Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс

23.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52908

⸱

27 июля 2015 г.

 ,  , 
1Department of Medicine/Cardiology, Gazes Cardiac Research Institute, Medical University of South Carolina, 2Ralph H. Johnson VA Medical Center, Medical University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Изолированное сердце крысы является устойчивой моделью ишемического реперфузионного повреждения. Здесь мы описываем процесс забора работающего сердца у крысы с помощью канюляции аорты in situ, перфузии сердца по Лангендорфу, симуляции ишемии-реперфузионного повреждения и окрашивания инфарктом, чтобы подтвердить степень ишемического повреждения.

Аннотация

Биохимические события, связанные с ишемическим реперфузионным повреждением в условиях обострения, имеют большое значение для продвижения новых вариантов лечения инфаркта миокарда и сердечных осложнений торакальной хирургии. Способность некоторых препаратов предупреждать миокард против ишемического реперфузионного повреждения привела к многочисленным клиническим испытаниям с небольшим успехом. Модель изолированного сердца позволяет в режиме реального времени наблюдать за функциональными эффектами ишемического реперфузионного повреждения, включая эффекты различных фармакологических вмешательств, применяемых в любой момент времени до или в пределах окна ишемического реперфузионного повреждения. Поскольку короткие периоды ишемии могут предварять сердце к ишемическому повреждению, проводится канюляция аорты in situ, чтобы обеспечить функциональную оценку непредобусловленного миокарда. Баллон, наполненный физиологическим раствором, помещается в левый желудочек для измерения выработки давления в режиме реального времени. Ишемическое повреждение моделируется прекращением потока перфузионного буфера с последующей реперфузией. Продолжительность как ишемии, так и реперфузии может быть модулирована для изучения биохимических событий в любой момент времени. Несмотря на то, что модель изолированного сердца Лангендорфа не позволяет рассматривать системные события, влияющие на ишемию и реперфузию, она является отличной моделью для изучения острых функциональных и биохимических событий в рамках ишемического реперфузионного повреждения, а также влияния фармакологического вмешательства на пре- и посткондиционирование сердца. Цель этого протокола — продемонстрировать, как выполнять канюляцию аорты in situ и иссечение сердца с последующей ишемией/реперфузионным повреждением в модели Лангендорфа.

Введение

Выяснение событий, лежащих в основе сердечной ответ на оба ишемии и реперфузии имеют важное значение в улучшении лечения инфаркта миокарда и сердечной 1 хирургических процедур, которые требуют пережатия аорты 2. В то время как модели в естественных условиях ишемии реперфузионного повреждения позволяют очень полезный анализ конечной точки, они не столь эффективны для изучения функциональных последствий ишемии реперфузионного повреждения остро в режиме реального времени. Кроме того, в естественных условиях модели ишемии реперфузии обычно производят значительное изменчивость размера инфаркта, и прямые поставки препарата к сердцу во время реперфузии является сложной задачей. Использование сердечного системы Лангендорфа изолированы для изучения ишемии реперфузии позволяет в реальном времени функциональной оценки фармакологической терапии, равномерной площади инфаркта ткани и мгновенной доставки лекарственного средства непосредственно к миокарду.

Впервые описан бу Оскара Лангендорфа в 1895 3, Лангендорфа изолированные сердце надежный моделью для изучения ишемии реперфузии, что оно использовалось в ишемии реперфузии исследований за последние 40 лет 4,5. Вот некоторые изменения сделаны для оптимизации изолированного сердца для функционального анализа. В месте пункции аорты, а сердце бьется гарантирует, что сердце не испытывать ишемический предварительной подготовки, которая бы изменить результаты ишемии реперфузии испытаний 6. Чтобы облегчить это, трахеотомия выполняется, позволяя вентиляции и обеспечения физиологической стабильности крысы во время операции. Сердце затем прикрепляется к водяной рубашкой спиральной стеклянную колонку, через которую Кребса Хенселейта буфер доставляется по ретроградной перфузии непосредственно в аорту. Солевой раствор на баллон, заполненный вставлен в левый желудочек и прикреплен к датчику давления, который позволяет в режиме реального времени измерения давления внутри желудочка ANд расчет нескольких функциональных параметров. По завершении эксперимента, сердца промывают холодной солевой раствор, чтобы задержать сжатие и мгновенно замораживали в жидком азоте, чтобы позволить потоку анализ ДНК, РНК и белка уровней. Таким образом изменен, Лангендорфа перфузии сердца служит эффективной системы прямого мониторинга физиологического эффекта фармакологических вмешательств в любое время остро во время ишемии реперфузии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, перечисленные здесь были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в институциональная в Медицинском университете Южной Каролины. Эксперименты, описанные здесь, являются острые, эксперименты, не выживания. Таким образом, нет никакой пользы глазной мази и стерильные операционные люкс не требуется. Эвтаназии достигается путем обескровливания при уборке сердца.

1. Экспериментальная Подготовка

  1. Установите или постоянное давление или постоянная потока Лангендорфа перфузии устройства 4.
  2. Подготовьте 4 л модифицированного Krebs Хенселейта буфера (в мм: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-глюкозы, 0,2 октановой кислоты, рН = 7,4).
    1. Сделать 10x акции буферов.
      1. Растворите NaCl, KCl, MgSO4 и K 2 HPO 4 в 3 л воды высшей степени очистки.
      2. Растворите CaCl 2 в 500 мл сверхчистой воды Wiго по 40 мл 1 н HCl.
      3. Медленно добавить раствор CaCl 2 в буфер, сделанные в 1.2.1.1. Добавьте достаточно сверхчистой воды с всего 4 L. Разрешить перемешивают в течение 1 ч перед фильтрацией через фильтр 0,8 мкм. Хранить при 4 ° С.
      4. Растворите NaHCO 3 в 4 л воды высшей степени очистки. Разрешить перемешивают в течение 1 ч перед фильтрацией через 0,8 мкм фильтр. Хранить при 4 ° С
    2. Комбинат 400 мл 10x Кребса Henseleit буфер 400 мл 10x NaHCO 3 буфера. Добавьте достаточно воды, чтобы сверхчистого Всего 4 L. Растворите глюкозу и кислоты октановую при перемешивании. Фильтр по 0,8 мкм фильтр.
  3. Подготовка системы к сердцу.
    1. Добавить 2 л фильтрованной буфером до 4 л бутылки помещают в 38 над запорным краном, прикрепленной к аорты канюли. Это обеспечит давление перфузии 70-80 мм рт.ст. к сердцу, что рекомендованное давление перфузии 4.
    2. Вставка для диспергирования газа барботер в буфер в бутылке.
    3. Запуск буфер через систему, будучи уверенным, чтобы устранить любые пузыри изнутри трубы.
    4. Включите газа (95% O 2/5% CO 2) по крайней мере, за 30 мин до сердца должен быть размещен в системе. Используйте зонд потока газа и газоанализатор крови, чтобы проверить насыщение кислородом.
  4. Подготовка хирургические материалы и воздушный шар.
    1. Для уборки сердца, подготовить одну пару 6,75 "хирургическими ножницами, одну пару 4,5" ножницы, две пары кровоостанавливающих, два набора щипцов, карамельный Два шприцы с иглами 27 G, 2 части 0-GUAGE шелковой нити (около 15 см в длину), один 1/16 дюйма колючей канюли, и один трахеи канюли.
    2. Чтобы собрать трахеи канюли, клей короткий кусок 1/16 дюйма диаметр пластиковой трубки к Y-разъем.
    3. Чтобы собрать шар аппарат: приложите через зонд иглу с куском 1/16 дюйма трубки, затем приложите трубку к корпусу датчика давления. Небольшой шприц прикреплен к другой стороне TR давленияansducer жилья позволит инфляции и дефляции баллона.
      1. Вырезать квадрат полиэтиленовой пленкой и место кончике иглы через зонд в центре. Оберните полиэтиленовой пленкой вокруг зондового иглы.
      2. Заполните шар с физиологическим раствором и галстук с двумя швами. Накачать шар, чтобы убедиться в отсутствии утечек. Объем физиологического раствора в надутого воздушного шара должно быть около 200 мкл, но может варьироваться в зависимости от размера крысы.
      3. Кроме того, используйте латекс палец кроватки в месте пластиковой пленкой. Поместите иглу через зонд в палец кроватки, залейте раствором и галстук.

2. Урожай сердце

  1. Задержите крысу Спрэг Dawley, используя decapicone или другое устройство ручной сдержанность. Взвесьте крысы.
  2. Администрирование кетамин / ксилазин смеси (0,85 мг / кг кетамина и 0,15 мг / кг ксилазина) с помощью внутрибрюшинной инъекции для анестезии крыс. Эта доза анестетика обеспечит достаточные для анестезии20-40 мин, но процедура должна быть завершена как можно быстрее после анестезии подтверждается.
  3. Подтвердите должной степени анестезии путем тестирования пальца щепоткой рефлекса.
  4. Трахеотомия
    1. Удалить шкуру с середины передней лапы до основания челюсти, используя кровоостанавливающих поднять шкуру и ножницы, чтобы сделать разрез. Держите шкурку повышенной отделить его от основной мышцы, позволяя сократить по шкуре и снимите его.
    2. Использование кровоостанавливающих, поднимите железистой ткани и сделать горизонтальный разрез в фасции уступает железистой ткани. Используйте кровоостанавливающих распространяться разрез открытым, стараясь не ник яремной вены.
    3. Использование кровоостанавливающих, щепотка мышцы вышележащих трахеи и с помощью ножниц сделать поперечный разрез в мышце чуть ниже кончика кровоостанавливающих. Использование кровоостанавливающих, распространение ткань на части, чтобы раскрыть трахеи.
    4. Осторожно вставьте кровоостанавливающих под трахеи, очистка фасции, а прогрессирует, осторожно вперед и втягивания кровоостанавливающих.
    5. После кровоостанавливающих успешно размещены позади трахеи, щепотка 0-0 шелковый шов с кровоостанавливающих и hemisect трахеи с небольшим, острой парой ножниц.
    6. Вставьте трахеи канюли в трахее hemisected, тянуть нить за трахеи и связать нить вокруг канюлированного трахеи, закрепления шва в Y-пах канюли с хирургами узел.
    7. С помощью иглы 27 G, вводят 1000 ЕД / кг гепарина в яремную вену и позволяют распространить в течение 30 сек.
  5. Торакотомия
    1. Удалить шкуру с середины живота к середине передней лапы области, зажимая с кровоостанавливающих и резки с ножницами.
    2. Сделайте ¾ дюйма поперечный разрез в брюшной стенке мышечной, чуть ниже диафрагмы.
    3. Сделайте вертикальный разрез до брюшной стенки и грудной стенки, резки вдоль грудины.
    4. Вырезать диафрагму назад на двусторонней основе, затем распространилась грудную клетку, чтобы выявить сердце, зажим грудную клетку с кровоостанавливающих чтобы убедиться, что он остается распространение.
    5. Использование кровоостанавливающих, аккуратно удалите тимус, обнажая восходящую аорту.
    6. Дразнить кровоостанавливающих через аорты петли, продвижении и втягивания кровоостанавливающих и осторожно распространяя фасции, чтобы кончик кровоостанавливающих через.
    7. Используйте кровоостанавливающих тянуть 0-0 шелковый шов за восходящей аорты, галстук шов в свободную половину квадратных узла.
    8. Поверните кран, чтобы начать поток перфузии буфера, hemisect аорты и сразу вставить канюли в просвет аорты. Быстро подпруга половину квадратных узел и завершить узел, затянув тщательно.
    9. Используйте ножницы, чтобы рассекать сердце от больших сосудов, удалить сердце из груди и приложить к колонке перфузии.
    10. Обрезать излишки ткани легких и позволить, чтобы уравновесить сердца на колонке в течение 15 мин до введения баллона. Использование нормальную скорость потока буфера через сердце 10-20 мл / мин.

3. Лангендорфа перфузии и ишемии реперфузии

  1. Размещение предварительно LVssure шар
    1. Выпустите шарик при прокатке в форме конуса и повернуть кран, чтобы обеспечить воздушный шар остается спущенный.
    2. Акцизный левого предсердия с небольшим ножницами, чтобы разоблачить доступ к митрального клапана.
    3. Вставьте шар через левое предсердие и митрального клапана в левый желудочек.
    4. Начните программное обеспечение для мониторинга давления (LabChart Pro).
    5. Накачать шар, открыв кран и аккуратно увеличивая количество физиологического раствора в воздушном шаре, пока диастолическое давление чтение микроманометром больше нуля.
    6. Чтобы проверить реакцию длины натяжения, надуть воздушный шар медленно диастолического давления 75 мм рт.ст., выкачать медленно, повторяю еще.
    7. Установка диастолическое давление до 10 мм ртутного столба, модулируя количество физиологического раствора в баллоне. Поверните кран, чтобы запечатать воздушный шар на этом уровне инфляции, и поддерживать систему замкнутого давления между ЛЖ и воздушном шаре датчика давления.
    8. Нижняя сердце в нагретую камеру и крышкой камеры с пластиком.
  2. Объявлениеслужение ишемии реперфузии
    1. Вставьте нижнюю часть нагретой камере и позволяет камере, чтобы заполнить буфер изливаемой.
    2. Когда буфер погружен сердце, включите кран, чтобы остановить поток буфера в сердце, вызывая глобальное ишемии. Время ишемии может варьироваться в зависимости от целей эксперимента.
    3. Через 30 мин ишемии, повернуть кран, чтобы восстановить поток буфера в сердце, начала реперфузии.
    4. Разрешить реперфузии сердца в течение 1 ч до прекращения эксперимента. Используйте переменные раз реперфузии, в зависимости от целей эксперимента.
  3. Прекращение эксперимента и сбор урожая ткани
    1. Использование боковой порт краном, администрирование 10 мл фосфатно-буферного раствора при 4 ° С в сердце со скоростью 10 мл / мин, чтобы остановить сердце.
    2. Удалить сердце из колонки перфузии, обрежьте остальные предсердия ткани.
    3. Поместите сердце в нержавеющей стали ткани нарезки матрицы, накрыть Паrafilm, и место при -80 ° С в течение 8 мин, или пока сердце имеет консистенцию зефира, как.
    4. Удалить блок из морозильника и вставьте бритвы в матрицу нарезки нарезать сердце в 2 ломтика мм. Тканевые блоки также могут быть приобретены с другими, чем 2 мм размеров срезов.
    5. Удалить ломтиками по одному и падение в жидкий азот, чтобы заморозить мигать для биохимических исследований. Сохранение третий желудочка ломтик от вершины для окрашивания инфаркта.
    6. Удалите ткань из жидкого азота и хранят при -80 ° С до использования в биохимических экспериментов.
  4. Инфаркт Окрашивание
    1. Инкубируйте третий кусочек желудочка в 10 мл 1% вес / объем хлорида трифенилтетразолинхлорида (TTC) при 37 ° С в течение 15 мин.
      Примечание: Инкубационный в ТТС может быть выполнена в течение 15 или 30 мин без изменения эффективности 15.
    2. Передача ткани кусочек от TTC до 10% забуференном формалине и позволяют инкубировать при комнатной температуре в течение ночи. Для получения оптимальных результатов, слышатьTS должны быть вывезены из формалина и отображаемого в течение 24 часов 4.
    3. Фотография окрашенных кусочек и использование программного обеспечения, таких, как ImageJ оценить размер инфаркта в соответствии с протоколом производителя. Фотографировать, как можно скорее после фиксации, а краска будет исчезать с течением времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Желудочка баллон аппарат левой позволяет мониторинга в режиме реального времени в разработанной заказчиком левого желудочка (рис 1) давления. Как описано выше 7, это давление трассировки может быть использован для вычисления многих параметров функции левого желудочка. Эти расчеты могут быть сделаны в базовой фазе, а также на этапе реперфузии, усредненное по несколько следов в каждой группе, и по сравнению с тем, чтобы определить, приводит ли фармакологическое вмешательство в сердечной предвар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изолированных перфузии сердца крысы могут быть успешно использованы для изучения влияния фармакологического вмешательства на сердечную предварительной ишемии реперфузии 9. Тем не менее, существуют некоторые существенные шаги по процедуре, которые должны быть стандартизированы, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. Поддержание температуры 37,4 ° C в системе является критическим, так как даже гипотермию и гипертермии может привести к остановке предварительной подготовки 10,11. Общее время, кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта публикация была поддержана Южная Каролина Клиническая и трансляционных исследований (SCTR) института с академической дома в Медицинском университете Южной Каролины, NIH / NCATS Грант Количество UL1 TR000062. Дальнейшая поддержка была предоставлена ​​В.А. заслуга премии BX002327-01 к DRM. DJH поддержали NIH / NCATS Грант Количество TL1 TR000061 и NIH Grant Номер T32 GM008716. СЭО поддержали NIH Grant Номер T32 HL07260.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigma AldrichS3014
Хлорид калияSigma AldrichP9541
Сульфат магнияSigma Aldrich203726
Фосфат калия ДиосновныеSigma AldrichRES20765-A7
Дигидрат хлорида кальцияSigma AldrichC8106
Sodium БикарбонатSigma AldrichS5761
D-глюкозаSigma AldrichG8270
Октановая кислотаSigma AldrichC2875
2,3,5-трифенилтетразолия хлоридSigma AldrichT8877
Медицинский преобразователь давленияMEMSCAPSP844
Перистальтический насос MasterflexCole ParmerEW-07521-40
Головка насоса Masterflex с легкой нагрузкойCole ParmerEW-07518-10
Нагреваемая циркуляционная водяная баняLaudaM3
Модуль потока трубокTransonicTS410
Модульная исследовательская консольTransonicT402
Встроенный датчик расходаTransonicME2PXN
PowerLab Устройство сбора данныхADInstruments PL3508
LabChart Программное обеспечение сбора данныхAD InstrumentsMLU60/8

Ссылки

  1. Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
  2. Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
  3. Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
  4. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  5. Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
  6. Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
  7. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
  9. Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
  10. Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
  11. Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts--a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
  12. Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
  13. Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  14. Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  15. Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
  16. Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
  17. Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA,, Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
  18. Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Перфузия сердца по Лангендорфуканюляция аортымониторинг желудочкового давленияишемическое прекондиционированиевведение баллонапоток перфузионного буферасимуляция глобальной ишемииоценка реперфузионного поврежденияфункция левого желудочка
Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.