Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52889

⸱

19 июня 2015 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает обнаружение интегронов класса 1 и связанных с ними генных кассет в пищевых продуктах.

Аннотация

Устойчивость к антибиотикам является одной из самых больших угроз для здоровья в 21веке. Приобретение генов резистентности путем латерального переноса генов является основным фактором в распространении различных механизмов резистентности. Среди элементов ДНК, способствующих латеральному переносу, интегоны класса 1 в значительной степени ответственны за распространение детерминант устойчивости к антибиотикам среди грамотрицательных патогенов. В общей сложности эти интегроны приобрели и распространили более 130 различных генов устойчивости к антибиотикам. В связи с продолжающимся использованием антибиотиков, интегроны класса 1 стали повсеместно использоваться в комменсалах и патогенах человека и его домашних животных. Как следствие, теперь их можно найти во всех потоках жизнедеятельности человека, где они продолжают приобретать новые гены и имеют потенциал возвращаться к человеку через пищевую цепь. В этом протоколе подробно описывается оптимизированный подход к обнаружению интегронов класса 1 и связанных с ними кассет с генами устойчивости в пищевых продуктах с использованием культивирования и ПЦР. Используя этот протокол, исследователи должны иметь возможность: собирать и подготавливать образцы для получения обогащенных культур и проводить скрининг на наличие ингронов класса 1; изолировать одиночные колонии бактерий для идентификации интегрон-положительных изолятов; выявить виды бактерий, которые содержат ингроны класса 1; и охарактеризовать эти интегроны и связанные с ними генные кассеты.

Введение

Открытие антибиотиков был одним из величайших научных достижений 20-го века. Тем не менее, использование и злоупотребление антибиотиками привело к быстрой эволюции, устойчивых к антибиотикам бактерий, и они в настоящее время представляют собой серьезную угрозу для общественного здоровья в 21-м веке. Рост бактериальных штаммов, устойчивых к большинству вариантов лечения повышает возможность мы вступаем в эпоху, когда противомикробные препараты уже не эффективны 1,2.

Генетический механизм, который придает устойчивость к антибиотику является древняя система, предшествовавшие людей и антибиотиков давление отбора миллионы лет 3. Мобильные генетические элементы, такие как плазмиды, транспозонов, геномных островов, интегративных конъюгативных элементов и интегронов может распространять гены устойчивости к антибиотикам (ARG) как внутри, так и между видами бактерий 4. Из них интегронами сыграли центральную роль в распространении ARG, несмотря наТо, что они полагаются на плазмид и транспозонов для мобилизации и введении в бактериальных геномов 5. Интегроны захватить генные кассеты, используя интегрон-интегразу, а затем выразить кассеты, используя интегрон закодированный промоутер 6,7 (рисунок 1). Интегрон гена кассеты небольшие подвижные элементы, состоящие из отдельных открытых рамок считывания (ORF), чьи продукты могут придают устойчивость к антибиотикам или дезинфицирующих средств 8. Класс 1 интегронами являются интегронами наиболее часто оправился от клинических изолятов 5, где они все вместе, приобретенных более 130 различных генов кассет устойчивость к антибиотикам 9.

Распространение класса 1 интегронов в синантропных и патогенных бактерий человека связанный генерирует потоки отходов человека, которые содержат большое количество этих генетических элементов 10. По оценкам 10 19 бактерий, которые содержат класс 1 Интегроны освобождены с помощью сточных вод каждый годп Великобритания 11. Поэтому не удивительно, что класс 1 интегронами придающие антибиотиков сопротивления в настоящее время обнаружены в микробиоты диких птиц, рыб и других 12-14 родной природы. Освобождение Интегроны обратно в окружающую среду представляет собой серьезную угрозу для общественного здоровья, так как приобретение новых кассет генов и сложных перестроек с другими мобильными элементами продолжает возникать, в частности, в очистных сооружениях и других водных 15-18. Природная среда становится плодородной вербовки новых детерминант резистентности и условно-патогенных микроорганизмов 19,20. Новые интегрон содержащих бактерии и новые АРГУМЕНТЫ можете круг обратно в человеческом сообществе через зараженную воду и пищу 21,22. Наблюдение окружающей среды аргументов является ключевой стратегией для понимания и управления устойчивостью к антибиотикам в будущем 23. В частности, внимание должно быть уделено пищевых продуктов, которые едят сырыми илислегка приготовленные, так как они представляют собой наибольшую угрозу для передачи новых мобильных элементов и патогенных микроорганизмов.

В этом протоколе, в упрощенном подходе для обнаружения, идентификации и характеризации класса 1 Интегроны и связанные с ними генетические кассеты в пищевых продуктах, изложены (рисунок 2). Использование комбинации культивирование и полимеразной цепной реакции (ПЦР), интегронами можно быстро обнаружить в сложных бактериальных сообществ и отдельных штаммов. Методы определения видов бактерий и конформации и идентичности интегрон связанный генных кассет даны. Этот метод пригоден для широкого круга растений и животных продуктов, и примеры типичных рабочих процессов приведены для каждого из этих типов пищевых продуктов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Продукты питания, которые едят сырыми или слегка приготовленные имеют наибольшую озабоченность для здоровья человека. Примеры включают в себя салат овощи, фрукты, моллюсков и ракообразных.

1. Сбор образцов

  1. Собирают образцы в условиях, которые сводят к минимуму загрязнения и храниться в отдельных, чистых мешках во время транспортировки. После сбора пробы должны храниться при температуре 4 ° С и обработан в течение 24 часов.

2. Обогащенный Культура Подготовка

  1. Фрукты и овощи:
    1. Поместите приблизительно 10 г материала в прочный пластиковый пакет. Если обработка больший материал, сосредоточиться на коже фрукта или овоща. Добавить 90 мл 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 и процесс в лопастной смеситель в течение 30 сек. Альтернативно, материал может быть вручную перемешивали при ГОМОГЕНИЗАТОР не доступен.
    2. Сбор жидкости в двух 50 мл пробирки Falcon. Центрифуга трубки на 4000 мкг в течение 7 мин для осаждения бактерий.
    3. Осторожно удалите супернатант и приостановить осаждали бактерии в 30 мл стерильной Лурия Bertani (LB) бульона.
    4. Инкубировать на шейкере O / N, держа одну трубку при 25 ° С, а другой при 37 ° С. Культуры должны быть встряхивают при 200 колебаний в минуту (OPM). Хранить культуры при 4 ° С до использования.
  2. Морепродукты:
    1. Рассеките из желудка (устрицы) или пищеварительный тракт (креветки) с помощью стерильного пинцета и пинцет и поместить в стерильную пробирку, содержащую 1,5 мл 200 мкл 0,1 М буфера фосфата натрия, рН 7,0. Размочите образец для создания гомогената.
    2. Разлить по 5 мл LB бульоне в двух стерильных 5 мл пробирки, и прививку каждый с гомогената морепродуктов.
    3. Инкубировать на шейкере O / N, держа одну трубку при 25 ° С, а другой 37 ° С. Культуры должны быть встряхивают при 200 OPM. Хранить культуры при 4 ° С до использования.

3. Скрининг Культуры для Интегроны

Примечание: Стандартные протоколы ПЦР используется в данном методологии, используя буферы, поставляемые с ферментом, и окончательный MgCl 2 концентрация 2,5 мм. При необходимости, Лоренц (2011) 24 наметил ПЦР оптимизации и устранения неполадок методы в ранней выпуске журнала.

  1. Вареные препарата ДНК:
    1. Распределить 100 мкл обогащенной культуры в стерильную 0,5 мл ПЦР-пробирку. Нагреть образец до 99 ° С в течение 10 мин, с использованием водяной бани или нагревательный блок. Привязать холод на льду в течение 2 мин.
    2. Микроцентрифуга при 14000 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток. Вернуться в лед. Образцы ДНК могут быть заморожены при температуре -20 ° С до тех пор, пока требуется, но должны быть оттаивали на льду.
  2. Скрининг 1 класса интегронов с помощью ПЦР:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанные культуры от O / N инкубации скрининг на 1 класса интегронов с использованием протокола HS463a / HS464 ПЦР (Таблица 1).
    1. Оттепель все реагенты ПЦР на льду, от любого потенциального суРЭЦ загрязняющих ДНК. Макияж 48 мкл ПЦР Mastermix за образец, в том числе отрицательных контролей (таблица 2). Разлить 48 мкл ПЦР мастер смеси в каждую пробирку, с помощью барьерных советы.
    2. Добавьте 2 мкл талой ДНК в отдельных ПЦР пробирок с использованием барьерных советы. Запустите соответствующую программу в амплификаторе ПЦР.
    3. Для оценки результатов амплификации, electrophorese 7 мкл продукта ПЦР на 2% агарозном геле налил и запустить в КЭ буфера (90 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТА). Включите маркер молекулярного веса, например, 100 п.н. лестницы.
    4. Сообщение окрасить гель с пятном ДНК, и визуализировать с помощью УФ-просвечивания. Убедитесь, что не было усиления в отрицательном контроле. Сильная полоса около 470 б.п. для любого конкретного образца показывает, что смешанная культура содержит бактерии, которые несут класс 1 интегрон. Чистые колонии теперь будут изолированы от любой смешанной культуре, вернулся положительный ПЦР.

4. Скрининг Моноколонии для класса 1 Интегроны

  1. Серийные разведения и распространения пластин:
    Примечание: Чтобы изолировать отдельных колоний из ПЦР-положительных смешанных культур, смешанную культуру серийно разводили в 10 раз в натрий-фосфатном буфере, а затем высевали восстановить отдельных колоний.
    1. Добавить 1 мл смешанной культуры с 9 мл фосфатного буфера 0,1 М натрия, рН 7,0 и смешивают с инверсией. Добавить 1 мл в разведении с другим 9 мл фосфатного буфера, и повторить, пока серийного разведения 10 -8 достигается.
    2. Распространение 100 мкл 10 -4 до 10 -8 разведения на LB-агар, в двух экземплярах. Инкубируйте пластин O / N при той же температуре, используемой для начальной смешанной культуры. Плиты затем можно хранить при 4 ° С до необходимости, однако лучше всего, чтобы обработать отдельных колоний довольно быстро.
  2. Одиночный выбор колонией и вареные препарата ДНК:
    1. Выберите отдельные колонии от серийных разбавления пластин, SEсборном, как много различных типов колоний как можно, используя такие критерии, как размер колоний, формы и цвета. Используйте стерильные зубочистки, чтобы выбрать отдельные колонии от распространения пластины.
    2. Нажмите зубочистку в колонию, а затем передать в ПЦР пробирку, содержащую 100 мкл стерильной воды. Если большое количество колоний должны быть экранированы, то колонии могут быть приготовлены в лоток для микротитрования. Спин зубочистку между пальцами, чтобы сместить некоторые из клеток в воду.
    3. Используя ту же зубочистку, прививку в LB пластины с полосой колонии. Большое число колоний могут быть сохранены на меченых пластин, если каждая полоса имеет длину около 1 см. Повторите шаги с 1 по 3 до тех пор, пока не будут выбраны соответствующее количество изолятов.
    4. Инкубируйте пластины LB O / N, при той же температуре, что и для начального обогащенного культуры. Культуры затем можно хранить при температуре 4 ° С до использования.
    5. Для получения ДНК из бактериальных суспензий, выполните следующие действия, как НУtlined в разделе 3.1. Для скрининга чистой культуры лизатов, выполните HS463a / HS464 ПЦР, как описано в разделе 3.2. Изоляты, которые возвращают положительный ПЦР будет использоваться для подготовки геномной ДНК (раздел 5), а для дальнейших анализов.

5. Геномная ДНК Добыча интегрон-положительные Моноколонии Использование бисера Избиение 25

  1. Привить 5 мл LB бульона с образцом чистого культуры изолированных в разделе 4.2. Инкубируйте O / N, встряхивая при той же температуре, которая была использована для первоначального обогащенного культуры.
  2. Пелле клеток при 4000 мкг в течение 7 минут, затем удалите супернатант. Ресуспендируют гранулированных клеток в 1 мл CLS-TC раствора в Лизирующий Матрица E быстро подготовительной трубы. Использование шарик избиение машины, обрабатывать образца при 5,5 м / сек в течение 30 сек.
  3. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 5 мин и восстановление 700 мкл супернатанта в стерильную пробирку 1,5 мл.
  4. Добавить 700 мкл связывания матрицы разбавленного 1: 5 6 M Гуанidinium тиоцианат, и смешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин, отбросить супернатант.
  5. Добавить 800 мкл этанола соли промывка (70% этанола, 0,1 М ацетата натрия) и вихрь, пока осадок не будет полностью ресуспендировали. Промыть в течение 5 мин при комнатной температуре, центрифуге при 14000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант. Убедитесь, что все супернатант был удален с помощью микропипетки, если это необходимо, а затем позволить высохнуть на воздухе в течение 5 мин.
  6. Ресуспендируют гранул матрицы в 200 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6) с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифуга при 14000 х г в течение 3 мин и передачи 160 мкл элюированной ДНК в стерильную пробирку. Запуск аликвоту геномной ДНК добычи на 2% вес / об агарозном геле, чтобы проверить выход и целостность экстракции ДНК. Очищенный геномную ДНК хранили при -20 ° С и размораживают на льду, когда требуется для тестирования ПЦР.

6. Диагностические ПЦР и секвенирования ДНК

Обратите вниманиегеномной ДНК, полученной в разделе 5 будет использоваться для всех диагностических ПЦР, и, чтобы подтвердить положительный тест для класса 1 интегронов.

  1. Оттепель геномной ДНК на льду, кратко вихрь образец ДНК и пульс спина при 14000 мкг в течение 20 сек. Повторите ПЦР для интегрон-интегразы гена класса 1 с использованием HS463a / HS464 (таблица 1), подтверждая, что изолят является положительным для 471 б.п. ампликона (раздел 3.2).
  2. Идентификация положительных культур в видовом уровне достигается путем анализа гена малой субъединицы рРНК (16S рДНК). Амплификации гена 16S с использованием праймеров F27 / r1492 (Таблица 1). Проверка продуктов ПЦР с помощью электрофореза. Все бактериальные показатели должны генерировать 16S ампликон около 1450 пар оснований.
  3. Последовательность гена рРНК 16S ампликон для определения идентичности видовой, но так как, скорее всего, будет несколько положительных МКП с шага 6.2, и многие из этих положительных будут те же виды бактерий, мы сначала выделить различные виды Усинг ограничение переваривание продукта ПЦР 16S.
    1. Дайджест аликвоту ПЦР 16S рестриктазой Hinf 1. Любой фермент, который распознает сайты 4 п.о. расщепления будет делать, но Hinf 1 генерирует хороший разнообразие от 16S целей, и надежным, недорогим фермент.
  4. Установите ограничение 30 мкл переварить Mastermix (таблица 2) в стерильную пробирку и добавить 20 мкл ООН-purfied 16S ПЦР продукта. Выдержите в 37 ° С водяной бане O / N. Проверьте дайджест на 2% агарозном геле.
  5. Оценка пищеварение структуры, созданные Hinf 1. Изоляты с той же 16S профиль рестрикции, вероятно, будут того же вида. Вместо секвенирования каждый продукт 16S ПЦР, последовательность в большинстве трех представителей от каждой Hinf 1 рестрикционной.
  6. Очищают продукты 16S ПЦР с использованием коммерческого набора. Одноцепочечной комплект экзонуклеазная может быть использован, но колонна основе или методы осаждения также работать хорошо, чтобы удалить unincorporated грунтовки и Однонитевые ДНК. Последовательность ампликоны 16S с использованием праймера R910 (таблица 1), настройка реакции, как указано секвенирования объекта.
  7. Используйте полученную последовательность ДНК, чтобы допросить базы данных ДНК NCBI с функцией BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Более 97% идентичность нуклеотидов, как правило, принимаются в качестве идентичности видов.

7. Отображение и характеристика Интегроны и кассетные массивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Класс 1 интегронами исходящие от экосистем человека преобладают, скорее всего, наиболее распространенными интегронами во всех ваших образцов. Все эти интегронами есть недавний сингл происхождение, и, следовательно, имеют весьма консервативную последовательность ДНК 5.

  1. Различать класса 1 Интегроны исходящие от человека и те, которые встречаются в природе в пробах окружающей среды, выполняяПЦР с набором праймеров intI1F165 / intI1R476 10 (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Класс 1 интегронами клинических или синантропных бактерий будет генерировать б.п. продукт ~ 300, в то время как экологический класс 1 интегронами не будет генерировать любой продукт.
  2. Охарактеризовать клинические Интегроны путем усиления массив кассеты с набором праймеров HS458 / HS459. Это ПЦР усилится область между intI1 и консервативной сегменте 3 'в конце большинства массивов кассету. Поскольку число и идентичность кассет является переменной, размер ПЦР-продукта будет также изменяться.
  3. Очищают ампликоны и секвенирования ДНК с использованием каждого из праймеров для амплификации. Используйте последовательности допросить базы данных ДНК, используя функцию BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Убедитесь, называя кассет следовать стандартной номенклатуры 9, так как многие отложений данных генной кассеты интегрон• Используйте противоречивые или неоднозначные имена. Уделять особое внимание к новым генных кассет, так как они могут кодировать новые фенотипы, в том числе генов, которые придают увеличилось передаче, патогенность или вирулентность 8,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доклинические формы класса 1 интегрона еще циркулируют в природных средах. В частности, те, которые связаны с активными Тп 402 транспозонов наибольший интерес 26. В кассетные массивы этих интегронов не будет усиливать с набором праймеров HS458 / HS459, но может быть усилен с набором праймеров MRG284 / MRG285 (таблица 1), генерации ампликонов переменного размера в зависимости от содержания кассеты. ПЦР-продукты должны быть очищены и ДНК последовательность, как указано в 7.2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Скрининг смешанных культур и бактериальных изолятов intI1

Набор праймеров HS463a / HS464 ПЦР может быть использован для обнаружения присутствия интегрон-интегразы гена класса 1, intI1 (рис 1). Это набор праймеров хорошо работает для обнаружения intI1 в смешанных культурах, а также используется для скрининга бактериальных колоний найденным распространенных пластин (рис 2). Положительные изоляты должны генерировать одну сильную полосу на 471 п.о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выявление интегронов и связанных с ними генов кассет потенциально важным шагом в прогнозировании возникновения новых патогенных возбудителей, отслеживание пути для патогенов в пищевой цепи человека, а также выявление новых сопротивление и вирулентности детерминанты 8,21,26. Целью данной работы было описать рациональный подход для скрининга образцов для 1 класса интегронов, характеризующие их массивы кассетные и идентификации видов бактерий, в которых они проживают. Критические шаги в протоколе привлекать хоро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего разглашать соответствующую.

Благодарности

Благодаря Микаэла зале, Лариса Bispo и Густаво Таварес для технической помощи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
GoTaq Colourless MastermixPromegaM7132Используется во всех ПЦР
РНКаза (рибонуклеаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скота)SigmaR6513-10MGИспользуется во всех ПЦР
Фермент рестрикции HinFIPromegaR6201Используется для расщепления 16S рДНК ПЦР-продуктов. Фермент поставляется с оптимальным буфером и лестницей BSA
100 bp GEHealthcare27400701Используется в качестве стандартного размера на всех агарозных гелях
GelRed DNA красительBiotium41003ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты
Guanidinium thiocyanateLife TechnologiesAM9422ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты
CLS-TC РастворMP Biomedicals6540409Ресуспензионный раствор, используемый в начале геномной экстракции ДНК
Lysing Matrix E FastPrep TubesMP Biomedicals116914500Tube, необходимый для механического разрушения клеточных стенок бактерий. Этот код используется для упаковок по 500 туб, доступны меньшие количества.
Связывающая матрицаMP Biomedicals116540408разведена в соотношении 1:5 с 6 М тиоцианатом гуанидиния и использована в методе экстракции геномной ДНК.
Машина Fast PrepMP BiomedicalsКоличество доступных опцийMP Biomedicals имеет ряд машин FastPrep, доступных для покупки. Посетите http://www.mpbio.com для получения дополнительной информации

Ссылки

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4(2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865(2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017(2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.