Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52969

⸱

6 октября 2015 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

В этой статье

Краткое содержание

Коинфекция человека трудно воспроизвести in vitro. Тем не менее, малярийные паразиты человека могут быть легко культивированы in vitro, как и недавно выделенные мононуклеарные клетки периферической крови человека, естественно инфицированные ВИЧ. Это обеспечивает прекрасную модель для изучения ранних иммунных реакций на малярийных паразитов в контексте коинфекции ВИЧ.

Аннотация

Коинфекция малярии и ВИЧ становится все более приоритетной задачей здравоохранения. Тем не менее, большинство исследований малярии или ВИЧ в настоящее время сосредоточены на каждой инфекции в отдельности. Хотя понимание динамики заболевания для каждого из этих патогенов по отдельности имеет жизненно важное значение, также важно, чтобы взаимодействие между этими патогенами было исследовано и понято.

Мы разработали универсальную модель in vitro коинфекции ВИЧ и малярии для изучения иммунных реакций хозяина на малярию в контексте ВИЧ-инфекции. Наша модель позволяет изучать секретируемые факторы в клеточных надосадочных зонтах, маркерах клеточной поверхности и внутриклеточных белках, а также уровни экспрессии РНК. Дизайн эксперимента и используемые методы ограничивают вариабельность и способствуют надежности и воспроизводимости данных.

Все патогены, используемые в этой модели, являются естественными патогенами человека (Plasmodium falciparum и HIV-1), и все инфицированные клетки заражены естественным путем и используются в свежем виде. Мы используем эритроциты человека, паразитирующие на P. falciparum и поддерживаемые в непрерывном культивировании in vitro. Мы получаем свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови от хронически инфицированных ВИЧ-инфицированных добровольцев. Каждое используемое состояние имеет соответствующий контроль (P. falciparum паразитирует по сравнению с нормальными эритроцитами), и каждый ВИЧ-инфицированный донор имеет ВИЧ-неинфицированный контроль, из которого в тот же день собираются клетки. Эта модель обеспечивает реалистичную среду для изучения взаимодействия между малярийными паразитами и иммунными клетками человека в контексте ВИЧ-инфекции.

Введение

Со-инфекция, заражение нескольких одновременных инфекций, является нормой в естественных условиях. Со-инфекция может иметь большое влияние на патологию заболевания и клиническому ведению каждой инфекции. В контексте ко-инфекцией, вакцины и эффективности препарата, а также диагностического тестирования, может быть негативное влияние (обзор в 1). Тем не менее, несмотря на его важность, большинство патогенных микроорганизмов исследований рассматривает только отдельные инфекции.

Малярией и ВИЧ-1 (ВИЧ), являются основными причинами заболеваемости и смертности во всем мире. Области малярии и распространенностью ВИЧ поделиться широкий географический перекрытие, положив миллионы людей, подверженных риску сочетанной инфекции и, следовательно, на риск более тяжелой клинической картиной заболевания 2 - 10. Эти две болезни негативно взаимодействовать. У ВИЧ-инфицированных лиц, высших ВИЧ вирусной нагрузки и временных уменьшается в уровень CD4 Т-клеток + можно увидеть во время заражения малярией, в то время какмалярийного паразита тяготы и риск клинического и тяжелой малярии выше в сочетанной инфекцией лиц 2,3,5,7,8,10. Механизмы, с помощью которых ВИЧ увеличивает тяжесть малярии полностью не поняты и требуют дальнейшего расследования.

Здесь мы опишем метод, с помощью которого малярией и ВИЧ ко-инфекции можно изучать в лабораторных условиях. В частности, этот метод позволяет для рассмотрения малярии конкретных иммунных реакций в контексте ВИЧ-инфекции. Наш протокол описывает универсальную систему совместного культивирования с использованием свежевыделенных мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенных из хронически инфицированных ВИЧ доноров и культивированных в лабораторных P. тропической зараженных эритроцитов (PfRBC). Воздействие ВИЧ антиретровирусной терапии этих ответов может быть обследованы с помощью перспективно собранные МНПК от ВИЧ (+) доноры до и после терапии.

Мы использовали эту систему, чтобы исследовать воздействие ВИЧ-инфекциина малярией конкретных врожденных иммунных реакций 11,12, и были в состоянии определить, что малярия конкретных IFN, TNF и ответов обесценились в НК-клеток, клетки, NKT γδ Т-клетки ВИЧ (+) доноры пред- и пост-ВИЧ антиретровирусной терапии , Кроме того, мы смогли использовать эту систему, чтобы определить, что моноцитарные функции также нарушена в ВИЧ (+) доноров, но восстановить сообщению ВИЧ антиретровирусной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол требует набор доноров для сыворотки и РБК быть использованы для паразита культуры, и ВИЧ (+) и неинфицированных доноров для выделения РВМС. Институциональные Обзор платы должен одобрить все исследования и все доноры должны предоставить информированное согласие до ничьей крови.

ВНИМАНИЕ: Работа с образцами крови человека и паразитов малярии человека требует мер предосторожности. Всегда носите пальто лаборатории, перчатки и работу в шкафу биобезопасности уровня 2. В случае случайного чрескожного контакта с человеческой малярии, сообщают здоровью и безопасности для профилактического лечения. Дополнительное рассмотрение безопасности также должны быть введены в действие для работы с ВИЧ (+) крови. Носите назад закрытия халат. Двухместный перчатки (верхняя перчатки должны быть латекс). Выполните все обращения в шкафу биобезопасности уровня 2. Не используйте стакан или острые предметы. Не используйте аспиратор. Поместите все загрязненные предметы в растворе хлорной извести или virox в течение как минимум 1 часа перед утилизацией.Вымойте все поверхности с virox и УФ в течение 1 часа следующего использования. Обратите внимание, что каждое учреждение будет иметь свои специфические правила биобезопасности, которые должны быть соблюдены. Обо всех аварийных воздействий на ВИЧ-инфицированной крови для здоровья и безопасности для оценки и рассмотрения возможных профилактики после контакта.

Примечание: Различные штаммы P. существуют паразиты малярии тропической. ITG был использован для этих экспериментов, но различные штаммы могут быть использованы. Отличные инструкции по замораживания и оттаивания малярийного плазмодия паразитов доступны на веб-сайте MR4 13.

1. Создание RPMI-A для малярийного паразита культуры

  1. Сделать RPMI-0 путем смешивания 950 мл DDH 2 O, 1 пакет RPMI-1640 порошка, 6 г HEPES, 2 г бикарбоната натрия и 1,35 мг гипоксантина.
  2. Оттепель инактивированной нагреванием человеческую сыворотку из двух разных доноров. AB доноры лучше, но любой может быть использован, если паразиты выращивают в типа Oкрасные кровяные клетки (РБК). Обратить трубки перемешать. Если сыворотка содержит твердых частиц или толстый спин на 2000 оборотов в минуту, а затем отфильтровать жидкую часть с помощью блока 0,45 мкм фильтра.
  3. Использование блок фильтров фильтр 0,2 мкм 180 мл RPMI-0, 20 мл сыворотки крови человека (10 мл из каждого донора) и 0,5 мл 10 мг / мл гентамицина.
    Примечание: Человеческая сыворотка может засорить фильтр так, может потребоваться более чем один блок фильтра.
  4. Этикетка среды RPMI бутылку с-А, дату и источник сыворотке. Охладите до необходимости. RPMI-А может превратить облачно, когда в холодильнике. Это нормально, но увеличение облачность знак загрязнения.
    Примечание: Паразит рост может варьироваться в разных доноров сыворотки. Это хорошая идея, чтобы проверить все человеческие сыворотки партий для хорошего роста паразита перед использованием.

2. Подготовка человека эритроциты Parasite культуры

Примечание: Доноры должны быть типа О.

  1. Соберите 7-10 мл крови в кислотно-читскорость-декстрозы (ACD) трубы. Написать идентификатор и дату сбора на этикетке донора.
  2. Магазин крови на 4 о С до тех пор, пока это необходимо. Используйте кровь для паразитов культур в течение 1 месяца.
  3. Протрите верхнюю часть трубы с 70% этанола. Осторожно снимите пробку и выбросить. Передача кровь в 15 мл пробирку. Спин в течение 3 мин при 1000 х г. Удалить плазму аспирации.
  4. Приостановка RBC с равным объемом теплой средой RPMI-0. Спин течение 5 мин при 1000 х г. Удалить слой светлого сгустка крови путем аспирации, ресуспендируют в 5 мл среды RPMI-0 и повторить промывочной еще 2 раза.
  5. Удалить супернатант и добавить достаточно RPMI-A с получением смеси, что составляет 50% по объему RBC.
  6. Хранить при 4 ° С до тех пор, пока это необходимо.

3. Поддержание паразита культур

  1. Предварительно теплой среде RPMI-А 37 о С.
  2. Поместите размороженные паразитов (см MR4 протокол процедуры оттаивания) в колбе Т25 с 5 мл RPMI-A и 75 мкл человеческого промывают RBC для гематокрита ~ 3%.Примечание: Гематокрит измеряет объем эритроцитов по сравнению с общим объемом. Для вычисления гематокрита измерения объема упакованных эритроцитов в общем объеме среды плюс RBC. Предположим, что размороженные паразиты будут способствовать 75 мкл РБК. При добавлении 150 мкл RBC складе (что эквивалентно добавлению 75 мкл упакованной RBC) в колбу есть в общей сложности 150 мкл RBC в 5 мл среды, которая равна гематокрита на 3% (150 мкл / 5000 мкл × 100% = 3%).
  3. Газ колбу в течение 30 сек с паразитом газовой смеси (1% O 2, 3% СО 2, N 2 баланса). Печать и поместить колбу широкой стороной вниз в 37 ° С инкубатор, чтобы позволить наибольшей площади поверхности для газообмена.
  4. Чтобы изменить среду и проверить паразитемией (должно быть сделано в день), тщательно перемещать колбу, чтобы не беспокоить слой РБК. Используя стерильный неподсоединённого пипетки Пастера оттянуть культуральной среды, не нарушая слой крови.
  5. Чтобы проверить годовыхrasitemia, удалить образец 10 мкл из слоя крови, поместить его на предметное стекло и с помощью второго предметного стекла создают тонкую пленку крови. Разрешить слайд высохнуть.
  6. Место 4 мл свежей RPMI-A в колбу, осторожно перемешать, газ в течение 30 сек, и в инкубаторе место при 37 ° С.
  7. Пятно слайд, используя окрашивания комплект Hema3 в соответствии с протоколом производителя.
    1. Для оптимального окрашивания, падение слайды в фиксирующем растворе в течение 10 сек, раствор для меня 10 сек, и решение II в течение 30 сек. Промыть в воде и оставить сушиться слайды.
  8. Рассчитать паразитемии путем подсчета количества PfRBC (окрашенных темно-фиолетовый) по сравнению с общим количеством РБК (окрашенных розовый). Граф в общей сложности 300 ячеек для обеспечения точности.
  9. При паразиты достигли паразитемии 5%, расширить культуры в колбу Т75, используя 40 мл RPMI-A, и 500 мкл RBC.

4. Паразит Синхронизация

Примечание: За день до тон экспериментировать, синхронизировать паразита культуры обработкой аланин. Только паразиты кольцо этап и неинфицированных РБК выживет это лечение. Синхронизация аланин даст вам чистого трофозоита культуры на следующий день, что может быть использовано в со-культуры экспериментов. Убедитесь, чтобы начать с паразитами культуре, содержащей большинство кольцо стадии паразитов.

  1. Готовят раствор аланина путем смешивания 8,01 г аланина (300 мм) и 0,365 г трис (10 мМ) в 300 мл DDH 2 O. Принесите рН до 7,4. Фильтр стерилизовать с помощью блока 0,2 мкм фильтра.
  2. Предварительно теплый раствор аланин до 37 ° С.
  3. Спин вниз культуру паразитов (5 мин х 1000 XG), и удалить среду.
  4. Ресуспендируют осадок в 19 томах аланин раствора (1 мл упакованы РБК 19 мл аланин решение). Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Спин 5 мин х 1000 х г. Аспирируйте супернатант. Стирать в RPMI-0 раз. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в RPMI-A и отрегулируйте уровень гематокрита в ~ 3%. га колбу и возвращения к 37 о С.
    Примечание: совместное культивирование экспериментов минимум паразитемии 5% трофозоиты необходимо, с добавлением 10% паразитемии считать оптимальной.

5. Паразит РБК Подготовка к сокультуры экспериментов

  1. Используйте соотношение 3 PfRBC на PBMC в со-культуры экспериментов, чтобы вызвать воспалительную реакцию. Чтобы вычислить общее PfRBC, количественно паразитемии путем тонкого мазка крови, как описано в 3.5, и гематокрита путем подсчета количества эритроцитов на мл культуры паразита с помощью гемоцитометра.
    Количество PfRBC =% паразитемии х общая РБК / мл х мл культуры. Например: 10 мл культуры в 10 х 10 6 RBC / мл и 10% паразитемии равна 0,1 × 10 6 / мл х 10 мл = 10 х 10 6 PfRBC.
  2. Спин паразита культуру в течение 5 мин при 1000 мкг (RT). Аспирируйте среднего, и ресуспендируют в 6 х 10 6 PfRBC на мл в RPMI-S + (500 мл RPMI-1640 с добавлением L-глютамина и HEPES, 10% теплаинактивированной ФБС, 1,5 мл гентамицина, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, 5 мл 10 мМ MEM заменимых аминокислот, 5 мл 5 мМ -меркаптоэтанол).
  3. Возьмите под свой контроль крови (неинфицированных РБК от того же донора, используемого для поддержания паразита культуры), рассчитать гематокрита и ресуспендируют в среде RPMI-S +, в то же число РБК в мл как паразита культуры.

6. Выделение человеческого мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)

  1. Сбор венозной крови в пробирки с гепарином натрия (зеленый вверху) как с хронической ВИЧ (+), донора и ВИЧ (-) контроля. Не используйте ЭДТА в качестве антикоагулянта, как хелатирующий кальция действия ЭДТА влияет функцию клеток. На среднем ожидали между 5-10 х 10 6 PBMC за 10 мл крови. Для типичного эксперимента собрать 30 мл крови от каждого донора. Объем крови необходимо будет корректироваться в соответствии с экспериментальными требованиям.
  2. Как быстро, как это возможно, и, безусловно, в течение часа крови собираются,удалить кровь из труб и поместить в полиэтиленовый 50 мл пробирку. Моноциты, в частности, будут активированы и придерживаться стекла, поэтому очень важно, что при использовании сбора крови трубки стекла клетки удаляют как можно быстрее.
  3. Спин кровь на 1000 мкг в течение 15 мин и собирают плазму (это может быть использовано для других исследований, необходимых при - если не этот шаг может быть пропущен). Развести крови в равном объеме холодного DPBS.
  4. Поместите 15 мл РТ фиколлом в 50 мл трубки. Медленно, с использованием стерильных пластиковых пипетки передачи, слой крови / DPBS решение за фиколлом без смешивания. Максимум 25 мл крови раствора / DPBS можно наложить на каждые 15 мл Ficoll.
  5. Спин градиенты в течение 30 мин при комнатной температуре при 600 х г в. Убедитесь, что параметр "нет тормоза" на.
  6. Как только клетки развернулся, искать интерфейса между двумя фазами. Это то, где РВМС. Используя стерильный пластиковый передачи пипетки собирать РВМС из интерфейса (смРисунок 1). Свести к минимуму загрязнение РБК.
  7. Поместите собранные клетки в 50 мл пробирки, с не более чем 20 мл на пробирку. Топ труба до 50 мл стерильной холодной DPBS.
  8. Спин клеток в течение 10 мин при 4 ° С при 300 х г в.
  9. Удалите супернатант, ресуспендируют осадок в 5 мл стерильного холодного DPBS и объединить все клетки от того же донора в одной пробирке. Долить до 50 мл стерильной DPBS, и повторите шаги мыть еще 2 раза.
  10. Ресуспендируют клеток в 10 мл RPMI-S + среды.
  11. Удаление 20 мкл аликвоты и смешать с 20 мкл трипанового синего. Внесите 10 мкл в гемоцитометра и посчитать живые клетки (клетки, которые не взяли на себя синюю краску - все синие клетки мертвы). Использование гемоцитометра для подсчета количества клеток в растворе следующим образом.
    Примечание: гемоцитометра имеет сетку заданных размеров, так что площадь, занимаемая линий известно.
    1. Убедитесь, что гемоцитометре чист. Поместите покровное над countiнг площадь. Нагрузка 10 мкл раствора клеточной путем размещения пипетки в одну из скважин клиновидных. Площадь под покровным заполнит под действием капиллярных сил.
    2. Поместите загруженный гемоцитометра под микроскопом. Полный сетка гемоцитометре содержит 9 квадратов 1 мм 2 каждый. Граф все клетки в каждой большой площади. Если слишком много клетки присутствуют, разбавить раствор дополнительно и пересчет.
    3. Рассчитать концентрацию клеток следующим образом: Всего клеток / мл = (общий объем клетки подсчитывали / # квадратов) х разведение фактора X 10000 клеток / мл, например, (500 клеток / 5 квадратов) х коэффициент разбавления 20 х 10000 клеток / мл = 20 Всего х 10 6 клеток.
  12. Регулировка среде до конечной концентрации 10 х 10 6 на мл (RPMI-S + среда).

7. Малярия / ВИЧ-инфекцией Культура

  1. Пластина 100 мкл изолированных МКПК и 400 мкл RPMI-S + среды в 24-луночный планшет (1 × 10 6 РВМС на лунку). Обеспечиватьчто скважины задаются в трех экземплярах: 3 скважины для неинфицированных РБК, 3 скважины с PfRBC, 3 скважины со средним и 3 скважины с PMA / Ionomycin. Это и для ВИЧ (+) и ВИЧ (-) образец.
  2. Для PfRBC скважин, место 3 х 10 6 PfRBC в каждом из скважин (500 мкл паразита культуры, подготовленные в 5,2).
  3. Для неинфицированных эритроцитов скважин, размещать 500 мкл культуры неинфицированных эритроцитов, полученного в 5,3 в каждую лунку.
  4. Для средних скважин, размещать 500 мкл RPMI-S + среды, в каждую из лунок.
  5. Для PMA / иономицином скважин, приготовить раствор РМА / иономицином (2,5 мкг / мл, 250 мкг / мл соответственно). Поместите 500 мкл этого раствора в каждую лунку.
    Примечание: В мощными стимуляторами секреции цитокинов Т-клеток, РМА и Ionomycin используют в качестве положительного контроля, чтобы обеспечить клетки являются функциональными.
  6. Место пластины в 37 о С в 5% СО 2 инкубатора.
  7. Дополнительно: использовать лишние клетки для анализа фенотипической помощью проточной цитометрии или магазин в RNСтабилизация решение для будущего анализа экспрессии мРНК.

8. Выявление малярией иммунного ответа

Примечание: Выполните сокультуры эксперименты до тех пор, как 4 дня. Нет среднего изменения не требуются в течение этого времени. Оптимальная точка времени будет зависеть от типа клеток, представляющих интерес и на поставленный вопрос. Инкубационный из 12-48 ч является оптимальным для моноцитарных ответов на PfRBCs, в то время как ответы лимфоцитов были лучше всего наблюдать в 72-96 ч. Моменты времени необходимо будет оптимизирован на основе экспериментальных вопрос. Короткие периоды (2-4 ч) может использоваться, если взаимодействие между неповрежденной PfRBC и МНПК представляет интерес.

  1. Спин пластины при 300 мкг в течение 3 мин для осаждения клеток. Собирают 700 мкл супернатанта культуры из каждой лунки.
  2. Спин супернатант при 1000 мкг в течение 5 мин, чтобы очистить от мусора.
  3. Алиготе очищается супернатант как нужно, этикетки, и замораживание при температуре ниже -20 ° С до анализа секретируемых факторов не должно быть Перфоrmed.
  4. Анализ ответов цитокинов / хемокинов по ELISA или шарик массива (следовать предложенные протоколы производителя).
  5. Сбор клеток, оставшихся в плите в растворе РНК стабилизации и использовать для анализа экспрессии мРНК путем количественной ПЦР в реальном времени 14-16.

9. внутриклеточного проточной цитометрии для сотовых конкретных Ccytokine ответы с помощью РВМС культивируют совместно с Р. тропической Зараженный РБК

Примечание: Как указано выше, длина совместного культивирования будет зависеть от типа клеток, представляющих интерес. Если Вы заинтересованы в моноцитарных ответов на PfRBC более короткий инкубационный период необходим. Времена будет больше времени для врожденные реакции лимфоцитов γδ Т-клеток, NK-клетки, NKT клетки), и больше сих пор для CD4 и CD8 Т-клеток. Оптимизация потребуется.

  1. 6-8 ч до анализа добавить 1 мкл 1,000x брефелдин А для всех скважин. Верните пластину 37 ° С инкубатор. После 6-8 ч incubвания, место пластины на льду в течение 15 мин.
  2. Удалить клеток из скважин используя энергичные пипетирования и поместить их в маркированные microcentifuge труб. Зачистка может потребоваться удалить моноциты.
  3. Побочные клетки в течение 5 мин при 1000 х г. Удалить супернатантами. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера проточной цитометрии (1x DPBS, 2% инактивированной ФБС тепла, 0,02% азида натрия).
  4. Разделить клетки таким образом, что каждый образец имеет: одну трубку для полного окрашивания антител (240 мкл) и одну трубку для окрашивания флуоресцентной минус один (предприятие) контрольным антителом (240 мкл). Бассейн небольшое количество каждого образца (20 мкл) для неокрашенной проточной цитометрии контроля (это будет использоваться в создании проточного цитометра).
  5. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
  6. Инкубируйте клетки с неконъюгированного анти-CD16 человека / CD32 (5 мкг / мл) в 50 мкл буфера проточной цитометрии в течение 15 мин при 4 ° С, чтобы блокировать рецепторы Fc.
  7. Добавить 1 мл буфера проточной цитометрии в каждую пробирку. Спин CEзаполняет течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
  8. Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера проточной цитометрии с предварительно титруют концентрации флуорофора-сопряженных антител к желаемым маркеров клеточной поверхности. Премикс раствор достаточно антитела для всех образцов, окрашенных. Инкубируйте клетки при 4 ° С в течение 20 мин. Защита от light.Note: Сумма каждого антитела должны быть оптимизированы. Мы регулярно окрашивать для CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Титруют объемы этих антител показаны в Таблице 1.
  9. Добавить 1 мл буфера проточной цитометрии в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
  10. Добавить 100 мкл cytofix / Cytoperm решения в каждую пробирку. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 4 ° С. Защищать от света.
  11. Добавить 1 мл Пермь / промывочного буфера (при условии, как 10x концентрата - разбавить до 1x, используя DDH 2 O) в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
  12. Добавить 100 мкмл Перми буфер / помыть управления Предприятие окрашивания антител труб и смешать ресуспендировать клетки.
  13. Добавить 100 мкл Пермь / промывочного буфера с заранее титруют концентрации флуорофорных-сопряженных антител к желаемым внутриклеточных маркеров (т.е., цитокинов / хемокинов) до полного окрашивания антител труб.
    Примечание: Количество каждого антитела должны быть оптимизированы. Мы регулярно окрашивать с анти-ФНО и анти-IFN, антител. Титруют объемы этих антител показаны в Таблице 1.
  14. Выдержите все трубы в течение 30 мин при 4 ° С. Защищать от света.
  15. Добавить 1 мл Пермь / Wash буфера в каждую пробирку. Спин клетки в течение 5 мин при 500 х г в. Удалить супернатантами.
  16. Ресуспендируют клеток в 300 мкл буфера проточной цитометрии с 1% параформальдегида. Пусть сидят в течение как минимум 15 мин, чтобы нейтрализовать ВИЧ.
  17. Подготовка одного антитела окрашенных образцов с использованием компенсации бусы, которые будут использоваться для компенсации, установленной на проточном цитометре. Тип компенсациишарики будут зависеть от используемых антител (т.е.., против мышиного Ig, анти-крысиного / хомяка Ig). Вихревые шарики. Добавьте одну каплю шариков на антитела. Добавить равное количество антител, которые используются для окрашивания. Добавить 200 мкл буфера проточной цитометрии. Они теперь готовы к использованию. Там нет необходимости мыть шарики.
  18. Приобретение образцов на проточном цитометре, как можно скорее и в течение 24 часов для достижения наилучших результатов. Тандем красители чувствительны к диссоциации с хранения, поэтому мы рекомендуем немедленно приобретение, если это возможно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Графики показывают уровни IFN & gamma продукции из NKT клеток (рисунок 2), используя CD56 + CD3 + γδ- ворота, чтобы получить популяцию клеток NKT (данные не показаны). Клетки культивировали в течение 72 ч до окрашивания. После того, как пятна, 100000 CD3 + клетки были приобретены на поток цитометр, чтобы получить достаточно большие популяции НК, НКТ и γδ клеток (клеток интерес). Минимум 5600 НКТ клеток выводятся на каждом графике. Выработку ФНО получают таким же способом, (данные не показаны). Графи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наш протокол был оптимизирован для того, чтобы наиболее реалистично изучения ВИЧ-малярии ко-инфекции в пробирке. Во-первых, свежие эритроциты человека и сыворотки необходимы для малярийного паразита культуры. Это жизненно важно для получения здорового населения малярийных паразитов. Паразитов лизаты не может быть заменен на живых паразитов, как продукция цитокинов гораздо быстро и интенсивно при использовании живой P. тропической инфицированных РБК (PfRBC) 17,18. Кроме того, активация клеток...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

C.A.M.F. и L.S. участвовали в разработке протокола, сборе и анализе данных, а также в составлении статьи.

Авторы хотят поблагодарить доктора Кейна, доктора Лутфи, доктора Васмута и доктора Айи за их вклад.

C.F. был поддержан стипендией CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) для постдокторантов. L.S. получил поддержку от OHTN Junior Investigator Development Award. Настоящая работа была поддержана операционным грантом Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) (MOP-13721 и 115160) и грантом CIHR New Investigator Catalyst.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
аланинSigmaA7377
антитела (см. другую таблицу)
BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlugBD555028включает брефельдин А, цитофикс/цитопермский буфер и буфер для перманентной завивки/промывки
BD Vacutainer ACD Solution ABD364506
BD Vacutainer Sodium HeparinBD17-1440-02
DPBS (без кальция, без магния)Corning21-031-CV
Фетальная бычья сывороткаSigmaF1051термическая инактивация перед применением
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
гентамицин (10 мг/мл)Gibco15710-064
Hema3 Окрашивающий наборFisher122-911
HEPESFisherBP310-500
гипоксантинSigmaH9636
иономицинSigmaI3909
MEM заменимые аминокислоты (10 мМ)Gibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640 порошокLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 с L-глутамином и HEPESThermo НаучныйSH30255.01
Бикарбонат натрия (порошок, клеточная культура)SigmaS5761
Пируват натрия (100 мМ)Gibco11360
Трис (основание Тризмы)SigmaT6066
ТризолАмбион15596018
трипановым синим (0,4%)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845зависит от используемых антител
Паразитная газовая смесьПо специальному заказу3% CO2, 1% O2, баланс N2
Equipment
0.2 μ m фильтрующий блок
Стеклянные предметные
T25 колбы T75 колбы
50 мл пробирки
24 луночные планшеты
заглушки Пастеровские пипетки
заглушкой Пастеровскиепипетки
стерильные переносные пипетки,
проточный цитометр (3 лазера)
<сильные>антитела, используемые для проточной цитометрии
анти-TNFeBiosciences551487FITC (флуорофор) 2 μ l
Анти-ИФНγБиолегенда506507ПЭ (флуорофор) 20 μ
l Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (флуорофор) 1 μ
• Анти-CD14Biolegend; BD Biosciences325624; 551487Биотин (флуорофор) 0.5 μ l Стрептавин ПЕ-ТР (флуорофор) 0,1 μ l
Anti-CD56Biolegend318322PerCP/Cy5.5 (флуорофор) 5 μ l
Анти-γ δBiolegend331212APC (флуорофор) 5 μ l
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (флуорофор) 5 μ l
Anti-CD4Biolegend317424тихоокеанский синий (флуорофор) 1 μ л
стекладля культивирования без с гемоцитометр,

Ссылки

  1. Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
  2. French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
  3. Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
  4. Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
  5. Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
  6. Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
  7. Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
  8. Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
  9. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
  10. Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
  11. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
  12. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
  13. Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
  14. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  15. Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
  18. Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
  19. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  20. Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102(2012).
  21. Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
  22. Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
  23. Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
  24. Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
  25. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
  26. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
  27. Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Plasmodium falciparum2
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.