Методическая статья

Метод Дистанционно заставить замолчать нейронной активности в течение Грызуны дискретных фаз обучения

DOI:

10.3791/52859

⸱

22 июня 2015 г.

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как временно и дистанционно подавить нейронную активность в дискретных областях мозга, пока крысы заняты задачами на обучение и память. Этот подход сочетает в себе фармакогенетику (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) с поведенческой парадигмой (сенсорным преобусловливанием), которая предназначена для различения различных компонентов обучения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как временно, так и удаленно заглушить нейронную активность в дискретных областях головного мозга, а животные занимаются обучения и памяти задач. Подход сочетает в себе фармакогенетика (Дизайнер-Рецепторы-Эксклюзивно-активированный-на-Designer-препараты) с поведенческой парадигмы (сенсорной) предварительной, которая предназначена для дифференциации между различными формами обучения. В частности, вирусной опосредованной доставки используется, чтобы выразить генетически модифицированных тормозящее G-белком рецептор (рецептор конструктор) в дискретной области головного мозга в грызуна. Через три недели, когда уровни экспрессии рецепторов дизайнер высоки, фармакологический агент (наркотика) вводят системно 30 мин до определенной поведенческой сессии. Препарат обладает сродством к рецептору дизайнера и, таким образом, приводит к ингибированию нейронов, которые экспрессируют рецептор конструктора, но в остальном биологически инертным. Область мозга остается замолчать в течение 2-5 ч (висимостьдинь от дозы и пути введения). После завершения поведенческой парадигмы, ткани мозга оценивали для правильного размещения и экспрессии рецепторов. Этот подход особенно полезен для определения вклада отдельных областей мозга в конкретных компонентов поведения и может быть использован в любом числе поведенческих парадигм.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Захватывающая задача в области поведенческой неврологии является определение нейронных субстратов сложным поведением. Количество таких методов, как постоянных поражений, временный инактивации мозга через канюли имплантатов и оптогенетика были использованы для идентификации вклад дискретных областей мозга, чтобы подкомпонентами сложным поведением. Хотя эти подходы наше понимание региональной специфики в ходе обучения, каждый метод не без ограничений. В частности, постоянные поражения, как правило, проводиться до поведенческим тестированием, таким образом, их действие присутствует в течение всего периода парадигмы. Катетеризация исследования, которые включают представление краткосрочной нервной инактиватора (например, тетродотоксин) может производить значительный ущерб ткани мозга и могут вызвать стресс у субъектов только до поведенческого тестирования. Кроме того, инактивации через канюлю ограничено области ткани, которая окружаетКончик канюли. Наконец, в то время как оптогенетика предлагает широкий выбор гибкости для временной контроля деятельности в конкретных областях мозга, она является экономически и технически непомерно требовательных.

Эти ограничения могут быть преодолены с помощью фармакогенетический подход (дизайнер-рецепторов-Исключительно активированные-на-Designer-наркотики, DREADDs) 1,2. Важно отметить, что в то время как концепция фармакогенетики является сложной, выполнение техники проста. Подобно традиционным стереотаксических хирургических методов, которые включают вливание токсина (например, NMDA, иботеновой кислоты) в дискретных областях головного мозга, этот метод включает привнесение в аденоассоциированный вирус (AAV), который содержит ДНК-фрагмент, модифицированный ингибирующее G-белком рецептор (hM4Di; дизайнер-рецептор) в области интереса стандартных лабораторных грызунов (рисунок 1). Вирусный вектор также содержит флуоресцентный репортер (mcitrine). После того, как включены вк клеткам, проектировщик рецепторов (и репортерный белок) максимально выражены ~ 3 недели после инфузии, и может быть избирательно активированы в течение 2-5 ч при системном введении в противном случае биологически инертного наркотика, клозапин-N-оксида (CNO) 1 3. Потому что экспериментатор наделен точной, но удаленной временной контроль над нервной деятельности в конкретных областях мозга, фармакогенетика сочетает особенно хорошо с поведенческими парадигмами, которые проводятся в несколько этапов. В этом примере, вклад ретроспленальной коры (РКК) на стимул-раздражитель обучение по сравнению с его ролью в павловской обучения, однако это сочетание подходов, хорошо подходит для любого количества вопросов, которые стремятся определить, каким образом конкретные области мозга способствуют сложное поведение.

Кроме того, в то время как не описано в данном протоколе, вирусные и трансгенные подходы могут быть использованы для достижения типа клеток конкретных DREADD выражение 2. Как и яс присущ поведенческих парадигм, которые включают фармакологические и / или другие типы экспериментальных манипуляций, тщательного рассмотрения эксперимента и последующего количественного анализа требуется при использовании подход DREADD. Экспериментаторы новые для подхода DREADD называют всеобъемлющего обзора современных технологий DREADD 2.

Каждый день, организмы узнать о новых стимулов и событий и их отношений друг к другу. Даже в знакомой среде, такие как дом, один быстро обнаружить изменения в отношениях между стимулами, потому что эти изменения могут быть предиктором значимых событий. Такой стимул-раздражитель (т.е., реляционная) обучения включает в себя conjoining нескольких стимулов и традиционно ассоциируется с гиппокампе, который находится в центре в медиальной височной доле 4. Тем не менее, гиппокамп не существует ни действовать в одиночку; области коры как в пределах и внесторона медиальной височной доле обеспечить критическую сенсорную информацию к гиппокампа 5-7. Традиционные постоянные исследования поражения убедительно доказательства причастности ряда корковых областей (например, ретроспленальной, postrhinal и энторинальной коры) в гиппокампе зависит от обучения, но ограничены в своей способности различать роль конкретного региона в дискретных фаз обучение 8-10.

Настоящий протокол проверяет гипотезу о том, что РКК необходимо для стимула стимула обучения по замолчать RSC во время одной фазы в 3-фазных сенсорная предварительной подготовки парадигмы 11,12. Вкратце, крысам настои из AAV, который содержит конструктор рецептор и ~ 3 недели вводят дизайнер наркотиков (CNO) за 30 мин до начала поведенческого тестирования. В настоящем протоколе, экспериментальные крысы получали CNO в ходе первого этапа тестирования (когда стимул-раздражитель ЛирНин происходит), и они получают автомобиль в течение следующих 2 фазы тестирования. Для контроля непреднамеренных последствий CNO на поведение, настоять крыс с дизайнером рецептора (hM4Di) и ввести с автомобиля, а не CNO. Для учета общего влияния вирусной инфузии и экспрессии рецепторов, настоять вирус управления, не содержит конструктор рецептор и управлять CNO.

Ряд различных серотипов AAV используются для доставки генетического материала. Текущие NIH Руководство для исследований с участием рекомбинантных или синтетических молекул утверждает, что AAV (всех серотипов) и рекомбинантных или синтетических AAV конструкции, в которых трансген не кодирует либо потенциально онкогенного генный продукт или молекулы токсина и производятся в отсутствие помощник вирус, требуют BSL-1 предосторожности (Приложение B-1. Группа риска 1 (Rg1) Агенты) 13. Количество отзывов, относящихся к структуре AAV, полезности и безопасности доступны 14,15. Примечательно, хотя, Из-за проблем, связанных с возможными репродуктивных 16,17 и потенциальных канцерогенных механизмов 18-20 у грызунов, некоторые учреждения требуют использования BSL-2 меры предосторожности при работе с AAV. Убедитесь в правильности BSL до использования путем консультаций с комитетами по надзору в отдельных учреждениях, где проводятся такие исследования, Центры по контролю за заболеваниями и НИЗ Руководства для исследований с участием рекомбинантных ДНК Молекулы 13 при использовании вирусных векторов для манипуляции генов в Соединенных Штатах. Личная защита, следователь подготовки, вектор сдерживания, обезвреживание, размещение в очищенных материалов, и после инъекции животных требования на жилье указаны в этих руководящих принципов. Кроме того, консультации и следуйте соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета руководящие принципы или эквивалентные руководящие организационные Комитет по надзору для обеспечения безопасной обработки, управления и распоряжения AAV.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных утверждаются Оберлин колледжа Уходу за животными и использованию комитета и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных 21.

1. Подготовка к вирусным инфузии

Примечание: Этот протокол использует BSL-1 меры предосторожности. При использовании BSL 2-предосторожности, одноразовый халат, перчатки, бахилы, глаз защиты и респиратор частиц (типа N95) требуется. Все лица обработки BSL-2 соединения должны быть проверены на соответствовать респиратор частиц местным агентством общественного здравоохранения. Обратитесь к Лоури и Majewska (2010) 22 для получения дополнительной информации по обращению с и хранению вирусных векторов.

  1. После первого использования, аликвоты и хранить неиспользованные вируса в 20 мкл микропробирок, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания.
  2. Подготовьте рабочую поверхность, удалив ненужные объекты и стерилизации поверхности 70% -ным этанолом. Подготовьте 10% раствор хлорной для обеззараживания отходов AAV. Поставьте стакан, полный решения отбеливателя и стерильной 10 мкл шприц на рабочую поверхность. Поместите трубку микроцентрифужных с AAV в контейнере с колотым льдом во время установки.
  3. Поместите трубку микроцентрифужных с вирусом в стандартной тисках. Загрузка 10 мкл шприц с по крайней мере 4 мкл AAV. Позаботьтесь, чтобы не согнуть кончик шприца против нижней части трубки микроцентрифужных во время загрузки. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков в 4 мкл AAV раствора в шприце.
  4. Утилизацию пустой трубы вируса в химический стакан, содержащий 10% хлорной извести. Храните неиспользованные вируса, как указано поставщиком.
  5. Добавить дополнительную 10% отбеливателя контейнер для отходов, и позволяют отходы сидеть в течение 30 мин перед утилизацией Очищенное жидких отходов.
  6. Утилизировать все защиты и пластиковых отходов в контейнер для биологически опасных по поручению институциональных принципов. Декоntaminate любое оборудование или поверхности, которые пришли в контакт с вирусом, используя 10% отбеливатель.

2. Хирургическое

  1. Подготовка хирургического области путем размещения абсорбирующего скамейке бумагу под стереотаксической аппарата и околоземного космического пространства назначенного в качестве специальной области обработки вирус.
    1. Поставьте контейнер 10% отбеливателя отходов в специальном районе обработки вирус возле хирургического аппарата.
  2. Вызвать устойчивый уровень анестезии и подготовить крысу к операции.
    1. Поместите крысу в индукционной камере, содержащей смесь изофлуран газа (от 1 до 3%) и кислорода (100% примерно 1 л / мин) до тех пор, пока не будет потеря сознания и отсутствие грубой целенаправленное движение. Поддержание анестезии Isoflurane всей хирургической процедуры.
    2. После 6 глубоко анестезия достигается, брить крысу от между глазами слегка позади ушей.
    3. Поместите крысу обратно в индукции камеры длядополнительная 1-3 мин.
    4. Убедитесь, что система ИФ анестезии подключен к носовой конус стереотаксической хирургии. Откройте кран на изофлурана трубки, чтобы начать поток изофлураном к stereotax. Поддерживать изофлурана и кислорода на уровнях, указанных выше.
    5. Поместите крысу в стереотаксической аппарата по обеспечению рот на панели укуса и обеспечения уха баров.
    6. Применить глаз смазку для глаз и бетадин к хирургическому сайте до разреза.
  3. Сделать 2,4 см срединный разрез кожи на спинной поверхности черепа, начиная примерно 2 мм хвостовой глаз. Уберите кожу, чтобы выставить череп. Периодически привить стерильный 0,9% стерильного физиологического раствора на полях хирургического сайта, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
  4. Ясно мембранной ткани из черепа до темени и лямбда четко видны.
  5. Убедитесь, что череп уровень путем измерения спинной-вентральной координат вбрегма и в лямбда. Отрегулируйте стереотаксической устройства, соответственно, до тех пор, спинной-вентральной координаты в темени и лямбда не отличаются не более чем на 0,04 мм.
  6. В это время, уменьшить изофлуран газа в диапазоне от 2 до 2,5%.
  7. Вернуться дрель для брегмы, rezero координат, а затем перейти на сверло желании медиальной-боковой и передне-задней координат.
  8. Тренировка отверстие в координации с использованием 0,9 мм сверла, как он производит дырки соответствующего размера для инфузии 28 г шприца.
  9. Установка инфузионного насоса для доставки вируса в размере 0,2 мкл / мин. Поместите шприц в руку вливания стереотаксической устройства и снизить шприц в желаемый координат. Доставит желаемое количество вируса (в диапазоне от 0,1 до 0,8 мкл). Например, поставить 0,8 мкл AAV более 4 мин.
    Примечание: провести экспериментальные исследования для определения идеального объема инфузионной и типичные распространение вируса в каждой области интереса.
    1. После доставки вируса совместноmplete оставить шприц на месте в течение 10 мин для предотвращения обратного потока в ходу иглы. Медленно поднять шприц со скоростью около 5 мм / мин. Повторяйте, пока все координаты не были проникнуты AAV.
  10. Закройте рану, используя хирургические скобы и пальто рану антибактериальной мазью.
  11. Следуйте институциональные руководящие принципы для послеоперационной боли.
  12. Поместите крысу в клетке с постельными принадлежностями, крышкой и надлежащего вывесок и вернуть крысу на объект животного.
    1. При работе под BSL-2 Меры, собирать кроватях для количества времени (как правило, 48-72 ч), указанного институциональных принципов. Поместите кроватях в контейнер для биологически опасных отходов.
    2. Утилизируйте все AAV-загрязненных материалов, как указано в руководящих принципах для их безопасной утилизации.

3. Поведенческие Аппарат

Примечание: сенсорная предварительная установка состоит из стандартного инструментального кондиционирования ChamBER (12 "Д х 9,5" Ш х 11,5 "H) из нержавеющей стали сетки этаж, 2 боковые стенки из оргстекла и 2 металлические стенки.

  1. Установите 2,8 Вт свет на одну из алюминиевых стен служат дома свет и в качестве визуального стимула, когда вспыхнули с частотой 2 Гц. Установите динамик на камеру, чтобы доставить слуховые раздражители (10 сек, 1500 Гц, 78 дБ чистый тон и дБ белый шум 10 сек 78).
    1. Используйте пищевой бункер, чтобы доставить 45 мг пищевых гранул в пищевой чашку. В пищевой чашку, инфракрасные фотоэлементы обнаруживают общее время, проведенное в пищевой чашку до, во время и после презентации раздражителей и пищевых наград.
    2. Дом камеры в звуковых-ослабления шкафов (22 "Ш х 22" H х 16 "D), оснащенные вытяжными вентиляторами (~ 68 дБ).
    3. Используйте компьютер с программным обеспечением Med Associates для управления оперантного камеры и приобрести данные. Во время сессий кондиционирования, собирать данные об общем времени, проведенного с головой в пищевой чашку во время презение в (сек эпохи 5) световой раздражитель и во время презентации пищевого подкрепления (5 сек) эпохи. Во время тестовой сессии, собирать данные об общем времени, проведенного в пищевой чашку в ответ на презентации слуховых раздражителей (10 сек начало эпохи, когда слуховые раздражители прекращается).

4. Обзор сенсорной предобусловливания Paradigm

  1. После восстановления после операции, постепенно ограничивают пищи крыс на 85% от их массы тела свободной подачи. Обратитесь ветеринарный персонал для соответствующей парадигмы ограничение пищи.
    Примечание: 3-фазный сенсорная предварительная парадигма показано на рисунке 2.
  2. Предварительная Сессии (Фаза 1; Ежедневные 64 мин тренинги проводятся в 4 дня подряд):
    1. Нынешние крысы с 12 смешанных испытаний, которые состоят из поставки слуховых и зрительных раздражителей. Включить между пробные интервалы, средний 4,5 мин (диапазон от 4,0 до 5,0 мин) после каждого аuditory презентация.
    2. На 6 испытаний, присутствует тон (стимул) выдержано в течение 10 сек, затем сразу 5 сек презентации мигающий световой раздражитель в.
    3. На других 6 испытаниях, представить белый шум (непарный стимул) в одиночку в течение 10 сек.
  3. Сессии Кондиционер (Фаза 2; Ежедневно 64 мин тренинги, проводимые через 5 дней подряд):
    1. Нынешние крыс с 8 испытаний, которые состоят из родов визуального стимула (мигающий свет стимула) в течение 5 сек сразу после родов двух пищевых гранул 45 мг. Включить между пробные интервалы, которые в среднем 7 мин (диапазон от 6,0 до 8,0 мин) после каждого испытания. Иногда крысы требуют больше, чем 5 сеансов кондиционирования, чтобы узнать свет ассоциацию пищи.
  4. Тест сессия (Фаза 3; один сеанс 78 мин):
    1. Представьте крыс с 12 смешанных испытаний, которые состоят из поставки только слуховых раздражителей. Включить между пробные интервалы, AVEярости 4.5 мин (диапазон от 4,0 до 5,0 мин) после каждого слухового представления.
    2. На 6 испытаний, представляют стимул тона (выдержано стимул) в одиночку в течение 10 сек.
    3. На других 6 испытаниях, представить белый шум (непарный стимул) в одиночку в течение 10 сек.
  5. Уравновесить стимулы от завершения исследования со вторым набором крыс, которые получают белый шум в качестве стимула и выдержано тон как непарного стимула.

5. Фармакологические и поведенческие процедуры

  1. Включите питание в поведенческой аппарата и загрузить код Med-PC для соответствующего поведения сессии. Провод и программы поведенческой аппарат таким образом, что поклонники, которые установлены на звуковых ослабления шкафов включается при включении питания.
  2. Чтобы приготовить 1 мг / мл раствора клозапин N-оксида (CNO), вес 5,0 мг CNO в 15 мл коническую пробирку и добавляют 5 мл стерильной воды или 5 мл стерильной 0,9% SalIсеверо-восток Вихревые до решения ясна.
    1. Если CNO не растворяется в растворе или, если более концентрированные растворы CNO желательно добавить солюбилизирующий агент, такой как ДМСО 23. В частности, для получения 1 мг / мл раствора CNO с 0,5% ДМСО, вес 5,0 мг CNO и добавить 25 мкл ДМСО в 15 мл коническую пробирку. Щелчок аккуратно, что содержимое остается в основании трубы. Когда раствор становится прозрачным, добавить 5 мл стерильной воды или 5 мл стерильного 0,9% физиологического раствора. Дальнейшие инструкции по подготовке решений CNO доступны на странице ресурсов DREADD вики 25.
    2. Подготовьте новое решение Cno каждый день, что его вводят.
  3. Вводят CNO внутрибрюшинно в дозе 1 мг / кг приблизительно за 30 мин до тестирования поведения. Например, вводят в 200 г крыс с 0,2 мл 1 мг / мл раствора CNO. Доза и время курс администрации СМО были отобраны на основе ранее опубликованных докладов 2,12.
    1. Вводите Cno за 30 мин до каждого предварительной подготовки сессии (Фаза 1; в общей сложности 4 дня инъекций), но управлять транспортным средством до всех последующих сессиях поведенческих.
  4. Через 30 мин крыс поместить в поведенческих испытаний камер и инициировать компьютерный код для соответствующего поведенческого сессии.
  5. После завершения поведенческой задачи, немедленно удалить крыс из камер и вернуть крыс колонии животных.

6. Анализ поведенческих данных

Примечание: зависимой переменной для всех поведенческих сессий является количество времени, что голова крысы внутри пищевой чашки, как обнаружено прерывание инфракрасных фотоэлементов в пищевой чашку. Данные (в сек) собраны и записаны с помощью компьютерной программы.

  1. Не проводить анализы на данных, полученных в ходе стадии предварительного.
  2. Для сессий кондиционирования: анализировать каждый крыс Aность, чтобы узнать свет ассоциацию пищевых продуктов путем сравнения пищевое поведение чашки во время презентации визуального стимула через 5 поведенческих сессий. В частности, вычислить среднее время, проведенное в пищевой чашку в 5 сек света эпохи для каждого из 8 испытаний / сессии (т.е., в среднем 8 испытаний, каждый из которых 5 сек в продолжительности / крысы). Сравните среднюю контроль и экспериментальные значения для каждого из 5 ежедневных сеансов (рис 3а).
    1. Анализ мотивации крыс, чтобы получить награду пищи путем сравнения пищевое поведение чашки во время доставки пищевого подкрепления (5 сек) через эпохи 5 поведенческих сессий, используя тот же расчет, как указано на 5 сек света эпохи выше. Эти значения будут всегда выше, чем те, приобрела во время презентации визуального стимула (рис 3B).
  3. Для тестовой сессии: вычислить отношение дискриминации, которая описывает поведение еда чашка крыс в ответ на настentations каждого звукового раздражителя.
    1. В частности, для каждой крысы, разделите среднее время, проведенное в пищевой чашку после каждого 6 презентаций сенсорной выдержано стимула (например, тон) на сумму среднего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций сенсорная выдержано раздражитель (т.е. стимул тона) плюс средняя от общего времени, проведенного в пищевой чашку после каждого из 6 презентаций непарного стимула (т.е. белый шум стимула). Каждая эпоха 10 сек продолжительности.
      Примечание: оценка дискриминация 0,5 или больше показывает, что крысы научились ассоциации, заложенные в сенсорной предварительной подготовки парадигмы.

7. Проверка AAV размещения и выражения

  1. Обезболить и заливать крыс транскардиально используя 4% параформальдегида. В связи с использованием флуоресцентных меток, не превышают время после фиксации 2 ч до минПотеря imize антигенности и сохранить флуоресцентный сигнал.
  2. Высушить перфузированных мозги путем передачи их в банку мозга, содержащего 30 мл 20% раствора сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе (1x) в течение как минимум 2 дней или до мозга опускается на дне сосуда головного мозга.
  3. Используйте замораживание раздвижные микротом сделать разделы корональной мозга (20-40 мкм) в течение всего рострокаудального степени интересующей области.
  4. Проведение иммуногистохимии, направленное против меченого рецептора или репортерного белка, чтобы установить местонахождение и экспрессию рецептора дизайнера и / или репортера 12. Протокол окрашивания иммуногистохимии предоставляется на странице ресурсов DREADD вики 25.
  5. Установите секции на SuperFrost плюс слайды и покровного используя 100-200 мкл водного монтажа среды.
  6. Выполните флуоресцентной микроскопии на ткани головного мозга, чтобы проверить размещение AAV и белка выражение 12,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поведенческие результаты

По окончании эксперимента, эффективность области конкретных временной инактивации должно быть количественно и качественно оценить. Настоящий пример предполагает 3-фазный поведения парадигму (сенсорная предобусловливания), в котором CNO вводили для ослабления нервной деятельности в RSC процессе предварительной сессий, чтобы проверить гипотезу, что РКК необходимо для формирования ассоциаций среди нейтральных стимулов 12. Важно отметить, что экспериментаторы не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как применять подход фармакогенетический (DREADD), чтобы исследовать, как конкретного региона мозга способствует многофазной задачи комплексно обучения. С возможностью временно, так и удаленно заглушить нейронной активности в отдельных областях мозга в фазах обучения, это сочетание подходов обеспечивает платформу для расследования широкий спектр поведения, в том числе более тонкий и прикрытые формы обучения. В примере, описанном в данном протоколе, контрольных крыс и крыс, которые экспрессируют ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим авторов Робинсон и др. 12 за их вклад в рукописи, из которых этот протокол частично получены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самец, крысы Long Evans, возраст 55-60 днейHilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrineVirus VectorОсновное внимание: это соединение BSL-1
rAAV8/hSyn-GFPVirusОсновное внимание: это соединение BSL-1
Клозапин-N-оксидR& D Systems4936-10Дизайнерский препарат
Крышка клетки для крыс (поликарбонат)Альтернативный дизайн FT 8XL-PCИспользуется для покрытия клеток для животных 48-72 часа после инфузии
Фильтровальная бумага (замена)Альтернативный дизайнFP-R-1018XADФильтровальная бумага, которая идет с крышками клеток
Настольные тискиJETS2201-265Для хранения микроцентрифуговых пробирок, содержащих AAV, в капюшоне
Пакеты для мусора Biohazard Скобы113444вкладыши для биологической опасности Medline Мусорное
ведро BiohazardUnited Solutions 34 галлон прямоугольный колесный мусорный бак с крючком и замковой ручкой
Изофлуран, 100 млPatterson Veterinary Supply Inc.07-890-8540Обезболивающее
двойное стереотаксис для мелких животных с цифровым дисплеем считывающей консолиDavid KopfModel 942Хирургическое оборудование
Неразрывные ушные планки, набор из 2 штук (крыса)David KopfModel 955Хирургическое оборудование
Маска для анестезии (крыса)David KopfModel 906Хирургическое оборудование
Высокоскоростная стереотаксическая дрель включает в себя настольный контроллер двигателя, ножную педаль, наконечник, стереотаксический держатель наконечникаDavid KopfModel 1474Хирургическое оборудование
Микросверло заусенцы, 0,9 ммFine Science Tools Inc19007-09Хирургические поставки
Автоматизированный шприцевой насос с контроллером micro4KopfМодель UMP3-1Хирургическое оборудование
Pro-animal съемное керамическое лезвие набор для стрижкиAhdis21420Хирургический расход
Betadine средство для очищения кожиPerdue Products L.P67618-149-04Хирургический расход
Тройная антиобиотическая мазьMedline Supply53329-087-01Хирургический расход
Puralube ветеринарная мазьТолько ветеринарный расход17033-211-38Хирургический расход
Dino-liteМикроскопAD7013MTLАльтернатива традиционному дисекционному прицелу
Dino-lite Жесткая настольная стойка со штангойМикроскопMS36BХирургическое оборудование
28 G 10μ l шприцHamilton80308-701SNХирургическое оборудование
Сверхвысокий шумопоглощающий бокс из МДФMed Associates, IncENV-018MD22' Ш x 22" В x 16" D
Сверхвысокая модульная испытательная камераMed Associates, IncENV-007Поведенческое оборудование
Решетчатый пол из нержавеющей сталиMed Associates, IncENV-005Поведенческое оборудование
Домашний светильникMed Associates, IncENV-215MИспользуется в качестве домашнего света и стимульного света
Модульный диспенсер гранулMed Associates, IncENV-203M-45Поведенческое оборудование
Контейнер для пеллет, тип чашкиMed Associates, IncENV-200R1MПоведенческое оборудование
Детектор входа головки для крысMed Associates, IncENV-254-CBПоведенческое оборудование
Беспыльные прецизионные пищевые гранулы, 45 мгBio-ServF0165Поведенческий источник питания
Клеточный динамик для крысиной камерыMed Associates, IncENV-224AMПоведенческое оборудование
Программируемый аудиогенераторMed Associates, IncANL-926Поведенческое оборудование
Smart ctrl 8 вход/16 выход пакетMed Associates, IncDIG-716P2Поведенческое оборудование
Большой настольный шкаф и блок питанияMed Associates, IncSG-6510DПоведенческое оборудование
Пакет интерфейса PCIMed Associates, IncDIG-700P2-R2Поведенческое оборудование
MED Intel core computer pkg с X Pro 19-дюймовым мониторомMed Associates, IncCOM-103VПоведенческое оборудование
Параформальдегид (граннулярный), 1 кгElectron Microsopy Sciences19210Опасность: канцероген, вес в капюшоне
Моноклональное антитело кролика (HA-Tag)Технологии клеточной сигнализации3724SГистологический реактив
XP Моноклональное антитело кролика (GFP)Технологии клеточной сигнализации2956SГистологический реагент
Antirabbit IgGCell Signaling Technologies4412SГистология поставляет
стекла Superfrost plusVWR international483111-703Принадлежности для гистологии
Vector Amazon.com David

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

N

Похожие статьи