Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки Кишечная палочка Для кожи тканевой инженерии

Краткое содержание

Рекомбинантные технологии позволили разработчикам материалов создавать новые искусственные белки с настраиваемыми функциональными возможностями для применения в тканевой инженерии. Например, искусственные белки внеклеточного матрикса могут быть спроектированы таким образом, чтобы включать структурные и биологические домены, полученные из нативных ECM. Здесь мы описываем построение и очистку белков aECM, содержащих эластин-подобные повторы.

Аннотация

Рекомбинантная технология — это универсальная платформа для создания новых искусственных белков с настраиваемыми свойствами. За последнее десятилетие было зарегистрировано множество искусственных белков, которые включали в себя функциональные домены, полученные из природы (или созданные заново). В частности, были разработаны белки искусственного внеклеточного матрикса (ВКМ); эти белки aECM состоят из биологических доменов, взятых из фибронектина, ламининов и коллагенов, и объединены со структурными доменами, включая эластиноподобные повторы, шелковые и коллагеновые повторы. На сегодняшний день белки aECM широко исследуются для применения в тканевой инженерии и заживлении ран. Недавно Тджин и его коллеги разработали интегрин-специфичные белки aECM, предназначенные для стимулирования прикрепления и размножения кератиноцитов кожи человека. В их работе белки aECM включают клеточно-связывающие домены, взятые из фибронектина, ламинина-5 и коллагена IV, а также фланкирующие эластин-подобные повторы. Они продемонстрировали, что белки aECM, разработанные в их работе, являются многообещающими кандидатами для использования в качестве субстратов в искусственной коже. В этой статье мы описываем конструкцию и конструкцию таких белков aECM, а также процесс их очистки с использованием термочувствительных характеристик эластина.

Введение

В течение нескольких десятилетий как синтетические, так и природные материалы изучались для использования в качестве каркасов в тканевой инженерии^1,2. В то время как синтетические материалы, такие как полимеры, обладают превосходной структурной целостностью и настраиваемыми механическими свойствами, они часто обладают недостаточной биологической активностью для стимулирования роста и инфильтрации тканей. С другой стороны, природные материалы, такие как белки внеклеточного матрикса (ECM), обладают отличной биологической активностью, но имеют ограничения, такие как вариабельность от партии к партии, быстрая деградация и проблемы иммуногенности. Таким образом, рекомбинантные белки являются желательными, поскольку они могут быть сконструированы таким образом, чтобы имитировать только желательные свойства нативных белков^3,4.

Инженерия рекомбинантных белков вызвала широкий интерес как универсальная платформа для разработки и производства новых биополимеров искусственных белков. Контролируя генетическую последовательность, функциональные возможности искусственных белков могут быть адаптированы для широкого^{спектра применений}. В частности, белки искусственного внеклеточного матрикса (aECM) могут быть адаптированы таким образом, чтобы иметь множество функциональных возможностей для применения в тканевой инженерии, регенерации и заживлении ран^2,7. Что еще более важно, достижения в технологиях клонирования и очистки значительно повысили масштабируемость и значительно снизили стоимость производства рекомбинантных белков. Возможно получение большого количества рекомбинантных белков при низких производственных затратах, которые экономически выгодны для использования в клинике⁵.

Искусственные белки внеклеточного матрикса были разработаны для применения в тканевой инженерии^8-11. Например, Tirrell et al. разработали сосудистый трансплантат малого диаметра с использованием искусственных белков, содержащих последовательность фибронектина CS5 и эластиноподобные повторы (ELP-CS5). Они показали, что эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) способны адгезивоваться и расти на этих материалах¹². Другие также включили короткие биологически активные последовательности, взятые из фибронектина, коллагена, ламинина, фибриногена и витронектина, а также структурные домены, которые имитируют эластин, паучий шелк и коллаген для создания различных^{гибридных белков}. Объемные сшитые пленки, изготовленные из белков aECM на основе эластина, также проявляли механические свойства, сходные с механическими свойствами нативного эластина (модули упругости колеблются в пределах 0,3-0,6 МПа)¹³. Впоследствии, как сообщалось, белки aECM, содержащие более длинные фрагменты фибронектина, также ускоряют заживление ран in vitro из-за повышенного сродства связывания с интегринами⁸.

Недавно Тджин^{и его коллеги} разработали интегрин-специфичные искусственные белки ECM. Каждый белок aECM содержит биоактивный клеточно-связывающий домен, взятый из компонентов ECM нативной кожи человека^2,7,15, таких как ламинин-5, коллаген-IV и фибронектин. Например, было показано, что интегрин α₃Β₁ связывается с последовательностью PPFLMLLKGSTR, обнаруженной в глобулярном домене 3 (LG3) альфа-3 цепи ламинина-5 (LG3)^16,17. В своем отчете они показали, что первичные эпидермальные кератиноциты кожи человека преимущественно взаимодействуют с различными интегринами для связывания с каждым из белков aECM, в зависимости от типа присутствующего клеточного связывающего домена.

Белки aECM, обсуждаемые в работе Tjin et al., содержат фланкирующие эластин-подобные домены {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈, которые придают эластичность, имитирующую механические свойства человеческой кожи. Кроме того, включение остатков лизина в эластиноподобные повторы также увеличивает общую растворимость белка в водных растворителях. Кроме того, остатки лизина также служат сайтами сшивки для облегчения формирования сшитых пленок aECM¹². Включение эластиноподобных повторов в белковую последовательность aECM позволяет легко очищать белки с помощью обратного переходного цикла (ITC)¹⁴. Эластины претерпевают резкий и обратимый фазовый переход при определенной температуре, известной как нижняя критическая температура раствора (LCST) или обратная температура перехода (T_t)^18-20. Эластины и эластиноподобные повторы принимают гидрофильные случайные спиральные конформации ниже LCST и становятся растворимыми в воде, в то время как выше LCST эластины быстро агрегируются в частицы микронного размера. Такие фазовые переходы являются обратимыми и, следовательно, могут быть использованы для обеспечения легкой очистки белков aECM на основе эластина с помощью метода^{ITC 21}.

В этой работе мы сообщаем об обобщенной процедуре проектирования, конструирования и очистки искусственных белков ECM, содержащих биоактивные клеточно-связывающие домены, слитые с эластиноподобными повторами. Описан процесс конструирования и клонирования плазмид, которые кодируют аминокислотные последовательности белков aECM. Описаны шаги, необходимые для очистки белков aECM с помощью ITC. Наконец, обсуждаются методы определения чистоты белков aECM, полученных с помощью электрофореза SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Протокол

1. Клонирование рекомбинантных плазмид, кодирующих белки aECM

1. Дизайн аминокислотную последовательность функционального домена (например, клеток-связывающий домен и эластин-подобных повторов). Ограничение Дизайн сайтов фланговые концы функциональных областей, чтобы облегчить к югу от клонирования с помощью бесплатного программного обеспечения в соответствии с инструкциями программного обеспечения (например, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Здесь выбирать уникальные сайты рестрикции, которых нет в функциональном домене ограничить пищеварение, предназначенных для сайтов. Выберите сайты рестрикции, которые появляются в сайт множественного клонирования (MCS) принимающей вектора (например, pET22b (+)) к югу от клонирования.
2. Обратный перевод последовательность аминокислот в последовательности нуклеотидов с использованием бесплатные сайты в соответствии с инструкциями программного обеспечения. (Например, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Обеспечить кодоны оптимизированы для E. палочки хозяева.
3. Джин интерес может быть контрактаред коммерчески как одноцепочечные олигонуклеотиды (т.е., если олигонуклеотиды <100 пар оснований (п.о.)) и выполнить отжиг ДНК (см шаг 1,4), чтобы уменьшить стоимость. В противном случае, для генов больше, чем 100 б.п., они могут быть приобретены через коммерческие компании.
4. ДНК отжига олигонуклеотидов
   1. Отжиг олигомеры ДНК с получением желаемого последовательность гена. Растворите ДНК-олигонуклеотидов в буфере олигомера ДНК (10 мМ Трис-2-амино-2- (гидроксиметил) пропан-1,3-диол, рН 8,0, фильтруют) до конечной концентрации 1 мкг / мкл.
   2. Добавить 4 мкл каждого олигомера с 32 мкл буфера для отжига ДНК (10 мМ Трис, 100 мМ NaCl и 100 нм MgCl ₂₎ для достижения общей 40 мкл смеси.
   3. Отварить стакан воды, используя конфорку и погрузиться смесь в течение 5 мин, 95 ° С. Снимите стакан и постепенно охладить весь набор в пенопластовый ящик O / N. Олигомеры были отжигают и готовы для пищеварения.
5. Добавить соответствующие ферменты рестрикции, чтобы переварить Отожженном олигомеры (т.е., называют вставкой) и хост-вектор (т.е., pET22b (+)) отдельно. Используйте следующий рецепт (1-2 мкг ДНК, 2 мкл каждого фермента рестрикции, 5 мкл 10x фермента рестрикции буфера, и вода до 50 мкл общего смеси) для 3-4 ч при 37 ° С.
   Примечание: pET22b (+) плазмидный вектор является ампициллина устойчивыми к антибиотикам, и содержит 6x-His метку в С-конце. 6x-тег Его присутствует в pET22b (+) позволяет использовать его с метками антител для выявления белка-мишени с помощью вестерн-блоттинга в шаге 7.
6. Добавить 6x красителем каждой обрабатываемой смеси. Запуск переваривания смеси отдельно в том числе лестницы ДНК на 1,2% агарозном геле, содержащем ДНК УФ-флуоресцентным красителем ДНК в течение 1 ч при 100 В. визуализировать 1,2% агарозном геле ДНК с УФ осветитель.
7. Нарежьте гель для извлечения переваривается продукты ДНК, используя коммерческий гель наборы очистки. Elutе с использованием минимального объема для столбца для достижения минимальной концентрации ДНК 50-100 нг / мкл.
8. Смешайте интерес ген последовательно путем лигирования вставки расщепленной ДНК (т.е., эластин или клеточные повторы связывающие домены, полученные путем отжига ДНК) в плазмидный вектор с использованием лигазы Т4 с использованием следующей рецепт: (2 мкл вектора, 1 мкл Т4-лигазы, 1,5 мкл буфера для лигирования Т4, X мкл вставки, 10,5 х мкл воды в течение всего 15 мкл смеси). Инкубируйте лигирования смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
   Примечание: молярная концентрация вектора вставки должны быть изменены, чтобы оптимизировать эффективность лигирования. Объем вставки описывается как х в рецепте зависит от концентрации элюированного ДНК из стадии 1.7.
9. Оттепель Е. палочка DH5 & химически компетентные клетки (или любой клонирование деформации) на льду. Теплый агаром 2xYT (Таблица 1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) до 37 ° С.
10. Трансформации клеток, используятеплового шока:
    1. Аликвоты 50 мкл компетентных клеток в чистую, предварительно охлажденной микро-центрифужные пробирки. Пипетка 5 мкл (от 100 пг до 100 нг) смеси лигировани в клетки, пипетки осторожно вверх и вниз, чтобы перемешать. Оставьте смесь на льду в течение 20 мин.
    2. Опустить микро-центрифужной пробирки, содержащей смесь клеток в водяной бане при 42 ° С в течение 2 мин и возвращается на льду в течение 2 мин. Время продолжительности погружения, чтобы минимизировать ущерб тепла в клетках.
    3. Добавить 500 мкл SOC информации (таблица 1) в микро-центрифужную пробирку и инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 1 ч.
    4. Распространение 50 500 мкл клеток / лигирования смеси на чашку с агаром 2xYT, который был предварительно нагревают до комнатной температуры, содержащей ампициллин (25 мкг / мл) и инкубируют пластины вверх-вниз при температуре 37 ° CO / N (12-16 ч) ,
11. На следующий день, забрать колонии ДНК из агар пластины с использованием чистых наконечников. Выращивают колонии в 5 мл 2 х УТ среды (табл1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) O / N при 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании (225 оборотов в минуту).
12. На следующий день использовать набор для выделения плазмидной для извлечения плазмиды ДНК каждой колонии выбрал в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с 50 мкл воды.
13. Выполнение испытаний переварить с помощью ферментов рестрикции следующий рецепт: (5 мкл ДНК, 0,2 мкл каждого фермента рестрикции, 1 мкл 10х буфера ограничение фермента и долить воды на общую 10 мкл смеси), инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С для экрана для колоний, которые, вероятно, содержат вставку и работать на 1.2% агарозном геле ДНК, как в шаге 1.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пищеварения, успешно перевязки должны Результаты в двух диапазонах, по одному для вектора и вставки, которые соответствуют их соответствующей молекулярной массой (рис 1).
14. Отправить вероятные колонии для секвенирования ДНК с использованием Т7 промотор прямого и обратного праймеров для коммерческих секвенсоров.

2. Трансформация рекомбинантной плазмиды в бактериальной экспрессии хозяина

1. Из результата секвенирования, выберите колонию, которая была успешно лигированный и использовать плазмиды ДНК для трансформации в E. палочка хозяин экспрессии.
2. Оттепель Е. Штамм выражение (BL21 (DE3) pLysS) на льду. Между тем, теплые агаром, содержащих ампициллин (25 мкг / мл) и хлорамфеникол (34 мкг / мл) до комнатной температуры.
   Примечание: pLysS плазмиду присутствуют в бактерий штамма BL21 (DE3) pLysS содержит ген устойчивости к хлорамфениколу. PLysS плазмида содержит ген репрессора Т7, которые конститутивно экспрессируется на ограничение вытекающей экспрессию белка aECM. Хлорамфеникол необходимо выбрать для клеток бактерий, который содержит pLysS во культуры.
3. Повторите шаг 1.10, чтобы получить превращается Е. палочки клетки, которые готовы высказать искусственные белки. Оберните агаром в парафильмом и хранить в перевернутом в 4 6 С в течение до одного месяца.

3. Бактериальные Выражение aECM белков

1. На рисунке 2, выбрать колонию из трансформированной агаром с кончика пипетки и инокуляции в 10 мл стерильной Terrific Broth (ТБ) сред (таблица 1), содержащий как ампициллин и хлорамфеникол антибиотики в пробирке. Выдержите эту закваски на 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании на 225 оборотов в минуту.
2. Передача 10 мл стартовой культуры в 1 л свежей и стерильных средах ТБ с добавлением тех же антибиотиков в колбу Эрленмейера 3 л. Инкубируйте культуру при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение 2-3 ч и наблюдать оптической плотности культуры (OD ₆₀₀₎ достиг 0,6-0,8 с помощью пипетки 1 мл культуры в пустую кювету для чтения. Сохранить 1 мл культуры перед индукцией по SDS-PAGE характеристики.
   1. Для измерения OD ₆₀₀ клеточной культуры, подготовить 1 флакон СМИ туберкулезом в кюветедля пустой измерения. Отдельно передачи 1 мл культуры из культуральной колбы в новую пустую кювету. Измерение оптической плотности культуры с использованием спектрофотометра по отношению к пустой контроль при поглощении 600 нм.
   2. Сохранить образец (для последующего анализа SDS-PAGE) путем переноса 1 мл образца культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, центрифуге при 12000 х г в течение 2 мин, и декантируют супернатант.
3. Индуцируют культуру изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и инкубируют при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение еще 4 ч. Сохранить 1 мл культуры в конце индукции в течение 4 ч SDS-PAGE характеристики.
4. Сбора клеток путем переноса культуры до 1 л бутылок и центрифуги центрифуге при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, вес ячейки гранул и ресуспендируют в TEN буфера (1 М Трис, 0,01 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, рН = 8,0) при 0,5 г / мл.

4. Лизис бактериальных культур

1. Замораживание ресуспендировали культуру клеток при -80 ° CO / N. Разморозить замороженную культуру клеток в водяной бане при комнатной температуре или на льду, чтобы лизировать клетки. Добавить 10 мкг / мл Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы I), 10 мкг / мл рибонуклеазы А (РНКазы I), и 50 мкг / мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в то время оттаивания и гомогенизации раствора при медленном перемешивании.
2. После того как все ресуспендировали Клетки оттаивают, регулировать рН раствора до 9,0, чтобы увеличить растворимость белка в воде ^12. Добавить 6 N NaOH по каплям при перемешивании на льду, чтобы достичь однородной консистенции. Lyse ультразвуковой нарушения в течение 20 мин на льду с использованием диаметром 2 мм плоский наконечник, 5 сек импульс.
3. Центрифуга клеток раствора при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Передача супернатант на чистую, пустую бутылку и хранят при температуре 4 ° С для очистки позже.
4. Между тем, снова ресуспендируют осадок клеток с TEN буфера и повторного замораживания при -80 ° С. ВПолный лизис клеток, повторите замораживания / оттаивания и ультразвуком процесс до трех раз. Сэкономьте 20 мкл лизата клеток для SDS-PAGE характеристики.

5. Очистка aECM белков, используя обратный переход Велоспорт

1. Подборка клеточного лизата из стадии 4.3, и приступить к очистке белков aECM используя МТЦ, аналогичный тому, который используется для очистки эластина основе белков ^21. Циклы будет сделано с разных температурах, которые 4 ° С (упоминается как "холодный") и 37 ° C (именуемые "теплых") циклов соответственно.
2. Разделение клеточного лизата в 50 мл центрифужные флаконы и центрифугируют при 40000 х г в течение 2 ч при 4 ° С. Появление осадка клеток должны быть темно-коричневого цвета и выглядеть насморк.
3. Удалить супернатант с помощью пипетки, чтобы получить четкое разделение от осадка. Собирают супернатант в чистые бутылки центрифуги и добавить NaCl до конечной концентрации 1 M (максимум 3 м). Теплыйраствора до 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 225 оборотах в минуту.
   Примечание: Добавление NaCl вызовет переход эластина компонента, вызывающего агрегирование aECM. Супернатант станет мутным. Если концентрация белка достаточно высоко, белый пенистый белок можно увидеть по бокам бутылки центрифуги.
4. Центрифуга супернатант из шага 5.3 при 40000 х г в течение 2 ч при 37 ° С. Декантировать супернатант. Измельчите таблетку с помощью металлического шпателя и ресуспендируют осадок биты в ледяной автоклавного дистиллированной воде (50 мг / мл) при энергичном перемешивании O / N при 4 ° С с использованием магнитной мешалкой и пластину. Осадок должен быть полностью растворен.
5. Повторите этапы 5,2 до 5,4 в течение еще трех до пяти раз, чтобы получить более высокую чистоту белка.
6. После последнего цикла очистки, обессоливания раствора белка диализом его против дистиллированной воды при 4 ° С. Диализировать белкового раствора от воды в течение 2-3 дней с изменениями в воде каждый 4ч или 8 ч в течение O / N. Сохранить 20 мкл очищенного белка на SDS-PAGE и лиофилизации остаток очищенного белка и хранить при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.

6. Характеристика aECM белков, используя SDS-PAGE Электрофорез

1. Приготовьте 12% геля ДСН-ПААГ (если молекулярная масса велика, используют 8% ПААГ с ДСН для лучшего разделения). Добавить 2x SDS загрузки буфера для каждого образца, нагрева образцов в течение 10 мин при 100 ° С и запустить образцы на геле в течение 1 ч при 100 V или пока белок лестницы, соответствующих молекулярной массе белка aECM не достигнет середины гель.
2. Получение геля с ДСН-ПААГ, созданной и добавить кумасси бриллиантовый синий краситель (таблица 2) с объемом, чтобы погрузить гель в течение 1 часа в чашке Петри. Промыть гель в растворе Обесцвечивание (таблица 2) в течение 5 мин на качалке. Изменение Обесцвечивание раствора и продолжают destain гель с не-качалка до фоне тон гель становится ясно. Белковые полосы должны быть четко видны.
3. Сравнение позиции целевого белка против белка лестницы, чтобы определить молекулярную массу белка-мишени.
4. Чтобы дополнительно подтвердить наличие целевого белка, вестерн-блоттинга выполнения, как и в шаге 7.

7. Характеристика aECM белков, используя Вестерн-блоттинга

1. Запуск образцов на 12% SDS-PAGE геля, в разделе 6, без окрашивания.
2. Сокращение нитроцеллюлозную мембрану с размером, слегка превышающим геля ДСН-ПААГ. Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги того же размера.
3. Влажные один кусок фильтровальной бумаги с западного переноса буфера (20% об / об метанол, 25 мМ Трис, 190 мМ глицина, рН 8,3), поместить гель SDS-PAGE на верхней части фильтровальной бумаги, а затем еще один кусок фильтровальной бумаги , то нитроцеллюлозные мембраны, а окончательный другие два куска фильтровальной бумаги. Убедитесь, вся настройка погружен с достаточной западной буфера передачи.
   Примечание: гель и мембрана не должна находиться в контакте в данный момент времени, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
4. Передача белки на нитроцеллюлозную мембрану путем размещения двух фильтровальную бумагу в западной полусухого устройства передачи, после чего нитроцеллюлозной мембране, и тщательно поместить гель SDS-PAGE в пределах и на мембране, наконец, место два последних влажную фильтровальную бумагу на SDS-PAGE гель. Запустите западный перенос на 45 мА, 30 мин. Добавить буфер, если напряжение выше 30 В.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно размещать гель SDS-PAGE на мембране с одной попытки и избежать перехода гель излишне на мембране, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
5. Получение и блокировать нитроцеллюлозную мембрану с блокирующем растворе (5% обезжиренное молоко в PBS, рН 7,4, фильтруют через фильтровальную бумагу) в течение 2 ч при комнатной температуре. Утилизировать блокирующий буфер и добавьте PBS полоскать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на новые перчатки, чтобы избежать загрязнения мембраны с нежелательной защдюймы
6. Выдержите основной анти-антитела с Его разведения в PBS 1: 1000 при комнатной температуре в течение 1 часа с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 1000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 999 мкл PBS в течение 1 мл общей смеси.
7. Промыть мембрану с 5 мл PBST (PBS с 0,1% Tween 20).
8. Инкубируйте с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) с разбавлением в PBS в соотношении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 ч с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 5000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 4999 мкл PBS в течение 5 мл общей смеси.
9. Промыть мембрану 5 мл PBST и повторить два раза.
10. Применение хемилюминесцентного субстрата с мембраной с объемом, чтобы покрыть мембрану и инкубируют в соответствии с инструкциями для используемого субстрата.
    Примечание: чувствительности субстрата к обнаружению белка может изменяться, мы рекомендуем подложку с максимальной чувствительности при очень низких сигналов в случае повышения концентрации антител не приводит к увеличению сигналы.
11. Захват хемилюминесцентные сигналов с использованием тепловизора на основе ПЗС-камеры. Отрегулируйте соотношение первичного и вторичного разбавления антитела, если сигналы слабы и неспецифичны. Выдержите больше в блокировании решения, если сигнал фона высока.

Результаты

При проектировании слитые белки, содержащие эластин, как повторы, важно поддерживать общее содержание эластина, достаточно большую долю слитого белка ^18. Это делается для того, что слитый белок конструкция сохраняет свои эластина, как характеристики, чтобы использовать для очистки ITC. AECM белки дизайн и последовательности, описанные в этом разделе, были специально взяты из работы по Tjin др. ^14. В этой работе, три aECM белки были успешно клонированы в pET22b (+) вектора экспрессии. После...

Обсуждение

Рекомбинантный белок инженерных универсальный метод для создания новых белковых материалов с использованием восходящего подхода. Материалы на основе белка могут быть разработаны, чтобы иметь несколько функций, с учетом существующих в применении интерес. В связи с увеличением продвижения в клонирования и экспрессии белка технологий, стало относительно просто (и экономически эффективным), чтобы создать различные искусственные белки, воспроизводимым и масштабируемым образом. Эластин-подобный домен был включен в ряде искусс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 векторы экспрессии с резистентностью к ампициллину
BL21(DE3)pLysS	Инвитроген	С6060-03	дополнительные антибиотики - хлорамфеникол
изопропил-бета-D-тиогалактозид (ИПТГ)	Голд Биотехнология	I2481C	1 М стоковый раствор с автоклавной водой, сделать свежим перед индукцией.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	набор для выделения плазмид
T4 лигаза	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Хлорамфеникол	Affymetrix	23660
Zymoclean™ гель набор для восстановления ДНК	Zymo Research	D4001
XL10-gold штамм	Agilent Technologies	200315