Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство Nurr-1 Удельная поликлональных антител Бесплатные перекрестной реактивности против своих Близкие гомологи, Nor1 и Nur77

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52963

⸱

17 августа 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Neurobiology Laboratory, Psychiatry, McLean Hospital, 2Department of Biochemistry, College of Medicine, Konyang University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы избирательно нацеливаем антитела против конкретного члена высококонсервативного семейства белков путем иммунизации животных их наиболее расходящимися областями с последующим удалением перекрестно-реактивных антител с помощью предварительной адсорбции.

Аннотация

Подсемейство ядерных рецепторов 4 (NR4A) состоит из 3 родственных белков, разделяющих ДНК-связывающий домен (DBD) и лиганд-связывающий домен (LBD). Связанный с ядерным рецептором белок 1 (Nurr1 или NR4A2) играет ключевую роль в поддержании дофаминергической системы. Дисфункции дофамина, связанные с геном Nurr1, включают болезнь Паркинсона, шизофрению и маниакальную депрессию. Кроме того, последние данные указывают на то, что Nurr1 также экспрессируется в других областях мозга, таких как гиппокамп, и играет важную роль в обучении и памяти. Другими членами семейства являются фактор роста нервов IB (Nur77 или NR4A1) и нейронный орфанный рецептор 1 (NOR1 или NR4A3). Чтобы помочь исследовать точную функциональную роль Nurr1 в дофаминергических и других нейронных дисфункциях, связанных с областями мозга, потребовались антитела, лишенные перекрестной реактивности против Nur77 и NOR1. Поскольку белки более дивергентны в своих LBD, чем в ДНК-связывающих доменах, иммунизация очищенными LBD должна дать антитела, специфичные к Nurr1, с минимальной реактивностью против Nur77 и/или NOR1. Несмотря на то, что антитела к Nurr1 были успешно сгенерированы, они продемонстрировали значительную иммунореактивность в отношении других членов семьи. Аффинная хроматография на иммобилизованном белке А с последующей предварительной адсорбцией против иммобилизованных Nur77 и NOR1 LBD дала специфические антитела Nurr1, свободные от перекрестной реактивности. В данном случае мы селективно нацеливаем антитела против конкретного члена высококонсервативного семейства белков путем иммунизации животных их наиболее дивергентными областями с последующим удалением перекрестно-реактивных антител путем предварительной адсорбции. Целью протокола является повышение специфичности поликлональных антител за счет предварительной адсорбции против перекрестно-реактивных антигенов.

Введение

Транскрипционный фактор Nurr1 и его гомологов (Nur77 и Nor1) относятся к ядерной рецепторов подсемейства 4А (NR4A) 1. Они также сироты рецепторы, потому что их эндогенные лиганды пока не определены. Nurr1 впервые клонировали в 1992 году, и, хотя, как известно, выражается в мозге 2, его существенную роль для развития и поддержания среднего мозга нейронов допамина было выявлено в исследованиях нокаутом мыши 3. Кроме того, его важная роль для поддержания среднего мозга нейронов допамина недавно была продемонстрирована в исследовании условного нокаута 4. Из-за этих исследований, показывающих, элегантные решающую роль Nurr1 для среднего мозга нейронов допамина, многие последующие исследования в основном сосредоточены на среднем мозге нейроны допамина и допамина нейродегенеративных расстройств, болезни Паркинсона (БП) 5.

Следует отметить, что Nurr1 выражается не только в нейронах среднего мозга допамина (МДА), но также и в диучастки мозга стих 2, предполагая, что он может иметь функциональные роли во многих областях, не-DA, который сильно поддерживается более недавних исследований, показывающих, что Nurr1 играет важную роль в различных функций мозга. Для примера, было показано, что память вызывающие действия, такие как обучение, или другие гиппокамп-зависимые задачи приводит к повышающей регуляции экспрессии Nurr1 в гиппокампе 6,7. Кроме того, сбить из Nurr1 выражения в гиппокампе было достаточно, чтобы нарушить долгосрочную память и / или синаптической пластичности 8-11, сильно предполагая, что Nurr1 играет различные роли во многих областях головного мозга. Таким образом, для дальнейшего понимания типов клеток специфический и внутриклеточную экспрессию Nurr1, желательно использовать Nurr1-специфические антитела, которые не обладают какой-либо перекрестной реактивности с его гомологи или Nur77 Nor1. Эта статья описывает протокол предварительного адсорбции генерировать Nurr1-специфические антитела и представить дополнительные данные, показывающие, свою специфику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: состав всех решений, приведенных ниже, можно найти в материалах / Оборудование таблице.

1. Белок Колонка антител Очистка

  1. Равновесие белка в колонку отжима и все необходимые буферы до комнатной температуры в течение 15 мин до начала процедуры.
  2. Развести иммунной сыворотки 1: 1 с белком IgG связывающем буфере. (5 мл сыворотки рекомендуется).
  3. Аккуратно нажмите белка в колонку спин на скамейке верхней выбить любую смолу, которые могут быть поданы в крышке. Снимите верхнюю крышку, аккуратно откусив нижнюю закрытие. Поместите колонку в 15 мл пробирку и позволяют решение для хранения данных, чтобы слить.
  4. Добавьте 5 мл белка в связывающем буфере IgG и позволяют решение процедить.
  5. Применение разбавленного иммунную сыворотку на колонку и собирают проточные. Для получения наилучших результатов, добавьте объем образца, который содержит концентрацию антител меньше, чем 80% антител привязки наращиванием потенциалов колонныу.
  6. Промыть колонку с 15 мл белка в связывающем буфере IgG или пока поглощение при 280 нм не превышает 0,1.
  7. Добавить 100 мкл буфера нейтрализации пяти меченых сбора труб.
  8. Добавляют 5 мл IgG элюции буфером с белком колонку и собирают 1 мл фракций в каждую из пробирок, содержащих по 100 мкл нейтрализующего буфера.
  9. Измеряют поглощение каждой фракции при 280 нм и фракции бассейн с оптической плотности более 0,5. Держите объединенных фракций на льду до готовности в диализе.
  10. Регенерация колонки добавлением 8 мл IgG элюции буфером и чтобы раствор пропускали через колонку.
  11. Промыть колонку с раствором связывающего белка IgG до элюент рН возвращается к 7,4.
  12. Хранить столбец путем добавления 5 мл раствора для хранения (0,02% азида натрия в PBS). Когда примерно 3 мл остаются в колонку, крышки нижней и закрепите верхнюю крышку. Хранить колонку при 4 ° С.
  13. Определите длину Oе диализа необходимо в соответствии с инструкциями изготовителя. Использование 16 мм трубки диаметром плоским использовать 5,47 см длины трубки на мл раствора для диализу. Отрежьте трубы и промойте PBS рН 7,4 в течение 15 мин 30.
  14. Сложите и клип один конец трубки для диализа, передача объединенных IgG, содержащий фракции в трубке для диализа, уравновешенную PBS, рН 7,4 и закрыть другой конец.
  15. Диализировать при комнатной температуре против 200 объемов PBS, рН 7,4 в течение 2 часов.
  16. Изменение буфера для диализа (свежий PBS рН 7,4) и диализ еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
  17. Изменение буфера для диализа (свежий PBS рН 7,4) и диализ в течение ночи при 4 ° С.
  18. Держите диализированную раствор антител при 4 ° С до готовности приступить к дальнейшим стадиям очистки.
  19. Оценка концентрации антител, используя свою оптическую плотность при 280 нм и молярного коэффициента поглощения антител при 280 нм 210,000 М -1 см -1 12.

2. Взаимодействие LBD белков AminoLink Соединительная Ресин

  1. Подготовьте две колонки, одна для Nor1 и другой для Nur77. Выполните ту же протокол для обоих белков.
  2. Разморозить белок с возможностью подключения к смоле на льду. Определить концентрацию белка, используя его молярный коэффициент экстинкции и его поглощение при 280 нм 12.
    1. Кроме того, использовать определения белка анализа, такие как анализа бицинхониновой кислоты 13. Если белок, растворяют в амин-содержащий буфер диализа или буферного обмена против буфера для связывания. Если белок не в подходящем буфере (нет свободных аминов) разбавить его 4 раза в буфере дл св зывани.
  3. Использование 2 мл смолы в течение 2 мг белка. Все шаги, которые следуют за 2 мл смолы в колонку с 10 мл. До 10 мг белка могут быть соединены в 1 мл смолы (2 мл 1: 1) суспензии.
  4. Подготовка колонки 10 мл, нажав фритты на дно и работает PBS, рН 7,4 через него. Кап тон снизу колонны и добавьте 2 мл буфера для связывания.
  5. Добавить нужного объема суспензии (4 мл с получением 2 мл смолы) на колонке, снять нижнюю крышку и пусть утечку столбца. Промойте колонку с в общей сложности 6 мл (объем 3 смолы кровать) сцепления буфера и позволяют колонки для слива. После буфера Муфта стечет, заменить нижнюю крышку.
  6. Добавить 2-4 мл белка, суспендированного в буфере дл св зывани в колонке (держать аликвоту раствора белка, чтобы оценить эффективность связывания сравнением концентрации белка в элюате на этапе 2.11 либо с помощью оптической плотности при 280 нм или бицинхониновой анализа) , Крышка и смешать конец над концом иметь однородный раствор.
  7. Взвесьте пустую 1,8 мл микроцентрифужных трубку и перейти к вытяжным шкафом. Тщательно передачи NaCNBH 3 (около 0,05 г) в предварительно взвешенную пробирку. Закройте трубку и взвесить пробирку NaCNBH 3. Не открывайте трубку вне капотом.
  8. На основании весаNaCNBH 3 переносили в пробирки, сделать 5 М раствора добавлением 1 М NaOH. Молекулярная масса NaCNBH 3, 62.84 г, следовательно, 0,05 г равна (0,05 / 62,84 = 7,96 х 10 -4 моль) 7,96 х 10 -4 моль. Чтобы сделать 5 м раствору добавляют 7,96 (10 -4 / 5) 159 мкл 1 М NaOH.
  9. Измерьте общий объем реакционной берет объем смолы во внимание. Добавьте 10 мкл 5 М NaCNBH 3 на мл реакции.
    1. Например: реакционного объема 4 мл добавить 40 мкл 5 М NaCNBH 3. Для 1 мл смолы и 3 мл добавленного белка, общий объем 4 мл.
  10. Крышка колонки и смешать конец над концом. Безопасный столбец на трубке ротатора и пусть реакцию продолжают в течение ночи при 4 ° С.
  11. Утром довести колонну химической капотом и осторожно снимите крышку, как некоторое количество газа может быть сформирована. Слить колонку в чистую пробирку и сохранить элюата для измерения белка CONцентрация помощью оптической плотности при 280 нм методом 12 или анализа бицинхониновой кислоты и сравнить его с концентрацией исходного белка в шаге 2.6.
  12. Промыть смолу с 4 мл св зующего буфера и пусть утечку столбца.

3. Блокирование Оставшееся Сайты

  1. Промыть смолу с 4 мл буфера закалки. Слейте и замените нижний колпачок. Добавить 2 мл буфера закалки и приостановить смолы.
  2. Оценка Общий объем реакционной смеси путем измерения объема смолы и объем буфера закалки затем добавить 10 мкл 5 М NaCNBH 3 на мл реакционного объема.
  3. Тщательно перемешать при комнатной температуре в течение 30 мин в течение конечного конец. Через 30 мин, довести колонну в вытяжном шкафу. Осторожно снимите верхнюю, а затем снимите нижнюю крышку и пусть утечки столбца в сточных трубки.
  4. Промывают колонку 5 объемов смолы промывочным раствором. Монитор промывок на наличие остаточных белков путем измерения абсо элюата вrbance при 280 нм. Несвязанных белков вымываются высокой концентрации соли.
  5. Промыть смолу с 6 мл дегазированной PBS, рН 7,4, содержащем 0,02% азида натрия. Держите колонку при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.

4. Очистка Nurr1 специфических антител

  1. Промыть колонку, соединенную Nur77 LBD с 10 мл PBS, рН 7,4, и пусть в канализацию столбца. Крышка нижней части колонны и поместите осушенных Nur77 LBD сочетании колонку в новом 15 мл пробирку.
  2. Добавляют 5 мл очищенного белка антител Nurr1, крышка колонны и место на ротатор при 4 ° С в течение 1 часа. Снимите верхние и нижние крышки и собирать поток через. Отложите на льду до готовности добавить в сочетании колонке Nor1 LBD.
  3. Промыть колонку, соединенную Nor1 LBD с 10 мл PBS, рН 7,4, и пусть в канализацию столбца. Крышка нижней части колонны и поместите Nor1 LBD сочетании столбец в 15 мл пробирку.
  4. Добавить поток через от переворота Nur77 LBDпривело колонки, крышка колонны и место на ротатор при 4 ° С в течение 1 часа. Снимите верхние и нижние крышки и собирать поток через.
  5. Измерение концентрации антител путем измерения оптической плотности при 280 нм.

5. ИФА на основе анализа очищенного Anti-Nurr1 антитела

  1. Добавить 100 мкл белка (2,5 мкг / мл) в лунки 96-луночного планшета. Если тестирование 3 различных белков, добавьте 100 мкл белка 1 до скважин А1 до H4, 100 мкл белка 2, в лунки A5 в H8 и 100 мкл белка 3 Уэллсу A9 к Н12. Закройте планшет и инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
  2. Промыть лунок два раза по 300 мкл на лунку PBS, рН 7,4 и добавляют 300 мкл ELISA блокирующем буфере с целыми скважин, покрытых антигеном и инкубируют 2 часа при комнатной температуре.
  3. В то время как пластина преграждает подготовить целевое исходное разведение очищенного анти-Nurr1 антитела (от 10 до 100 мкг / мл) в блокирующем буфере ELISA.
  4. Через 2 ч блокировки, замените блок буфера ELISA с 100 мкл свежей ELISA блока буфера во все лунки.
  5. Добавить 100 мкл разбавленного очищенной анти-Nurr1 антитела всех скважин в ряду А. Серийно разбавить антитела путем передачи 100 мкл раствора из ряда А в лунки в строке В последующей передачи 100 мкл раствора из ряда В грести C продолжая грести до G. После смешивания растворов в скважинах в строке G отбросить лишние 100 мкл. Уэллс в строке H получить только начальные 100 мкл блокирующего буфера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Промыть пластины три (3) раза по 300 мкл на лунку 0,05% Tween 20 в PBS, рН 7,4 и пятно на пластину, чтобы удалить избыток промывочного буфера.
  7. Добавить 100 мкл пероксидазой хрена (HRP), конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG, разбавленного в буфере блока ELISA (1: 8000 разведение; типичный диапазон составляет от 1: 5000 до 1: 25000). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
  8. Промыть пластины тысРЗЭ (3) раза, как описано в 5.6. Тщательно промойте все лунки, заполняя их с 300 мкл деионизированной воды. Промокните избыток воды опрокидыванием планшета на поглощающие бумаги.
  9. Добавить 100 мкл 3, 3 ', 5, 5' тетраметилбензидином (нагревают до комнатной температуры) во все лунки и инкубируют 15 до 30 мин в темноте при комнатной температуре.
  10. Остановить реакцию, добавив 50 мкл 2 H 2 SO 4.
  11. Измерить оптическую плотность при 450 нм вычитание фона при 650 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сравнение белка колонку очищают Nurr1-специфические антитела с белком A очищенные антитела анти-Nurr1 затем прохождения через Nur77 ДТЛ и Nor1 LBD колонн, показанные на рисунке 1. Как видно, белок очищали Nurr1 антитела выставлены сильной связи чтобы Nurr1 ДТЛ. Тем не менее, он также показал значительное связывание с LBD Nur77 и Nor1 LBD. При белок А-очищенные антитела Nurr1 дополнительно очищали с Nur77 LBD и Nor1 LBD, конечном аффинно-очищенные антитела Nurr1 выставлены специфическое связывание с LBD ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успех этого протокола зависит от наличия чистых белков для характеризации антител, против конкретного члена семейства белков интереса. Там нет необходимости, чтобы очистить антител с использованием белка A / G, пока не будет четко установлено, что существуют значительные перекрестных реакций по ELISA и вестерн-блоттинга.

Как указано в тексте, важно, чтобы избежать приостановления белок (белки), чтобы быть сшиты в колонну в качестве амина, содержащего буфер, такой как Трис или глицин. Кроме о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH (NS070577 и NS084869).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Очищенный лиганд-связывающий домен из Nurr1, Nor 1 и Nur77Раствор для хранения колонок
AminoLink Coupling Смола и наборThermo Scientific44890
Белок А спиновая колонкаThermo Scientific89978
Дульбекко фосфатно-солевой буферCorning21-031-CV
96 лунок Пластины с флатевидным дном, высокий фланец, 330 μ lThermo Scientific3455
10% Нормальная козья сывороткаKPL50-675-69
Концентрат разбавителя молока / блокировки KPL50-82-01
Буфер для элюирования IgGThermo Scientific21004
Набор для анализа белка Micro BCAThermo Scientific23235
Пероксидаза конъюгированной с хреном козьей анти-кроличьей IgG (H+L)Thermo Scientific31460
Ni-NTA СмолаThermo Scientific88221
3, 3', 5, 5' ТетраметилбензидинThermo Scientific34028
2N H2SO4Macron Fine ChemicalsH381 05
Связывающий буфер с белком A IgGThermo Scientific21001
Буфер для элюирования IgGThermo Scientific21004
Раствор для храненияколонке Фосфатный буферный Физиологический раствор, содержащий 0,02% азида
натрия Spectra/Por 7 Предварительно обработанная диализная трубкаSpectrum Labs132128
10 мл Одноразовые колонкиThermo Scientific29924
AminoLink Coupling Buffer0,1M фосфат натрия, 0,05% NaN3, pH 7,0
Гашащий буфер1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH
7,4
раствора для мытья1M NaCl, 0,05% NaN3
ИФА блокирующий буфер1% нормальной лошадиной сыворотки (NHS), 1% нормальной сыворотки для коз (NGS) в 1X KPL разбавитель молока
Storage SolutionPBS pH 7,4, содержащий 0,02% азида натрия
Микропипетки: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ л
в

Ссылки

  1. Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
  2. Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
  3. Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
  4. Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
  5. Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
  6. Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
  7. Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
  8. Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
  9. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
  10. Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
  11. Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
  12. Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  13. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  14. Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
  15. Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Специфические антитела к Nurr1удаление перекрестной реактивностиочистка лиганд-связывающего доменааффинная хроматография с белком Аметод предварительной адсорбциианализ методом ИФА и вестерн-блоттингаколонки с LBD Nur77 и NOR1повышение специфичности антителисследования дофаминергической системыядерные рецепторы подсемейства 4A
Производство Nurr-1 Удельная поликлональных антител Бесплатные перекрестной реактивности против своих Близкие гомологи, Nor1 и Nur77
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.