Легким и эффективным Подготовка Tri-компонентов флуоресцентных гликополимеров помощью плот контролируется полимеризации

Краткое содержание

Продемонстрирован эффективный трехступенчатый синтез флуоресцентных гликополимеров на основе RAFT, состоящий из получения гликомомера, сополимеризации и последующей модификации. Этот протокол может быть использован для получения статистических гликополимеров на основе RAFT с желаемой структурой.

Аннотация

Синтетические гликополимеров инструментальные и универсальные инструменты, используемые в различных биохимических и биомедицинских исследований полей. Пример легким и эффективным синтеза хорошо контролируемых флуоресцентные статистических гликополимеров с использованием обратимого присоединения-фрагментации переноса цепи (RAFT) основе полимеризации продемонстрирована. Синтез начинается с подготовки β-галактозы содержащие glycomonomer 2-lactobionamidoethyl метакриламида полученной реакцией lactobionolactone и N - (2-аминоэтил) метакриламида (AEMA). 2-Gluconamidoethyl метакриламид (GAEMA) используется в качестве структурного аналога хватает терминала β-галактозид. Ниже РАФТ-опосредованной реакции сополимеризации включает три различных мономеров: N - (2-гидроксиэтил) акриламид в качестве спейсера, AEMA в качестве мишени дл дальнейшего маркировки флуоресценции, а glycomonomers. Устойчивость к воздействию водных системах, плота агент, используемый в реакции (4-cyanopentanoic кислота) -4-dithiobenzoate.Низкие дисперсности (≤1.32), предсказуемые композиции сополимера, и высокая воспроизводимость полимеризации наблюдается среди продукции. Люминесцентные полимеры получают путем модификации гликополимеров с карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфира таргетирования первичный амин функциональные группы на AEMA. Лектин-связывающий особенности получаемых гликополимеров проверяются путем тестирования с соответствующими бисером агарозы, покрытых конкретных glycoepitope признания лектинов. Из-за легкости синтеза, жесткий контроль составы продуктов и хорошую воспроизводимость реакции, этот протокол может быть переведен в направлении получения других плота на основе гликополимеров с конкретным структурам и композициям, как хотелось бы.

Введение

В последние два десятилетия, исследования с синтетическими гликополимеров прошли медленный, но постоянное развитие, демонстрируя значительный потенциал в изучении инфекционных механизмы, которые включают исследования, которая фокусируется на лектин признание процессов ^1-3. Так синтетические гликополимеров обладающие мультивалентные сахара фрагменты демонстрируют гораздо более высокие лектин-связывающий эффективностями, по сравнению с одновалентных углеводов, они пользуются большим спросом в области Glycobiology ^3. Особый интерес в области клинических исследований является использование флуоресцентных гликополимеров охарактеризовать лектин-опосредованного связывания бактериальных с углеводами, доступных на поверхностях человека дыхательных клеток и слизистой гликопротеина. В начале пробирке исследования использованы коммерчески доступные на основе полиакриламида гликополимеров в бактериальных обязательных тестов. Некоторые из этих зондов показали многообещающие результаты, но выразили обеспокоенность относительно, obtainability и много-много-к дисперсий в обоих PolYmer молекулярная масса и содержание glycoepitope. Экономичный протокол в лаборатории-был разработан, который будет обеспечивать для удовлетворительного контроля содержания структуры, размера и чистоты синтетических гликополимеров ориентированных бактериальных лектинов.

В поисках подходящего синтетического подхода к гликополимеров, относительно новый метод полимеризации был протестирован с использованием типа контролируемой радикальной полимеризации, что используемый обратимым дополнение фрагментации цепи передачи (плот) агентов ^4. Такие реагенты RAFT недавно были использованы в нескольких glycopolymer препаратов ^5-7. По сравнению с другими протоколами подготовки glycopolymer, плот опосредованной полимеризации демонстрируют несколько преимуществ, в том числе устойчивостью к различным мономерных структур и условий реакции, потенциальной совместимости с водными растворами, и маленький размер дисперсности желаемых полимерных продуктов ^8,9. Из заметных интересных протоколы для подготовки плот баSED Tri-компонент гликополимеров, что позволяет контролировать композиций различных мономеров, каждый из которых может иметь различные функции ^10-13. Тем не менее, большинство из предыдущих исследовательских усилий либо не было аномерные боковые углеводы ^10, или применяться вышел полимеризации в результате три-блок-сополимеров, которые состоят из ковалентно связанных гомополимеров, которые часто служат для разных целей, чем статистических полимеров, которые представляют собой сополимеры, в которых последовательность мономера остатки следовать статистической правило ^9-13.

Недавно, применяя thiocarbonylthio RAFT соединение (4-cyanopentanoic кислота) -4-dithiobenzoate в водной среде, подготовка группы плота на основе линейных три--компонент статистические гликополимеров содержащие специфические боковые сахаров и их применение в лектин-опосредованного связывания бактериальной Тесты сообщалось ^14. Общая цель этого способа, представленного в визуальной форме, чтобы подготовить три-компонентстатистические люминесцентные гликополимеров через плот контролируемой сополимеризации. Из-за простоты протокола полимеризации одностадийного, в порядке контроля по длине полимерной композиции и, и высокой воспроизводимости реакции, этот протокол может быть легко применены к другим плот на основе синтеза гликополимеров с заданными структурами.

Протокол

1. Синтез Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl метакриламида

1. Растворите 2 г лактобионовой кислоты в 3,0 мл безводного метанола и медленно добавить абсолютного этанола в каплям моды, пока раствор не станет просто облачно, затем удалить растворители с помощью роторном испарителе.
2. Остаток растворяют с шагом 1.1, 3.0 мл в безводном метаноле и снова, медленно добавить абсолютного этанола, пока только Облачно, то испаряются растворители помощью роторном испарителе. Повторите этот шаг 3 раза, чтобы получить lactobiono-1,5-лактон (1,94 г, выход 98%). Этот продукт имеет достаточную чистоту, чтобы быть использованы в следующих реакций.
3. Добавить 1,0 г lactobionolactone в 3,0 мл метанола с N - (2-аминоэтил) метакриламид (AEMA, 0,58 г) и монометиловый эфир гидрохинона (MEHQ, 1,0 мг), ингибитор полимеризации себя, в 2,0 мл метанола, с последующим по 1,0 мл триэтиламина. Перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч.
4. Добавьте 20 мл деионизированной H ₂ O (DH ₂ О) в реакционную колбу, а затем удалить метанол и бесплатный триэтиламин путем выпаривания досуха с помощью роторном испарителе.
5. Для удаления остатков кислоты лактобионовую, добавить 20 мл дН ₂ O, а затем пройти через водный раствор анионообменной колонке (ОН ^- форма, 10 мм х 20 мм) в приемной стакан, содержащий 1,0 мг МеГХ.
6. Удалить триэтиламин, полученный на этапе 1.5, путем выпаривания досуха с помощью роторном испарителе.
7. Добавьте 20 мл дН ₂ O и удаления непрореагировавшего AEMA медленно добавляя 1 мг аликвоты катионообменной смолы (Н ⁺ форма) до тех пор, не нингидрином реактивные материалы обнаружить. Монитор удаление путем принятия 1 мкл аликвоты раствора после каждого смолы того, применяя его к тонкослойной хроматографии пластине, а затем распыления пластины с 2% нингидрина в растворе этанола. При отсутствии синий цвет не наблюдается для разработки, когда пластина нагревается до 90 ° С в течение 1 мин, конечная точка была достигнута.
8. Фильтр решение через воронку из спеченного стекла, перевести фильтрата в пробирку, замораживание образца при -80 ° С, а затем лиофильной сушке.
9. Удалить MEHQ из образца путем растворения лиофилизированного материала в минимальном количестве метанола (~ 0,5 мл), затем добавить холодной безводного ацетона (-20 ° C, 15 мл), чтобы осадить продукт. Собирают осадок фильтрованием с использованием стекл нный фильтр, а затем сухой осадок в эксикаторе под вакуумом с получением 2-метакриламид (lactobionamidoethyl LAEMA) в виде не совсем белого порошка (0,94 г, выход 68%). Этот продукт имеет достаточную чистоту, чтобы быть использованы в следующих реакций.

2. Синтез мономера 2-Gluconamidoethyl метакриламида

Примечание: подготовка 2-gluconamidoethyl метакриламида (GAEMA), которые не обладают кулон сахар, была взята из опубликованной методом ^15.

1. Добавить 2,0 г AEMA растворенного в 10 мл метанола к растворуД-глюконолактон (1,6 г) в 30 мл метанола и при перемешивании медленно добавляют 1,6 мл триэтиламина.
2. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч.
3. Фильтр осажденного продукта с использованием стекл нный фильтр и промыть осадок три раза с 10 мл каждого из изопропанола, затем промыть 10 мл сухого ацетона. Сушат осажденный продукт в эксикаторе под вакуумом.

3. РАФТ Glycopolymer Синтез

1. Для удаления ингибитора MEHQ присутствующие в коммерческом N - (2-гидроксиэтил) акриламид (HEAA), добавляют 1 мл HEAA к 2 мл микроцентрифужных трубки с последующим добавлением 0,5 г наночастиц оксида алюминия. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 30 сек, и использовать верхний слой HEAA в следующей реакции.
2. Осторожно добавить 32,8 мг LAEMA (70,0 мкмоль), 1,7 мг (10,5 AEMA мкмоль) и 27,5 мкл (270 HEAA мкмоль), все растворяется в 0,4 мл дН ₂ O, чтобы хорошо очищенную 1 мл трубку Шленка, таким образом, имеющие monomэ молярное соотношение 20: 3: 77.
3. В параллельной реакции, с целью получения контроля полимеры, которые не обладают какой-либо кулон сахар, вместо использования LAEMA на шаге 3.2, заменить 21,4 мг GAEMA (70,0 мкмоль) в реакции.
4. К соответствующему Шленка (т.е. 3,2 или 3,3), последовательно добавляют 50 мкл ДМФА, содержащего 0,53 мг (4-cyanopentanoic кислоты) -4-dithiobenzoate (1,9 мкмоль, РАФТ агента) и 50 мкл ДМФА, содержащего 250 мкг 4,4'-azobis- (4-cyanovaleric кислота) (0,9 мкмоль, инициатор). Аккуратно перемешать палец нажатие.
5. Замораживание содержимое, содержащиеся в Шленка занято сухой лед: этанол ванну (75 г сухого льда в 100 мл этанола), применять вакуум в пределах 10-50 мторр, затем закройте клапан Schlenk и разрешить решение медленно разморозить до комнатной температуры , Повторите эту замораживания-размораживания эвакуировать цикл в два раза больше. Убедитесь, что все реагенты растворяются после последнего оттепели.
6. Поместите трубку Шленка в закрывающийся пластиковый баг, эвакуировать воздух мешок, а затем запечатать его. Передача пакет, содержащий трубку Шленка на водяной бане, предварительно нагретой при 70 ° С и выдержать в течение 24 часов.
7. Тщательно передачи решения в Шленка на подготовленную для диализа (MWCO = 3500), и диализ против дН ₂ O (10 х 2 л) в течение 24 ч, меняя ЦТ ₂ O каждый час в течение первых 8 ч. После диализа переноса образца из диализной трубки в пробирку, замораживание образца при -80 ° С, а затем лиофилизации его.

Примечание: Полученный статистический сополимер-метакриламид / акриламида (РМА) сополимеры, содержащие боковые 4- O -β-D-галактопиранозил-D-gluconamide (lactobionamide) (со стадии 3.2) или D-gluconamide (со стадии 3.3), соответственно, получены. Для удобства обсуждения, эти два гликополимеров сокращенно PMA-LAEMA и PMA-GAEMA, соответственно.

4. После модификации гликополимеров флуорофорами

1. Растворить 5,0 мг glycopolymer PMA-LAEMA или PMA-GAEMA содержащей ~ 0,9 мкмоль первичный амин функциональные группы в 0,9 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, 0,1 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН 7,5), соответственно.
2. Медленно добавляют 0,6 мг карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира в 100 мкл ДМФ в растворах с быстрым перемешиванием. Осторожно перемешать реакции в течение 16 ч в темноте при комнатной температуре.
3. В то время как в защищенном от света, загрузить образец в подготовленную диализной трубки (MWCO = 3500) и диализ против дН ₂ O (2 л) в течение 16 ч, меняя раствор для диализа каждый час в течение первых 8 ч. После диализа переноса образца из диализной трубки в пробирку, замораживание образца при -80 ° С, а затем лиофилизации его.

Примечание: После лиофилизации, флуоресцентные гликополимеров РМА-LAEMA-флуоресцеин и РМА-GAEMA-флуоресцеин, соответственно, получаются.

5. Характеристика Glyсополимеры

1. Определить количество средняя молекулярная масса (Мn), средневесовая молекулярная масса (M w) и дисперсность (M W / M п) гликополимеров на коммерческой системы ВЭЖХ, снабженной гель-проникающей хроматографии (ГПХ программного обеспечения), GPC Колонка подходит для молекулярного веса интерес, и детектором показателя преломления, с использованием 0,1 М Трис / 0,1 М хлорид натрия буфера (рН 7) в качестве элюента при скорости потока 0,6 мл / мин ^14. Используйте стандарты полиэтиленгликоля как стандарты молекулярной массы (MW: 200-1,200,000 г / моль).
2. Количественно фактических концентраций первичных аминов функциональных групп в гликополимеров ^16. Анализ Общее содержание углеводов синтезированных гликополимеров в соответствии с опубликованным методом ^17.
3. Выполните тесты структурного состава и чистоты LAEMA glycomonomers, GAEMA и гликополимеров PMA-LAEMA, PMA-GAEMA в D ₂ O ЯМР-спектроскопии ¹⁴,

6. Связывание тесты синтетической гликополимеров с лектина покрытием агарозном бисером

1. Добавить 1,5 мл PBS 50 мкл суспензии эритрина петушиный гребень лектин (ECL) -покрытие агарозном бисером, центрифуги при 300 мкг в течение 1 мин, и тщательно удалить и утилизировать супернатанта. Повторите этот шаг дважды, а затем ресуспендируют бусины в 0,5 мл PBS.
2. Добавить 3 мкг PMA-LAEMA-флуоресцеина или PMA-GAEMA-флуоресцеина (отрицательный контроль) в 6 мкл PBS к суспензии бисером и инкубировать смеси, в темноте, при комнатной температуре в течение 1 часа.
3. Промыть смеси с 1,5 мл PBS три раза, и ресуспендируют бусины в 0,2 мл PBS. Загрузите аликвоту (4 мкл) в хорошо на иммунофлюоресценции микроскопа, (с тефлоновым покрытием), накрыть покровным, и наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием FITC фильтр (длина волны возбуждения: 467-498 нм, длина волны излучения: 513- 566 нм) и цель 10X изучить связывание тон люминесцентные гликополимеров с бисером ^14.

Результаты

Синтез glycomonomer

Лактобионовая кислоты используется здесь в качестве примера для получения glycomonomers. Используя методы в первоначальном отчете о синтезе LAEMA ^11, наблюдались разнообразные выходы в подготовке с неудовлетворительной чистоты. Модифицированный метод очистки с помощью катионов и анионов смол обмена для удаления непрореагировавшего исходного материала предложил стабильный урожай продукта и высокой чистоты, что подтверждается ¹ H и ¹³ C-ЯМР-спектроскопии (рис 1).

РАФТ синтез glycopolymer и пост-модификация гликополимеров флуорофорами

В отличие от блок-гликополимеров приготовленных путем ступенчатых плота полимеризации, этот протокол один шаг сополимеризации обеспечивает равномерное распределение по всей glycomonomer основной полимерной цепи. В гликополимеров, показанные здесь, содержат 20% мол глycomonomer, 77% мол HEAA в качестве прокладки, и 3% мол AEMA в качестве мишени для почтовых модификаций (см рисунок 2). ¹ H- и ¹³ С-ЯМР-спектроскопии подтвердили структуры PMA-LAEMA и PMA-GAEMA (3 и 4). Как показано на рисунке 5, когда заговор против ГПХ элюирования профилей glycopolymer синтезированного без плот, и ПМА-LAEMA и РМА-GAEMA имеют низкие дисперсности, доказывая эффективность подхода плот. Как и ожидалось, PMA-GAEMA имеет М Н меньше, чем PMA-LAEMA из-за отсутствия PMA-GAEMA в кулон сахара. Анализ углеводов и первичный амин функциональные группы содержание плота гликополимеров показал, что соотношение мономеров в гликополимеров продукта соответствует стехиометрическому соотношению исходных мономеров, используемых в реакции полимеризации, плот опосредованной (Таблица 1). Это означает жесткий контроль мономера Compositioнс в синтезированных гликополимеров, как задумано.

Реакция первичного амина функциональных групп с активированными флуорофоров является широко используемым методом в мечения белков. Этот метод был использован здесь для обозначения очищенные гликополимеров с карбоксифлуоресцеина. После пост-модификацию, были получены флуоресцентные полимеры (Рисунок 6). Нет деградация меченных флуоресцеином полимеров в реакции не было обнаружено с помощью анализа ГПХ (данные не показаны).

Связывание испытания синтетических гликополимеров с лектин-покрытием агарозном бисером

Для оценки лектина специфичность связывания синтезированных гликополимеров, был использован лектин покрытием агарозные гранулы с известными углеводами специфичности связывания. Эритрина петушиный гребень лектина (ECL), использовали в экспериментах, имеет связывающую специфичность в отношении β-D-галактозида. 7А ясно показывает, что PMA-LAEMA-ФЗuorescein, который содержит β-D-галактозид как кулон углеводов, выставлены сильной связи с лектина ECL. В противоположность этому, отрицательное связывание с ECL на glycopolymer PMA-GAEMA-флуоресцеин, которое не обладает кулон сахар, показано на фиг.7В. Этот результат иллюстрирует эффективность связывания и аффинность синтезированного флуоресцентного glycopolymer.

Рисунок 1. Назначается ¹ Н- () и ¹³ С-ЯМР (б) спектры (D ₂ O) для LAEMA. (Эта цифра была изменена с Ван и др. ¹⁴⁾ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.

<р = класс "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда">
Рисунок 2. Схематическое изображение синтезе люминесцентные glycopolymer PMA-LAEMA, содержащей β-галактозид как кулон сахара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Назначенный ^1Н (а) и ¹³ С-ЯМР (B) спектры (D ₂ O) в течение РМА-LAEMA glycopolymer. (Эта цифра была изменена с Wang и др. ¹⁴⁾ PleaSE нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Назначенный ¹ Н- () и ¹³ С-ЯМР (Б) спектры (D ₂ O) для PMA-GAEMA. (Эта цифра была изменена с Ван и др. ¹⁴⁾ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.

Рисунок 5. гель-проникающей хроматографии следы плот основе PMA-GAEMA и PMA-LAEMA приготовлены с использованием и без RAFT агента. В отличие от PMA-LAEMA, полученным без RAFT агента (синий), RAFT- на основе ПМА-LAEMA (зеленый) имеет гораздо более низкую дисперсность (М ж / М п). РАФТ основе ПМА-GAEMA (красный) и РМА-LAEMA имеют схожие профили GPC, но первый имеет меньшую М Н из-за отсутствия каких-либо подвесные сахара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. РМА-LAEMA до и после пост-модификации с флуорофором. (А) по сравнению с белым немеченого glycopolymer (слева) трубки, меченных флуоресцеином РМА-LAEMA показывает сильный желтый оттенок (справа) трубки. (В) под действием УФ, не помечены РМА-LAEMA (слева трубки, 1 мг / мл в PBS) является темным и представляет без каких-либо флуоресценции, тогда как флуоресцентную метку PMA-LAEMA (справа трубки, 1 мг / мл в PBS) показывает сильный зеленая флуоресценция.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. эритрина петушиный гребень лектин (ECL) -покрытие агарозные гранулы связывают β-D-галактозид содержащий гликополимеров, а не тех, кто не обладая кулон сахар. () PMA-LAEMA-флуоресцеина (3 мкг) показали сильное связывание с ECL , тогда как в (B) PMA-GAEMA-флуоресцеина, который не обладает подвесные β-D-галактозид остатка, не показали связывания с лектина покрытием бисера. Масштаб бар = 100 мкм.

Таблица 1. Значения таргетинга синтетических параметров и фактических составов гликополимеров.) Ориентация значения, ценности, которыежелательно из продуктов; б) ДП, степень полимеризации; в) Н.А., не имеется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

	ДП б	Дисперсность	Фактическое содержание glycomonomers мол%	Фактическое содержание первичного амина мол%
Ориентация значения	100	<1.3	20	3
PMA-LAEMA	99	1.26	19	3.2
PMA-GAEMA	89	1.32	Н. С	2.7

Обсуждение

Легкий и эффективный протокол для плот основе три- компонент люминесцентных гликополимеров, с и без подвесного углеводов, и их использование в тесте лектин-связывания, будет показано в этом докладе. Протокол начинается с подготовки glycomonomers LAEMA и GAEMA. Через одностадийном плот контролируется сополимеризации, гликополимеров с воспроизводимым выходом, предсказуемой состава мономера и низкой дисперсности, получаются. После пост-модификации гликополимеров карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира, связывание полученной соответствующего флуоресцентного меченных glycopolymer легко проверяемым своей лектина специфичность связывания.

На начальных препаративных ступеньках glycomonomers, которые должны быть использованы в последующих синтезах glycopolymer, легко доступны лактобионовая кислота и глюконолактон были использованы. В теории, любые углеводы, представляющие интерес, из моносахаридов до сложных олигосахаридов, может быть Converted чтобы glycomonomers путем конъюгирования целевой сахара на первичной гидроксильной группы на С6 глюкозы. После окисления восстановительного остатка глюкозы, и ее последующей дегидратацией до лактона, продукт может затем быть легко взаимодействует с первичным амином в AEMA с образованием соответствующего glycomonomer. Дальнейшие примеры этому маршруту можно увидеть в недавнем докладе ^14. Следует отметить, что до начала любой стадии полимеризации, МеГХ, мощным ингибитором полимеризации, должен быть удален из всех мономерных и glycomonomer препаратов непосредственно перед использованием. Это легко достигается с помощью минимального количества метанола, чтобы растворить glycomonomer который обладает МеГХ затем сразу обработать его с ацетоном при температуре -20 ° С для осаждения ингибитора свободных продукт с высоким выходом.

Эфирное в какой-либо радикальной полимеризации схеме, внимание к деталям и чистоты мономера подчеркнул. Как это типично системы РАФТ полимеризации, состоит израдикальная источник, РАФТ реагент, мономер и растворитель. В этом визуализируется представления, система РАФТ полимеризации одного шага описано, что основное внимание на производство статистических сополимеров, полученных из реакционной смеси, обладающей три различных мономеров в водном растворе. Два отдельных плот опосредованной реакции представлены в которой один использует glycomonomer, обладающий кулон, невосстанавливающих углеводов конце (т.е. β-D-галактозы), а другой, обладающий полиола не связанного углеводного остатка. Общим для обоих плота-опосредованной реакции мономеры, имеющие особую гидроксильную группу, которая служит в качестве спейсера молекулу, а другой, обладающий свободного амина для пост-модификации с флуорофором амино-реактивного.

Так присутствии кислорода в реакционной смеси и наносит ущерб окружающей среде сплавляться-опосредованной полимеризации, его удаление проследить уровни легко осуществляется с помощью нескольких сублимационной Evaциклов cuate-оттаивания при сохранении реакционную трубку Шленка сосуд под высоким вакуумом.

Следует отметить, что молярное соотношение различных мономеров в реакции можно регулировать, как это необходимо. Кроме того, путем изменения количества плота агента, длина получаемых полимеров можно контролировать ^18. Тем не менее, молярное отношение плота агента инициатора всегда должно быть больше, чем два, чтобы обеспечить низкую дисперсность продукта. В этих условиях, эволюция сополимеризации устойчива и воспроизводимость реакции очень высока. Это, как говорится, маловероятно, что один получает совершенно равномерное распределение всех участвующих мономеров в пределах статистической сополимера, из-за их разной скоростью полимеризации. Характеризующие распределение различных мономеров в полимерной еще очень сложным.

Метод пост-модификация, представленная здесь, и проще, и amenablе с использованием более широкого выбора флуоресцентных меток, по сравнению с другими протоколами, применяемых к этикетке гликополимеров ^2,11. Они будут включать в себя многие из водорастворимых аминов-реактивного флуорофорами, квантовые точки, биотинами и другие. Связывания особенности синтезированных меченых, гликополимеров легко проверяемые с помощью лектинов с известными аффинности связывания. PMA-GAEMA, владевших не кулон сахар является подходящим отрицательный контроль. Гликополимеров с различными флуоресцентными метками, подготовленных по этому маршруту были успешно использованы в исследованиях лектин-опосредованного связывания бактериального ^14. Как представлено, это легким и эффективным подготовка статистических флуоресцентных гликополимеров должен обеспечивать большой потенциал для широкого круга исследований glycobiological.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Reagent
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516
D-Gluconolactone	Sigma-Aldrich	G2164
N-(2-гидроксиэтил) акриламид (HEAA)	Sigma-Aldrich	697931
Orange II Натриевая соль	Sigma-Aldrich	O8126
Гидрохинон монометиловый эфир (MEHQ)	Sigma-Aldrich	54050	Ингибитор полимеризации
N-(2-аминоэтил)метакриламида гидрохлорид (AEMA)	Polysciences, Inc	24833-5
Триэтиламин	Fisher Scientific	BP-616
Анионообменная смола IRN-78 гидроксид-форма, 80 меш	Sigma-Aldrich	10343-U
Катионообменная смола 50Wx8, 200 меш	Sigma-Aldrich	217514
Оксид алюминия, ~150 меш	Sigma-Aldrich	A1522	Type WN-6, нейтральный, класс активности Super I
нингидрин	Sigma-Aldrich	N4876	В испытании использовали раствор этанола 0,2% нингидрина
4-Cyano-4-(фенилкарбонотиоилтио)пентановой кислоты	Sigma-Aldrich	722995	агент RAFT
4,4′-Azobis(4-циановалеровая кислота)	Sigma-Aldrich	11588	Инициатор полимеризации
Карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир	Life Technologies	C1157
Erythrina Cristagalli покрытая лектином агарозная бусина	Vector Laboratories	AL-1143
Solvent
dH2O			Произведено системой очистки воды Barnstead, 18 мегаОм-см
Изопропанол	Fisher Scientific	A461-4	ACS или лучше
Метанол	Fisher Scientific	A454-4	ACS класс или лучше
Абсолютный этанол	Fisher Scientific	BP2818-100	ACS grade или лучше
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	22705	ACS grade или лучше
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	ACS grade или лучше
Equipment
Dialysis membrane (MWCO: 3,500)	Spectrum Labs	132720
Полиэтиленгликоль аналитический стандарт	Sigma-Aldrich	O2393
Тюбик Schlenk, 1 мл	творожное стекло		по индивидуальному заказу
TSK-GEL G4000 PWxl	Тосох Бионаука	8022	Используется для анализа GPC гликополимеров
Empower 3 с пакетом GPC/SEC	Waters Corporation
Waters Alliance HPLC system	Waters Corporation		Оснащен детектором показателя преломления (Waters 2414) и детектором флуоресценции (Waters 2475)
Avance III 800 МГц NMR Spectrometer	Bruker Corporation
BX43 флуоресцентный микроскоп	Olympus Corporation		Используется с фильтром FITC в тесте на связывание гликополимеров
Rotavap / Rotoevaporator	Heidolph
Fritted дисковая воронка	Fisher Scientific	10-310-109
Лиофилизатор	Labconco
Иммунофлуоресцентный микроскоп предметное стекло		Polysciences 18357-1
Revco Ultima Plus -80  ° C Морозильная камера	Thermo Scientific
Пластиковый вакуумный мешок и ручной насос	Ziploc
Вакуумный насос, прямой привод, Maxima C Plus	Научный
вакуумметр	Sargent-Welch