Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Живая съемка в эпендимных ресничек боковых желудочков головного мозга мыши

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52853

⸱

1 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Life Sciences Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical & Pharmaceutical Sciences, Chapman University, School of Pharmacy, Rinker Health Science campus

В этой статье

Краткое содержание

Использование высокого разрешения дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии, экс естественных условиях наблюдение избиения подвижных ресничек эпендимных расположенном в желудочки головного мозга мыши демонстрируют живого изображения. Методика позволяет запись уникальной частотой цилиарного размола и угол бил, а также их внутриклеточный кальций свойства колебаний стимуляции.

Аннотация

Multiciliated эпендимные клетки выстилают желудочки во взрослом мозге. Нарушение функции или структуры эпендимных ресничек связана с различными неврологическими дефицита. Тока экс естественных условиях живут изображений подвижных ресничек эпендимных техники позволяет для детального изучения динамики цилиарных после нескольких шагов. Эти шаги включают в себя: мыши эвтаназии диоксидом углерода в соответствии с протоколами университета Уходу за животными Толедо и использование комитета (IACUC); удаление фрагментов костей черепа с последующим удалением головного мозга и сагиттальном вскрытия головного мозга с vibratome или острым лезвием, чтобы получить очень тонкие срезы через боковые желудочки головного мозга, где эпендимных реснички могут быть визуализированы. Инкубация ломтиками мозга в индивидуальных стеклянным дном пластины, содержащие модифицированные Игла среды (DMEM) / High-глюкоза Дульбекко при 37 ° С в присутствии 95% / 5% O 2 / CO 2 смеси важно, чтобы ткань живых в течениеэксперимент. Видео ресничек избиения затем записываются с использованием высокого разрешения дифференциального интерференционного контрастного микроскопа. Видео затем анализируют кадр за кадром, чтобы вычислить частоту цилиарного биение. Это позволяет отличный классификацию эпендимных клеток в трех видов или категорий в зависимости от их частоты мерцательная избиения и угла. Кроме того, этот метод позволяет использовать высокоскоростной анализа флуоресцентной томографии для характеристики уникальные внутриклеточные колебаний кальция свойства эпендимных клеток, а также влияния фармакологических агентов на колебания кальция и частоту цилиарного избиение. Кроме того, этот метод подходит для иммунофлуоресценции изображений для структуры цилиарного и локализации белка мерцательная исследований. Это особенно важно в диагностике болезни и фенотипа исследований. Основным ограничением методики связано с уменьшением в живом подвижных ресничек, как движения ткани мозга начинает умирать.

Введение

Реснички сенсорные микротрубочек на основе органеллы, которые простираются от поверхности клетки во внеклеточную среду. В зависимости от их микротрубочек организации, реснички могут быть классифицированы на два типа - "9 + 0" или "9 + 2". Функционально, в зависимости от их подвижности, они могут быть классифицированы как подвижных или неподвижных ресничек 1. Первичная ресничек термин обычно используется для обозначения "9 + 0" неподвижные реснички. Они имеют девять параллельных микротрубочек дублетные (обозначается '9') и центральная пара микротрубочек отсутствует в центральной оболочкой (обозначение «0»). Тем не менее, некоторые "9 + 0" реснички, такие как узловой ресничек, которые регулируют эмбриона латерализацию подвижны 2. С другой стороны, подвижные реснички характеризуется, в дополнение к девяти параллельных дублетов микротрубочек, дополнительным центральной пары микротрубочек дублетов и связанные с динеин моторных белков, чтобы облегчить подвижность. Кроме того, некоторые "9+2 »Реснички, такие как обонятельные реснички неподвижны 3. Эпендимных клетки, выстилающие желудочки мозга и центральный канал спинного мозга характеризуются подвижных ресничек, которые продвигают спинномозговой жидкости (ликвора) вдоль желудочков головного мозга 4.

Общая цель этого метода заключается в содействии изучению подвижных динамика реснички и структурные аномалии. Здоровье и развитие мозга в значительной степени зависят от эффективной циркуляции ликвора в желудочках головного мозга. Например, нормальный поток CSF и баланс жидкости требует нормальной избиения и функциональный эпендимных реснички 5,6, который, в свою очередь сыграть решающую роль в регулировании направленное движение нервных клеток и клеточной миграции 7 Шток. В качестве такого, ненормального эпендимных функции ресничек или структуры может привести к ненормальной потока CSF, который связан с гидроцефалией, медицинское состояние, в котором есть ненормальное накопление спинномозговой жидкости в желудочках бдождь. Это может привести к увеличению, следовательно, внутричерепное давление и прогрессивное увеличение головы, судороги, туннельное зрение, и психической инвалидности 8.

Преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, что она позволила впервые через три различных видов клеток: эпендимных I, II, III и, в зависимости от их уникальной частоте мерцательная избиения и угол бить. Эти клетки эпендимные локализованы в отдельных регионах в желудочки головного мозга. Кроме того, эффекты возраста и фармакологических агентов, таких как алкоголь и цилостазола на изменении эпендимных типов клеток или их локализации может быть продемонстрировано, что было невозможно ранее этой классификации эпендимных клеток. Cilostazol является ингибитором фосфодиэстеразы-3, фермент, который усваивает цАМФ в АМФ, и это также регулирует внутриклеточный кальций 9. Использование высокоскоростной анализ флуоресценции позволяет визуализации и количественной оценки уникального внутриклеточногоколебаний кальция свойства эпендимных клеток. Например, как алкоголь и цилостазол значительно изменили эпендимных частоту цилиарного биение, а также внутриклеточные свойства колебаний кальция, который, в свою очередь, может привести к изменению в цереброспинальной жидкости замещения объема по эпендимных ресничек 10. В целом, этот метод является ключевым, чтобы обеспечить первое доказательство трех различных типов клеток эпендимных с различными свойствами колебаний кальция.

В следующем разделе, детальное шаг за шагом обзор процедуры обеспечивается, обращая особое внимание на подготовку ткани и обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры для использования животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Толедо в в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Институциональная в Национальных институтах здравоохранения и Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Мозг Добыча, Секционирование и тканей Подготовка

  1. Жертвоприношение штамма дикого типа мыши C57BL / 6 с глубоко эвтаназии с СО 2 удушья в течение 5 мин. Убедитесь, смерть путем смещения шейных позвонков.
  2. Почистите головку мыши с 70% этанола.
  3. Выполните удаление фрагментов костей черепа, используя стерильные ножницы и пинцет, сначала потянув шкуру, начиная с верхней части головы, чтобы выставить череп.
  4. Затем, когда череп подвергается, удалить череп пилинг костный фрагмент-на-кусок, начиная с задней стороны и движется в сторону передней стороны. Будьте осторожны, чтобы не разрушить желудочки мозга.
  5. Соберите весь мозг.
  6. Поместите мозг в 100 мм чашки Петри, содержащей DMEM / High-глюкоза с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствор пенициллина / стрептомицина, содержащий 10000 ед / мл пенициллина и 10000 мкг / мл стрептомицина и подогретого до 37 ° С.
  7. Нарежьте мозг на средней сагиттальной плоскости вручную с острым лезвием, и получить первый 100-200 мм раздел из каждой половины, используя vibratome.
  8. Промойте ткань мозга с подогретого С фосфатным буферным раствором (PBS) 1x решения 37 °.
  9. Сразу же место в разделе мозга в DMEM / высокого Глюкоза СМИ предварительно нагревают до 37 ° С.

2. Живая съемка Конфигурация и настройка

  1. Поместите срезы ткани головного мозга в 30 мм с прозрачным дном культуры блюд, содержащих 1 мл DMEM / высоких-Глюкоза СМИ. Регулировка закрытой камере среду микроскопа до 37 ° С, 95% / 5% О2 / СО2 контента (фиг.1 ).
  2. Использование 60X объективное масло погружения линзы, собирать эпендимные клеток / реснички изображения, поместив сначала капли масла на 60X объектива и фокусировка на клетках с регулярной ДВС передается свет.
  3. Затем выполните направление движения DMEM пузыря в качестве ориентира для расположения подвижных ресничек, как эпендимных цилиарные избиения создать своего рода движения пузырьков в области. Выберите область, содержащую здоровые клетки с подвижных ресничек в боковой желудочек мозга с помощью фильтра ДВС. После эпендимных реснички найдено, отрегулировать свет и фокус, чтобы получить удовлетворительное изображение.
  4. Установите живые параметры изображения в соответствии с конкретной целью, используя программное обеспечение обработки изображений Metamorph. В настоящее демонстрации, приобрести двадцать четыре-битных изображений с камеры биннинга набора 1 х 1 в сочетании с объективным и 60X 5-10 мс время экспозиции.
  5. Сбор изображений ДИК, открыв отверстие микроскопа до оптимального уровня, чтобы иметь минимальную ехрosure время. Соблюдайте живые изображения потока в камере, чтобы обеспечить быстрый и непосредственный получения изображения без задержки. Рассчитать скорость ресничек избиения на основе требований минимальных времени экспозиции, чтобы получить достаточную контрастность изображения.

3. Визуализация и анализ данных

  1. Рассчитать количество ресничек побоев путем подсчета количества побоев в 1 мин. Сделайте это путем уменьшения скорости видео и подсчета количества ударов, используя счетчик клеток или подобный инструмент.
  2. Для расчета частоты избиения, умножьте время экспозиции, при котором видео, записанного числа кадров или покадровой изображений, полученных, чтобы получить количество секунд. (Пример: время экспозиции 5 мс 200 кадров = 1000 мс или 1 сек).
  3. Рассчитать количество избиений в одну секунду, чтобы получить частоту, которая выражается как число биений на одну секунду. Сделайте это путем деления числа ресничек избиения в течение одного-второго времени междуВал (Пример: реснички бьет 50 раз в 200 кадров при записи видео во время экспозиции 5 мс т.е. 5 мс х 200 кадров = 1 сек, а теперь делят 50 ударов на 1 сек = 50 Гц).
  4. Рассчитать угол мерцательная избиение вычисления пути, принятое эпендимных ресничек во время обоих силовых и восстановительных ударов. Выполнение этого в соответствии с описанным ранее способом, с незначительными изменениями 11. Точное движение индивидуального ресничек наблюдается в течение всего цикла биений.
  5. На ацетата листом, помещенным на мониторе, провести горизонтальную линию вдоль края эпендимных и вертикальной линии, проходящей через срединном положении ресничек в начале рабочего хода.
  6. Участок точное положение реснички кадр за кадром, как она движется вперед во время рабочего хода. Аналогичным образом, участок движения ресничек в течение обратного хода.
  7. Рассчитать угол мерцательная избиение от максимального отклонения реснички от средней линии во время тон рабочий ход, а также ход восстановления.

4. Кальций сигнал Запись

  1. После нарезки мозг, кратко промыть срез мозга с 1x PBS или PBS Дульбекко (рН 7,0). Подготовьте свежий Fluo-2, чтобы избежать тушение флуоресценции и получить хорошее соотношение сигнал-шум.
  2. Готовят 1 мМ исходный раствор Fluo-2 раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО), перемешивают и вихрь решение, по крайней мере, 5 мин, чтобы обеспечить Fluo-2 однородно растворяли в ДМСО.
  3. Развести Fluo-2 маточного раствора в 500 мл DMEM / High-глюкозы, дополненной 2% B27 подогретого до 37 ° С до конечной концентрации 20 мг / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В-27 оптимизирован бессывороточная добавка, содержащая витамин А, антиоксидантным коктейлем и инсулина, используемого для поддержки кратко- или долгосрочной жизнеспособности гиппокампа и других нейронов ЦНС.
  4. Сразу инкубировать срез мозга с 20 мг / мл Fluo-2 в течение 30 мин при 37 ° С в стеклянным дном пластины.
  5. Для определения оптимальной концентрации нагрузки флуорофорных кальция Fluo-2 и чтобы избежать токсичности клеток красителя кальция, вызов клетки с АТФ и проверить жизнеспособность клеток путем определения времени курс и пик величины сигналов кальция в ответ на АТФ.
  6. Запись видео для колебаний кальция со скоростью захвата 5 мс в течение минимум 1 сек (200 кадров в секунду), с возбуждения и излучения длиной волны 488 нм и 515 нм, соответственно (Movie 2).
  7. Чтобы отличить Fluo-2 сигнал кальция автофлюоресценции или движения артефактов, убедитесь, что интенсивности, испускаемые при 515 нм контролируется отдельно.
    Примечание: Fluo-2 не fluoremetric кальция пригодны для количественного внутриклеточный кальций. Тем не менее, это отличный краситель динамического кальция для обнаружения быстрой смены кальция, такие как кальций колебаний. Для более точного количественного кальция, Фура-2 рекомендуется. Тем не менее, динамические изменения Фура-2 ограничены его ЛогометрическийХарактер красителя.
  8. Следуйте формулы, предусмотренные заводом-изготовителем для расчета точных бесплатно внутриклеточные значения кальция. Пример [Са 2+] = К д × (R - R мин) / (R макс - R). Где К д является константа диссоциации красителя от выпущенного кальция, R является измеренное флуоресценции при 488 и R мин и макс R являются отношения флуоресценции при минимальной и максимальной концентрации ионов 12.

5. Иммунофлуоресценции микроскопия

  1. Исправление срезах головного мозга с фосфатным буферным солевым раствором, содержащим 4% параформальдегида (PFA) и 2% сахарозы в течение 10 мин. Кроме того, исправить весь мозг с 4% PFA, а затем раздел в 50 мм секции, используя криостат.
  2. Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
  3. Выдержите кусочек мозга с Solutiна 0,1% Triton-X в 1x PBS в течение 5 мин, затем промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
  4. Инкубируйте срез мозга мыши с первичным антителом, antiacetylated в-тубулина, используемый в разведении 1: 5000 в 10% FBS в 1x PBS в течение одного часа при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4 ° С.
  5. Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
  6. Инкубируйте срез мозга в вторичными антителами, анти-флуоресцеин мыши IgG в разведении 1: 500 в 10% FBS в 1X PBS растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Перед наблюдения под флуоресцентным микроскопом, контрастное секции с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин, чтобы окрасить ядро (или ДНК) 13. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, изображение разделы сразу с минимальным временем возможного воздействия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Измерение эпендимных функцию ресничек в живом мозге мыши

Метод, описанный в этом протоколе используется для мониторинга эпендимных функцию ресничек и структуру в свежей ткани расчлененный от мозга мыши, а также для мониторинга и изучения реснички частоту биений. Выполняемые для достижения полного эксперимент изображены в схематическом блок-схемы (рис 1). Настоятельно рекомендуется, что эксперимент проводится в течение короткого времени для того, чтобы сохранить подвижные рес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол для подготовки ткани мозга мыши, как для живого изображения и флуоресцентной микроскопии, который обеспечивает быстрый и чувствительный тщательное наблюдение за эпендимных ресничек в желудочки головного мозга. Этот метод не ограничивается только бокового желудочка; он может быть использован для наблюдения за реснички в других желудочков головного мозга. Этот метод визуализации обеспечивает живой поток, который напоминает движение ресничек CSF по избиению в обстановке экс естественных условия...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Чарисс Монтгомери за ее редакторские услуги. Работа А. Аломран частично соответствует требованиям для получения степени магистра в области фармакологии. Эта работа финансируется внутренним фондом стартапов Университета Толедо для W.A.A и грантом NIH (DK080640) для S.M.N.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/HIGH GLUCOSECellgro Mediatech Inc.10-013-CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ГиклонSH30088-03
Пенициллин/стрептомицинThermo ScientificSV30010
Фосфатный буферный физиологический растворThermo ScientificSH30256-01
Параформальдегид Электронная микроскопиянаук 15710-SP
СахарозаSigma-AldrichS-2395
Triton-XSigma-AldrichT9284
Fluo-2 TEF Labs#0200
DMSO
B27Gibco17504044
VECTASHIELD HardSet Монтажная среда с DAPIVector LabsH-1500
Антиацетилированное антитело к a-тубулинуSigma-AldrichT7451 клон 6-11B1
FITC Антимышиный антителоVector LabsFI-2000
Пластина для культивирования клетокVWR Vista Vision30-2041
Cover Slip (18 x 18)VWR Vista Vision16004.326
ВибратомLeica BiosystemsLeica Biosystems Leica VT1200S
КриостатLeicaBiosystems Leica CM1860
Инвертированный флуоресцентный микроскопNikon Nikon TE200060X масло 
Защитное стекло микроскопа 24 x 60 мм2VWR Vista Vision16004-312
Монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH-1500
DAPI фильтрующий кубChroma Technology

Ссылки

  1. AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
  2. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  3. Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
  4. Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
  5. Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
  6. Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
  7. Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
  8. Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
  9. Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476(2012).
  10. Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
  11. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  12. Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
  13. AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
  14. AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
  15. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
  16. Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
  17. Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Живая съемка в эпендимных ресничек боковых желудочков головного мозга мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.