Методическая статья

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

20.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52941

⸱

25 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Institute for Systems Genetics, 2Roche Life Science, USA

В этой статье

Краткое содержание

Дизайнерские хромосомы проекта «Синтетический геном дрожжей», Sc2.0, можно отличить от их нативных аналогов с помощью анализа генотипирования на основе ПЦР под названием PCRTagging, который имеет конечную точку присутствия/отсутствия. В данной статье мы опишем высокопроизводительный метод обнаружения ПЦР в реальном времени для генотипирования PCRTag.

Аннотация

Генный Синтетические дрожжи (Sc2.0) направлен на создание 16 дизайнерские дрожжей хромосом и объединить их в один дрожжевой клетки. На сегодняшний день один синтетическую хромосому, synIII 1, и один синтетический руку хромосом, synIXR 2, были построены и их функции в естественных подтверждено при отсутствии соответствующих диких хромосом типа. Важно особенностью дизайна Sc2.0 хромосом введение PCRTags, которые короткие, перекодируются последовательности в пределах открытых рамок считывания (ORFs), которые позволяют дифференцировать синтетических хромосом от своих диких аналогов типа. PCRTag праймеров отжига избирательно либо синтетических или диких хромосом типа и наличия / отсутствия каждого типа ДНК могут быть проверены с помощью простого ПЦР. Стандарт считывание PCRTag анализа заключается в оценке наличия / отсутствия ампликонов с помощью электрофореза в агарозном геле. Тем не менее, со средней плотностью PCRTag ампликон одного за 1,5 кб и AGenome размер ~ 12 Мб, завершена Sc2.0 геном кодирует примерно 8000 PCRTags. Для повышения пропускной способности, мы разработали ПЦР в реальном времени на основе анализа обнаружения для PCRTag генотипирования, что мы называем анализ qPCRTag. Рабочий процесс указывает, 500 NL реакции в 1536 многоямного пластины, что позволяет нам испытать до 768 PCRTags с синтетическими и диких пар типа праймеров в одном эксперименте.

Введение

Sc2.0 или Генный Синтетические дрожжи ( www.syntheticyeast.org ), поставила перед собой цель проектирования и построения полностью синтетический геном эукариотической. Использование высоко куратором генома последовательности Saccharomyces CEREVISIAE 3 в качестве отправной точки, каждая из шестнадцати линейных хромосом был вновь создан, чтобы удовлетворить набор принципов проектирования, определяющих сохранение клеток фитнес, улучшение стабильности генома и повышения генетического гибкость. Например, дестабилизирующие элементы, такие как повторы удаляются из Sc2.0 хромосом. Все экземпляры TAG стоп-кодонов повторно закодированы, чтобы ТАА на "освободить" кодон в конечном штамма для введения негенетически закодированной аминокислоты. Кроме того, индуцируемый эволюция системы, карабкаться, включен в систему Cre-LOX, позволяет беспрецедентный способность генерировать производные геномы с новыми конструкций 4.

Еще одним важным элементом дизайна в Sc2.0 генома введение PCRTags, которые служат в качестве водяных знаков ДНК для того, чтобы отслеживать и синтетических ДНК дикого типа. PCRTags короткие, перекодируются сегменты ОРС на синтетических хромосом; в то время как последовательности PCRTag различаются на уровне ДНК между синтетическими и диких хромосом типа, кодируемые белки идентичны по аминокислотной последовательности и, таким образом, предположительно, функции. Последовательности PCRTag специально разработан как сайты связывания праймеров для облегчения селективного усиления (рис 1А). PCRTag конструкции осуществляется с помощью '' самых разных алгоритма в GeneDesign 5,6, получая перекодировать синтетические последовательности, которые, как правило, ~ 60% отличается от нативных последовательностей (минимум 33%) с температурой плавления от 58 ° С до 60 ° С и длина ампликон между 200-500 пар оснований 2. Перекодирования не допускается в течение первых 100 п.н. каждого ORF, так как эти области, как известно,есть специальные предпочтения в плане использования кодонов 7. Вместе, эти правила проектирования пользу высокой производительности почти все PCRTags под одного набора ПЦР условиях, когда синтетические и дикие пары типа PCRTag праймеров исключительно связывают и усиливают синтетического и нативной ДНК, соответственно (рис 1B).

figure-introduction-1
Рисунок 1:. PCRTag принципиальная (A) PCRTags повторно закодированы последовательности в открытых рамок считывания (ORF) генов на хромосомах Sc2.0. (Б) Синтетический (SYN) и дикого типа (WT) PCRTag праймеры исключительно связывать и амплификации синтетического и дикого типа геномной ДНК (GDNA), соответственно. Здесь показан анализ кб сегменте левого плеча хромосомы шесть ~ 30, тестирование тринадцать PCRTag пары праймеров, используя либо WT или полу-synVIL2 GDNA в качестве шаблона. Во многих случаях один ORF кодирует более одного PCRTag. Наличие / отсутствие PCRTag ампликонов оценивают с помощью электрофореза в агарозном геле. PCRTag ампликоны варьируются в размерах от 200 до 500 б.п. ВР. Чем быстрее мигрирующие виды в нижней части панелей праймеров димеры.

Анализ PCRTag оказалась важным инструментом в сборке Sc2.0 хромосом. В типичном эксперименте 30-50 т.п.н. из синтетической ДНК, кодирующей 20-30 PCRTags, превращается в дрожжевых клетках, чтобы заменить соответствующий ДНК дикого типа 1,2,8. Анализ PCRTag затем используется для идентификации трансформантов, которые кодируют синтетические, но не дикий PCRTags типа, охватывающие этот сегмент ДНК, или так называемые «победители». Это, как правило, необходимо протестировать несколько трансформантов для выявления «победителей», так пропускной и стоимость анализа PCRTag важные соображения. В настоящее время два Sc2.0 хромосомы были завершены (synIII 1 и synIXR 2), что составляет менее 10% от Sc2.0 генома, альтHough более половины оставшихся хромосом в настоящее время проходят синтез и сборку. Масштаб анализа PCRTag требуется для этого проекта быстро опережает способность управлять гели и вручную набрать наличие синтетической ДНК и отсутствие ДНК дикого типа.

Для улучшения пропускной способности анализа PCRTag мы разработали технологический процесс, используя ПЦР в реальном времени, чтобы обойти использование электрофореза на агарозном геле. Рабочий процесс использует объемной дозатора жидкости, чтобы распределить КПЦР Mastermix в каждую лунку 1536 многоямного пластины, наноразмерных акустических жидкости дозатора переноса ДНК матрицы и праймеров, и 1536 КПЦР термоциклер, что позволяет нам миниатюризации реакции до 500 п и увеличить пропускную способность. Кроме того анализ может быть автоматизирован. Этот тип протокола генотипирования высокой пропускной должны быть обобщены к любому проекту, требующей анализа многих клонов на нескольких локусов.

Протокол

1. Подготовьте геномной ДНК дрожжей (GDNA)

  1. Подготовка исходного дрожжей лизирующего буфера 9, который содержит 50 мМ Трис рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1% SDS (масса / объем), 2% Тритон Х-100 (об / об), 1 мМ ЭДТА, рН 8,0.
  2. В качестве исходного материала использование ~ 2 х 10 6 клеток, которые, как правило, соответствует ~ 100 мкл насыщенного культуры для штаммов лаборатория в BY4741 10 фоне. Культивируемые клетки должны быть собраны центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре в 1,5 мл пробирке. Аспирируйте супернатант.
  3. Добавить 200 мкл дрожжей лизирующего буфера и ресуспендируют осадок клеток с помощью пипетки.
  4. Добавить ~ 300 мкл промытых кислотой стеклянных шариков, так что уровень бусин около 1 мм ниже уровня клеточной суспензии.
  5. В вытяжном шкафу добавить 200 мкл смеси фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (25: 24: 1). Закрывают пробирке и гарантировать, что ни шарики не застревают между крышкой и трубой, так как это приведет к утечкам при встряхивании(Шаг 1.6). Обратить 3 раза, чтобы смешивать и проверки крышка закрыты.
  6. Взболтать пробирку в течение 10 мин при комнатной температуре с использованием настольный смеситель, такой как Eppendorf 5432.
  7. Центрифуга на 20800 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Передача 75 мкл водной фазы к новой пробирке, содержащей 1 мл 100% -ного этанола. Обратить 10 раз перемешать.
  9. Гранул ДНК центрифугированием при 20800 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
  10. Аспирируйте супернатант, не смещая осадок ДНК. Вымойте гранул с 500 мкл 70% этанола.
  11. Центрифуга на 20800 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
  12. Аспирируйте супернатант, не смещая осадок ДНК и воздушно-сухой осадок с микроцентрифужную открытой крышкой, пока избыток этанола не испарится, которые, как правило, около 10 мин.
  13. Ресуспендируют осадок ДНК в 75 мкл 10 мМ Трис, рН 7,4 и вихря перемешать. Хранить образца при -20 ° C до бесконечности. Измерьте концентрацию ДНК в образце с помощьюНастольные флуориметр таких как кубит, который отличает ДНК из РНК. Убедитесь, что конечная концентрация составляет ~ гДНК 1-2 нг / мкл.
  14. Приготовьте разбавление 1:10 геномной ДНК с использованием воды и перемешивают, чтобы смешать.
  15. Аликвоты 30 мкл разбавленного гДНК в соответствующий лунку пластины источника, который совместим с наноразмерной дозатора жидкого акустической (шаг 3). При использовании Labcyte Echo 550, используйте полипропилен пластину 384 а (384PP пластины).
    Примечание: Когда запечатаны соответствующим эта пластина может храниться в течение по крайней мере одного месяца при -20 ° С.

2. Подготовка и Внесите КПЦР мастер смеси в 1536 Multiwell плиты

  1. Подготовьте 850 мкл КПЦР мастер смеси, такие как LightCycler 1536 ДНК Green Master, в 1,5 мл пробирке и вихря перемешать. Центрифуга КПЦР мастер смеси в течение 2 мин при 20800 х г при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки. Компоненты мастер-смеси, необходимой для КПЦР одной пластине 1536 многоямного являются следующиес:
    1. Комбинат 170 мкл ферментного мастер микс (Зеленый Мастер метро 1, 5x концентрированный), 42,5 мкл SYBR (Зеленый Мастер труб 4, 20x концентрированный) и 637,5 мкл воды.
  2. Разлить 500 нл / а в 1536 многоямного пластины, используя объемную дозатора жидкости, такие как Art Robbins Cobra. (Обратите внимание, что шаги 2.2.1-2.2.4 относятся конкретно к Cobra).
    1. Создать программу дозирования со следующими настройками: жидкость класса, вода; Объем аспирации, 800 мкл; обойтись громкости, 500 NL; мыть время, 20 сек. В настройках дозирования, проверки скорости дозирования установлен в 49,6 мм / сек, распределительный смещение 0,25 мм, и избыток жидкости атмосферный будет обойтись обратно в источник хорошо.
    2. Поместите пробирке, содержащей смесь мастер КПЦР в хорошо A1 владельца пробирке, который находится в положении палубы 1. Отрежьте крышку пробирке или просто оставить его открытым. Установите 'аспирата также "А1 путем редактирования AspiratНастройки E.
    3. Выполнение стирки шаг до распределения КПЦР мастер смеси первыми де-выбору аспирации и отказаться шагов программы, созданной на шаге 2.2.2, а затем нажать "Выполнить". После завершения повторного выбора аспирации и отказаться шаги до запуска полной программе обходиться КПЦР мастер смеси. Если Кобра сидел простоя менее 10 мин начальная стадия промывки, который служит для премьер-системы, является необходимым.
    4. Хит «Выполнить», чтобы обойтись КПЦР мастер смеси в каждую лунку.
  3. Сбор основной смеси КПЦР в нижней части каждой лунки с помощью короткого центрифугирования 1536 многоямный пластины (30 сек с использованием низкоскоростного ПЦР пластины счетчик).

3. Внесите шаблона ДНК и праймеры в многоямного плиты 1536

  1. Разлить 5 нл разбавленных гДНК (этап 1.3) в желаемые лунки 1536 многоямного пластину с использованием акустической системы переноса жидкости, такие как Эхо 550.
    1. Для ECHО 550, используйте программное обеспечение плита Переформатировать или, альтернативно, предоставить собственный Excel таблицу, чтобы запрограммировать передачу. Убедитесь, что выбранный источник также для гДНК в программе соответствует источник также в который вы физически дозируемого в GDNA (шаг 1.3). Выберите тип источника плиты "384PP_AQ_BP2", который указывает, жидкость в 384PP пластины буфера без поверхностно-активных веществ.
  2. Разлить 10 нл праймеров, предварительно смешанных прямом и обратном до конечной концентрации 50 мкМ каждого, в желаемые лунки 1536 многоямного пластину с использованием акустической системы переноса жидкости, такие как Эхо 550.
    1. Для системы жидкого передачи, использовать программное обеспечение плита Переформатировать или, альтернативно, предоставить собственный Excel таблицу, чтобы запрограммировать передачу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно обойтись праймеров таким образом, что расположение на 1536 многоямного пластины соответствует хромосомной порядок праймеров, так что легко визуально проверить в режиме реального времени результаты ПЦРпозже (шаг 6).
    2. Премикс праймеров в пластине, которая совместима с дозатором акустической жидкости. Для Эхо 550, используйте Labcyte 384LDV (низкий мертвый объем) пластину и выбрать тип источника плиты "384LDV_AQ_B" при программировании Эхо указать жидкость просто буфер с не белков.

4. Печать и центрифуга многолуночные плиты 1536

  1. Использование системы охотник на тюленей микропланшет, такие как Plateloc Тепловая микропланшет Sealer, немедленно герметизировать 1536 многоямного пластину с помощью оптически прозрачной уплотнение, которое совместимо с термосварки инструмента. Не прикасайтесь к поверхности уплотнения, чтобы избежать размазать марок.
    1. При использовании Plateloc тепловой микропланшетов Sealer, используйте следующие параметры: печать Time 2.0 сек, температура уплотнения 162 ° C, давление воздуха 82 фунтов на квадратный дюйм. Этот инструмент принимает ~ 5 минут, чтобы разогреть и так должен быть включен заранее.
    2. При использовании Plateloc Тепловая микропланшетов Sealer, ADAPTEг должны быть использованы для повышения высоты 1536 многоямного пластины на сцене инструмента для обеспечения хорошего уплотнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предпочтительно, чтобы купить Stage Пластина для Plateloc Тепловая Microplate Sealer, альтернативное решение, чтобы вставить четыре ~ 2 мм толщиной стандартные шайбы, доступные в любом хозяйственном магазине в углах, чтобы поднять высоту 1536 многоямного пластины.
  2. Сразу центрифуге запечатанный 1,536 многоямного пластину при 2000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы собрать все реагенты в нижней части каждой лунки.

5. ПЦР в реальном времени

  1. Программа 1536 КПЦР инструментом, таким как LightCycler 1536 г. с протоколом амплификации двухступенчатой ​​последующим анализом кривой плавления. Использование программного обеспечения 1536 LightCycler настроить программу следующим образом:
    1. Прединкубационная: 95 ° С, 1 мин удержания, темп рампы 4,8 ° С / с, не приобретение.
    2. Два Шаг Усиление: 30 циклов [95 ° C, без удержания,нарастить скорость 4,8 ° C / сек, не приобретение; 64 ° С, 30 сек держать, темп рампы 2,5 ° С / сек, что однократная регистрация].
    3. Растопить кривой: 95 ° С, 10 сек, скорость разгона 4,8 ° С / сек, не приобретение; 60 ° С, 1 мин, темп рампы 2,5 ° С / с, не приобретение; 97 ° С, скорость разгона 0,1 ° С / сек, 5 поглощений / ° С (непрерывный).
    4. Холодный: 40 ° С, 30 сек, темп рампы 2,5 ° С / с, не приобретение.
  2. Установите формат обнаружения в «зеленой интеркалирующего покрасить" на вкладке Выполнить Определение.
  3. Установите контроль пипетки к «Мастер Control" на вкладке Выполнить Определение. Эта функция служит в качестве внутреннего контроля и обнаруживает присутствие КПЦР мастер смеси в каждую лунку 1536 многоямного пластины, которая полезна для выявления предполагаемых ложных негативов.
  4. Вставьте пластину 1536 Multiwell подготовленный в шагах 2-4 в КПЦР инструмента 1536 и запустите программу.

Анализ 6. Данные

  1. PerfORM визуальный осмотр данных в программное обеспечение КПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение 1536 позволяет визуализировать как усиления и расплавить кривых, а также тепловой карте показаны вызов (позитивный, негативный, неправильный, N / A, рисунок 2), значение пропускной пункт (скользящий цветовую гамму для положительных или серый для отрицательных; рис 3), или флуоресценции конечная точка (ИПФ) значения (скользящий цветовую гамму).
  2. Экспорт данных из 1536 Software в виде .txt файл (таблица) Результаты или .xml или с исходных данных или расчетных данных для обработки в автономном режиме от инструмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: фирменная автоматизированной пропускной пункт (Ср) вызова алгоритм встроен в программное обеспечение 1536 учитывает форму и наклон кривой усиления при определении положительных / отрицательных и Ср звонки значение с высокой степенью уверенности, при низкой суб реакционных объемов мкл со сравнительно низкой Значения флуоресценции.
  3. Если LightCycler ДНК Зеленый Учитель использованиеd для количественной ПЦР, убедитесь, что все скважины прошли мастер '' контроль. Сбой указывает также не получить КПЦР мастер смеси и отсутствует точка данных следует рассматривать потенциал ложный отрицательный. Убедитесь, что все скважины прошли мастер '' контроль. Сбой указывает также не получить Mastermix ДНК и рассмотреть недостающие точки данных потенциального ложный отрицательный.

Результаты

Мы протестировали синтетическую и дикого типа хромосомы 3 пары праймеров PCRTag 1 дрожжевой геномной ДНК (GDNA), извлеченного из четырех различных штаммов. Хромосома 3 имеет 186 PCRTag пары праймеров, которые охватывают длину хромосомы (synIII это ~ 270 Кб и дикого типа хромосом 3 ~ 315 Кб). Чтобы проверить каждый из четырех штаммов с обоих наборов праймеров, мы разделили многоямного пластину на четыре квадранта, по одному для каждого типа гДНК, назначение синтетических праймеров PCRTag в верхней половине каждого квадранта и дикого типа в нижней половине. Геномную ДНК экстрагировали из дрожжевых штаммов, два из которых кодируют дикого типа хромосомы 3 (дикого типа, synIXR 2), а остальные два кодирования синтетического хромосомы 3 (synIII 1, synIII synIXR). КПЦР мастер смеси разливали в каждую лунку 1536 многоямного пластины с использованием объемной жидкости дозатор, а затем GDNA и PCRTag праймеров с использованием эхо 550. Праймеры были выстроены одинаково вкаждый квадрант многоямного пластины для легкого визуального сравнения. Многоямный Затем пластину термически свариваются оптически прозрачного уплотнением и подвергали ПЦР в реальном времени анализа.

В этом эксперименте мы наблюдали qPCRTag, по большей части, усиление, как и ожидалось, в котором синтетические праймеры амплифицируют только синтетическую ДНК и наоборот (фиг.2 и 3). Тем не менее, мы также наблюдали несколько отклонений от ожидаемого характера, предлагая ложные негативы и ложных срабатываний в наборе данных. В этом эксперименте, главный регулятор был обнаружен в 100% скважин, указывающий дозатора жидкости объемной успешно дозируемой Mastermix в каждую лунку на пластине (данные не показаны). Это исключает один потенциальный источник ложных негативов. Кроме того, некоторые хромосомы 3 PCRTags, как известно, не в состоянии (показано на фиг S6 и S7 из Annaluru др. 1), в том числе по меньшей мере, 2 син и 1 маспары праймеров; Таким образом, эти скважины могут быть проигнорированы в каждом квадранте. Правда ложные негативы могут возникнуть из-за отсутствия передачи шаблона гДНК или праймеров, однако в нашем опыте, учитывая правильное калибровка Эхо 550, а также подготовка гДНК и праймеры, описанные, это не было главным источником ошибок. В целом, в этом эксперименте ложный отрицательный показатель был крайне низким для WT праймеров с WT шаблона (~ 2%), хотя несколько выше для SYN праймеров с ДНК SYN (~ 8%).

Ложных срабатываний, обнаружение сигнала в скважинах, где SYN праймеры смешивают с WT гДНК (и наоборот), может возникать из поперечного усиления или праймер димеров. Действительно, грунтовки димеров часто видны с помощью гель-электрофореза (Фиг.1В) и представляют собой разумный источник ошибки. Для применения количественной ПЦР, исследование кривых расплава может быть полезно для определения различных видов, такие как грунтовки димеров, может способствовать сигнала. Кроме того, парфюмorming контрольном эксперименте в котором праймеры дозируемого в отсутствие матричной ДНК может помочь идентифицировать праймеры со склонностью к димеризации. Кросс амплификации можно наблюдать с помощью гель-электрофореза, в частности, если выполняется слишком много циклов ПЦР или если температура отжига слишком низка. Мы постарались свести к минимуму количество ложных срабатываний из-за поперечного усиления по оптимизации обоих этих параметров для протокола qPCRTag. Наконец, рассматривая пункт пропуска (Ср) значения для каждой скважины может помочь определить праймеров, которые не подходят для реального времени на основе обнаружения (рис 3, например, Bb22, FB22, Bb46, FB46). В целом, в этом эксперименте ложных срабатываний была низкой для SYN праймеров с WT шаблона (~ 5%) и выше для WT праймеров с SYN шаблона (~ 10%).

figure-results-1
Рисунок 2: Плита тепловая карта отображения присутствия / ABощущение Строительные призыв к эксперименту qPCRTag. Четыре различных типа геномной ДНК (квадранта разделены сплошными белыми линиями) были подвергнуты анализу с использованием синтетических PCRTag (SYN) и дикого типа (WT) хромосома 3 PCRTag праймеров (пунктирные белые линии, чтобы отделить SYN (верхняя ) и WT (нижний) в каждом квадранте). WT и synIXR гДНК кодирования дикого типа хромосомы 3, уступая усиление с БТ PCRTag праймеров. SynIII и synIII synIXR гДНК кодирования синтетическую хромосому 3, уступая усиление с SYN PCRTag праймеров. Грунтовки облеченные в соответствии с их левой-направо хромосомной позиционирования и позиционируется одинаково в четырех квадрантах для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3: Пластинчатый теплообменникКарта отображения значения точки пересечения (CP) для эксперимента qPCRTag. Это же набор данных как показано на рисунке 2, и расположение плиты, поэтому идентичны. N / относится к "не усиления". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Включение в режиме реального времени обнаружения ПЦР в генотипирования анализа PCRTag является важным событием для проекта Sc2.0, поскольку это позволяет значительно более высокую пропускную способность. Предыдущая рабочий указано 2,5 мкл реакции в 384 луночных ПЦР планшет, 1,5 ч время термоциклирования перспективе, электрофореза в агарозном геле, и руководство аннотаций геля.

Рабочий, представленные здесь, называется анализ qPCRTag, преодолевает несколько крупных узких мест. Во-первых, qPCRTag выполнения конденсируется 4 х 384-луночных в одном эксперименте, который может быть обработан, от начала до конца (пластины, установленной на плюс время выполнения), примерно в час. Важно отметить, что стоимость реагента в каждую лунку для анализа qPCRTag находится на одном уровне с нижней пропускной подхода в агарозном геле на основе. Тем не менее, в обход гель-электрофореза и ручной аннотации, рабочий qPCRTag дает существенную экономию во времени и труда, которые являются основными преимуществами. Важно рабочий qPCRTag есть ваннаяtirely совместим с автоматизацией.

Одной из основных проблем при использовании обнаружения реального времени, как на выходе анализа PCRTag является скорость ложных срабатываний и ложных негативов. Поскольку PCRTag праймеры не были первоначально предназначены для использования в ПЦР в реальном времени, можно ожидать, что не все пары праймеров будет подходящим для использования с этой продукции. Для этого важно, чтобы проверить функции и специфику всех пар праймеров PCRTag исключить подмножество, которые не работают в реальном времени на основе анализа фронт. Например, хромосома 3 PCRTag ложных срабатываний и негативы по-и-большой воспроизводимая в режиме реального времени данные ПЦР (2 и 3), и они могут быть исключены из дальнейшего анализа. Кроме того, пары праймеров, известных неудачу (оценивали с помощью гель-электрофореза и показанный на фиг S6 и S7 на Annaluru др. 1) также может быть исключена. Это легко сделать, просто excluДин неисправные пары праймеров при настройке протокола акустической передачи.

Как и большинство высокопроизводительных анализов, мы намерены использовать обнаружение PCRTag в режиме реального времени в качестве основного экрана, чтобы определить трансформантов, которые заслуживают дальнейшего вниз по течению проверки. Впоследствии, золотым стандартом для среднего скрининга останется PCRTag анализ с помощью гель-электрофореза в качестве отсчета. За применение анализа PCRTag для Sc2.0, сочетая государством в самых современных систем обработки наноразмерных жидкость с высокой пропускной реального времени ПЦР-технологии позволяет быстро и автоматизированный анализ и имеет потенциал, чтобы влиять на многие поля. Например, это рабочий процесс может быть применен к высокой пропускной скрининга библиотеки, инфекционного заболевания, диагноз анализа микробиомом и передовые подходы редактирования генома попытке изменить несколько локусов одновременно.

Раскрытие информации

ЛАМ, НПД, джем и JDB не имеют ничего раскрывать. RC и Л. являются сотрудниками компании Рош биологией, США и работал по разработке приложений с LAM в рамках доказательство принципа эксперимента.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом Грант MCB-0718846 и перспективных исследований Министерства обороны Агентский договор N66001-12-C-4020 (для JDB). ЛАМ финансировалась докторантуру из естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады. Публикация этой статьи авторами Roche.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дрожжевая гДНК подготовка
дрожжей гДНКпользовательскийпользовательскийшаблон для ПЦР в реальном времени
Стеклянные шарики, промытые кислотой (0,5 мм)SigmaG8772лизис дрожжевых клеток
Сверхчистый фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v)Invitrogen15593-031лизис дрожжевых клеток
5432 МиксерEppendorf5432лиз дрожжевых клеток
Микроцентрифуга 5417REppendorf22621807лизис дрожжевых клеток
Qubit 3.0 ФлуориметрLife TechnologiesQ33216количественное определение гДНК
Qubit dsDNA BR Assay KitLife TechnologiesQ32850количественное определение гДНК
Labcyte 384PP планшетLabcyteP-05525gDNA source plate
DNA Green Mastermix prep и диспенсирование
LightCycler 1536 DNA GreenRoche5573092001реальном времени PCR mastermix
1,5 мл держатель микрофуге для пробиркиARIEST BD060314-1держатель микрофуге для деки Cobra
LightCycler 1536 Multiwell PlateRoche5358639001
Cobra система обработки жидкостейArt Robbins Instruments630-1000-10дозирование qPCR master mix в 1536 планшет
PCR Plate SpinnerVWR89184-608cenrifugation of 1536 plate
Шаблон и праймер дозирование
PCRTag праймерыIDTпользовательскиепредварительно смешанные вперед и обратно, 50 μ M каждый
TempPlate проникающий герметизирующий фольга, стерильныйСША Scientific2923-0110временный уплотнитель для праймерных пластин PCRTag
Labcyte LDV 384 луночная пластинаLabcyteLP-0200предварительно смешанный праймер исходная пластина
Echo 550 Liquid HandlerLabcyteперенос 2,5 нл капель праймера и матричной ДНК в пластину 1536 Plateloc
Thermal Microplate SealerAgilentG5402-90001термосвариватель для пластины 1536 до прогона LC1536 Прозрачное
постоянное уплотнениеAgilent24212-001оптически прозрачное термосвариваемое уплотнение для многолуночной пластины LC1536
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate StageAgilentG5402-20008может заменить шайбы толщиной ~2 мм
Sorvall Legend XTRThermo Scientfic75-004-521центрифуга термосвариваемая пластина
1536Промышленный воздушный компрессорJun Air1795011для работы Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536Rocheтребуется розетка 220 В

Ссылки

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
  2. Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
  4. Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
  5. Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
  6. Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
  7. Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
  8. Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
  9. Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
  10. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Перепечатки и разрешения

Теги

PCRTag1536
qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.