и отбросить 95 мкл.
  3. Обезвоживание
    1. Разлить 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышку и подождите 5 мин. Аспирируйте и отбросить 45 мкл и ждать 10 мин.
  4. Сокращение
    1. Разлить по 50 мкл DTT (10 мМ, разбавленного в 100 мМ АММониевая бикарбонат), недалеко колпачок и ждать 30 мин при 37 ° С.
  5. Алкилирование
    1. Разлить по 50 мкл иодацетамида (55 мм, разбавленный в 100 мМ бикарбоната аммония), близкий колпачок и ждать 20 мин при 37 ° С.
    2. Распределить 100 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Аспирируйте и выбросить 195 мкл.
  6. Мыть
    1. Разлить по 50 мкл бикарбонат аммония, близко колпачок и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте и выбросить 120 мкл.
  7. Обезвоживание
    1. Разлить 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышку и подождите 5 мин. Аспирируйте и отбросить 45 мкл.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, подождите 5 мин.
    3. Аспирируйте и отбросить 75 мкл и ждать 5 мин.
  8. Пищеварение
    1. Разлить 25-30 мкл 6 нг / мкл трипсина (иntil все фрагменты гель покрыты). Закрыть колпачок и ждать 30 минут при комнатной температуре.
    2. Выдержите в течение ночи (4,5 ч минимум) при 37 ° С.
    3. Пусть сидят при комнатной температуре в течение 30 мин.
  9. Добыча и пептид Трансфер
    1. Разлить 30 мкл экстракционного раствора и накройте крышкой в ​​течение 30 мин на льду.
    2. Аспирируйте 30 мкл и обойтись атмосферный объем в новом надписью низкой связывания трубки.
    3. Разлить 12 мкл экстракционного раствора и 12 мкл ацетонитрила в исходное трубы (с гелем). Закрыть колпачок и инкубировать в течение 30 мин на льду.
    4. Аспирируйте 15 мкл и внести в новую пробирку.
    5. Повторите шаги (6.9.3 и 6.9.4).
  10. Поместите новые трубы в SpeedVac до сухой.
  11. Ресуспендируют в 50 мкл раствора ресуспендирования. Вихревой на среде в течение 10 мин для ресуспендирования.
  12. Пипетка пептидный раствор в любой нано / LC флаконах или 96-луночных планшетах, пригодных для нано / LCMS / MS работа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве демонстрации, мы провели протокол на двух пробах морской воды, собранных с поверхности и хлорофилла максимум прибрежных районах океана в Северной Канаде. В то время как в море, 6-7 л морской воды, пропускали через GF / D префильтр 3 мкм, а затем микробные клетки собирали на единицу патронный фильтр 0,22 мкм в соответствии с протоколом Уолша и др., 20. Клетки немедленно сохраняются в стабилизации раствора РНК до дальнейшей обработки. По возвращении в лабораторию, мы провели протокол, как эт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Образец сохранение является ключом к metaproteomic исследований и предыдущая работа показала, что раствор стабилизации РНК является полезным буфер хранения для хранения клеток до извлечения белка 28. В идеале, образцы будут сохранены на месте, чтобы свести на нет изменения в экспрессии белка во время обработки 33,34. На самом деле, на месте были разработаны для отбора проб и фиксации технологии, которые позволяют автономного сбора и сохранения образцов на корабле развернуты инстру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Маркосу Ди Фалько за его опыт и советы по подготовке образцов для нано-ЖК МС/МС, а также доктору Зорану Миничу из Университета Реджайны за анализ ЖХ МС/МС. Эта работа была поддержана финансированием NSERC (DG402214-2011) и CRC (950-221184). Округ Колумбия был поддержан Институтом воды, энергетики и устойчивых систем Concordia и FQRNT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sterivex -GP 0.22 μ m фильтрующий блокMilliporeSVGP01050Sampling
RNAlater Stabilization SolutionAmbionAM7021Sampling
Tris Bio Basic77-86-1 или TB0196-500GЭкстракция белка/ SDS PAGE гель
DTTSigma-AldrichD0632-1GЭкстракция белка
SDSBio Basic15-21-3Экстракция белка/ SDS PAGE гель
EDTABio Basic6381-92-6Экстракция белка
ГлицеринFisher Scientific56-81-5Экстракция белка
10K Amicon ФильтрMilliporeUFC801024Экстракция белка
МетанолSigma-Aldrich179337-4LПреципитация белка
АцетонFisher Scientific67-64-1Преципитация белка
MPC Реагент для осаждения белкаEpicentermmP03750Осаждение ДНК
2-пропанолFisher Scientific67-63-0Осаждение ДНК
Набор для анализа Qubit dsDNA BRLife TechnologiesQ32850Набор для количественного определения ДНК
Набор для анализа белкаLife TechnologiesQ33211Набор для количественного определения белка
SucroseBio Basic57-50-1SDS PAGE гель
TEMEDBio Rad161-0800SDS PAGE гель
APSBio Rad161-0700SDS PAGE гель
30% АкриламидBio Rad161-0158SDS PAGE гель
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060SDS PAGE гель
GlycineBio Rad161-0718SDS PAGE гель
B-меркаптоэтанолBio Basic60-24-2SDS PAGE гель
Laemmli Sample BufferBio Rad161-0737SDS PAGE гель
Precision Plus Protein Калейдоскоп LadderBio Rad161-0375EDUSDS PAGE гель
АцетонитрилVWRCABDH6044-4In-gel Трипсин дайджест
NH4HCO3Bio Basic1066-33-7In-gel Trypsin digest
DTTSigma-AldrichD0632-1GIn-gel Trypsin digest
Муравьиная кислотаSigma-AldrichF0507-500MLIn-gel Trypsin digest
ВЭЖХ класса H2OSigma-Aldrich270733-4LIn-gel Trypsin digest
IodoacetamideBio Basic144-48-9In-gel Trypsin
TrypsinPromegaV5111In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1,5 млEppendorf22431081In-gel Trypsin digest
2 мл ROBO флакон 9 ммCandian Life ScienceVT009/C395SBВ-гелевый дайджест трипсина
Вкладыш из полипропилена BM, без пружиныCandian Life Science4025P-631В геле Трипсин дайджест
digest

Ссылки

  1. Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
  2. El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
  3. Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
  4. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972(1986).
  5. Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
  6. Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
  7. Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
  8. Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
  9. Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
  10. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  11. Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
  12. Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
  13. Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
  14. Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
  15. Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
  16. Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
  17. Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
  18. Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
  19. Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
  20. Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
  21. Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
  22. Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
  23. Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
  24. Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
  25. Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77(2007).
  26. Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
  27. Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  28. Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215(2011).
  29. Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
  30. Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).
  31. Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
  32. Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
  33. Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
  34. Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи