Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) представляют собой источник конкретного пациента тканей для клинического применения и фундаментальных исследований. Здесь мы представляем подробный протокол для перепрограммирования человека мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученные из замороженных лейкоцитарных пленок в вирусные свободной ИПСК с использованием не-интегрирующие Эписомные плазмиды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из замороженных Баффи пальто с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Соматические клетки могут быть перепрограммированы в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), заставляя экспрессией четырех транскрипционных факторов (OCT-4, Sox-2, КФК-4 и C-Myc), как правило, выражается человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) , Из-за их сходства с ЭСК, иПСК стали важным инструментом для потенциальных пациентов конкретных регенеративной медицины, избегая этические вопросы, связанные с ЭСК. Для того чтобы получить клетки, пригодные для клинического применения, трансгенные свободной иПСК должны быть сгенерированы, чтобы избежать трансгена реактивации экспрессии измененного гена и неправильно дифференциацию. Кроме того, очень эффективный и недорогой способ перепрограммирования необходимо получить достаточные ИПСК для терапевтических целей. Учитывая эту потребность, эффективность неинтегрирующих подход эписомными плазмида предпочтительно выбором для IPSC выводе. В настоящее время наиболее распространенный тип батарей, используемых для целей перепрограммирования фибробласты, изоляция которых требуется биопсия тканей, яnvasive хирургическая процедура для пациента. Таким образом, в периферической крови человеческой представляет собой наиболее доступный и наименее инвазивный ткани для производства IPSC.
В этом исследовании, протокол экономически эффективным и вирусно-бесплатно с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды сообщается для генерации ИПСК из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs), полученных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования крови всего и без градиента плотности разделения.
Введение
В 2006 году группа Шинья Яманака 1 продемонстрирована впервые, что соматические клетки взрослых мышей и человека может быть преобразован в плюрипотентных государства эктопической экспрессии четырех перепрограммирования факторов (октябрь-4, Sox-2, КФК-4, и C-Мус), генерации так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) 2. Конкретного пациента иПСК напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) в терминах морфологии, распространения и способности различать в трех типов зародышевых клеток-(мезодерма, энтодермы и эктодермы), а не хватает этические проблемы, связанные с использованием ЭСК и обход возможно иммунное....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мононуклеарных клеток крови (PBMNCs) были выделены из периферической крови человека здоровых доноров после подписанных информированное согласие и одобрение этического комитета провинции Южный Тироль. Эксперименты были проведены в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Все данные были собраны и проанализированы анонимно.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs)
- PBMNCs получены из лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови, без разделения в градиенте плотности.
- Собирают 8 мл венозной периферической крови в буферный цитрат натрия пластиковую трубку, и хранить....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом исследовании простой и эффективный протокол для генерации свободных вирусных ИПСК по перепрограммированию PBMNCs выделенных из замороженных лейкоцитарных пленок после центрифугирования всей крови и по сравнению с перепрограммирования PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности сообщается. 1А показывает схематическое представление Подробный протокол. После оттаивания, изолированные PBMNCs, показывая типичный округлую форму, расширены в определенной культурой крови среды в течение 14 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В прошлом, единственным способом получения человеческих плюрипотентных стволовых клеток, несущих определенную генетическую мутацию, был завербовать родителей, перенесших доимплантационная генетическую диагностику и произвести эмбриональные стволовые клетки из бластоцисты их выброшенных 31,32. Использование перепрограммирования подход, исследователи теперь может генерировать ИПСК из пациентов, несущих практически любой генотип. Возможность начать с конкретного пациента клеточной линии и легко доступным источни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследование было поддержано Министерством здравоохранения и Департаментом помощи в образовании, Университетом и исследованиями Автономной провинции Больцано и Фондом Южного Тироля Sparkasse.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Цитрат натрия буферизованный Venosafe Пластиковая трубка | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Хлорид аммодиума | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Бикарбонат калия | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| ЭДТА порошок динатрия | Sigma-Aldrich | E5134 | 0,5 М раствор |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Раствор полисахарозы для центрифугирования градиента плотности |
| Модифицированная среда Дульбекко от Iscove (IMDM) | Gibco | 21056-023 | Без фенола |
| красный Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Стоковый: 100X) |
| Химически определенный липидный концентрат | Gibco | 11905031 | 1X (стоило: 100X) |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидрат | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-тиоглицерин | Sigma-Aldrich | M6145 | конечная концентрация при 200 &м; M |
| Рекомбинантный фактор стволовых клеток человека (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 нг/мл (Stock:100 µ г/мл) |
| Интерлейкин человеческий рекомбинантный (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 нг/мл (Stock: 10 µ г/мл) |
| Рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста (ИФР-1) | PeproTech | 100-11 | 40 нг/мл (Запас: 40 & микро; г/мл) |
| Рекомбинантный человеческий эритропоэтин (ЭПО) | R& D Systems | 287-TC-500 | 2 ед/мл (склад: 50 ед/мл) |
| Дексаметазон | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μ M (Stock: 1 mM) |
| Человеческий голотрансферрин | R& D Systems | 2914-HT | 100 μ г/мл (Склад: 20 мг/мл) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Среда для цитогенетического анализа |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Среда для iPSC безфидерной культуры |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл) | Gibco | 15140-122 | |
| L-глутамин (200 мМ) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM раствор заменимых аминокислот (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-меркаптоэтанол | Gibco | 31350-010 | 0,1 мМ (Код: 50 мМ) |
| Бутират натрия | Sigma-Aldrich | B5887 | 0,25 мМ (Код: 0,5 мМ) |
| Рекомбинантный человеческий FGF базовый, 145 аа | НИР D Systems | 4114-TC | 10 нг/мл (Склад: 10 & микро; г/мл) |
| Y-27632 дигидрохлорид | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 & микро; M (Stock: 10 mM) |
| Фетальная определенная сыворотка крупного рогатого скота | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Раствор желатина | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basel Membrane Matrix Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Коллагеназа, тип IV | Gibco | 17104-019 | 1 мг/мл (Запас: 10 мг/мл) |
| Аккутаза | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Раствор для отслойки клеток |
| Мышиный эмбриональный фибробласт (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 луночный планшет |
| Плазмида pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 и микро; g (Запас: 1 & микро; g/µ l) |
| Плазмида pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 & микро; g (Запас: 1 & микро; g/µ l) |
| Плазмида pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 & микро; g (Запас: 1 & микро; g/µ l) |
| Плазмида pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 & микро; g (Запас: 1 & микро; g/µ l) |
| Набор для окрашивания щелочной фосфатазы | Stemgent | 00-0009 | |
| Антистадийно-специфический эмбриональный антиген-4 (SSEA-4) Антитело | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Антитело Merck-1-60 Антитело | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Антитело | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Антитело | Anti-Oct-3/4Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Антитело против нанога | Santa Cruz | Biotechnology sc-33759 | 1/500 |
| Антитело против тропонина I | Santa Cruz | Biotechnology sc-15368 | 1/500 |
| Антитело против α-актинина (саркомерного) | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Нейрональный класс III ß-тубулин (TUJ1) Антитело | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Антитело к тирозингидроксилазе (ТГ) | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Козье антимыши | Молекулярные зонды | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Козьи антикроличьи | молекулярные зонды | A-21429 | 1/1000 |
| Культура клеток со сверхнизким уровнем прикрепления 6-луночный планшет | Corning | 3471 | |
| Тризол | реагент Ambion | 15596-018 | реагент для экстракции РНК |
| SuperScript VILO набор для синтеза кДНК | Invitrogen | 11754050 | Набор для обратной транскриптазы |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Система обнаружения ПЦР в реальном времени | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Автоматизированная система электрофореза | Bio-Rad | 700-7000 | Инструмент для проверки целостности РНК |
| Experion RNA Набор для анализа Highsense | Bio-Rad | 7007105 | Набор реагентов для проверки целостности РНК |
| Препарирующий микроскоп (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 & микро; l Набор | Invitrogen | MPK10025 | Набор реагентов для электропорации |
| Неоновая трансфекционная система | Invitrogen | MPK5000 | Инструмент для электропорации |
| NanoDrop UV/Vis Спектрофотометр | Thermo Scientific | ND-2000 | Инструмент для количественного определения ДНК/РНК |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Набор для очистки плазмид |
Ссылки
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from f....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
