Методическая статья

Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

23 октября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Понимание сложных действий мозга требует передовых исследовательских инструментов. Здесь мы демонстрируем новую 3D-модель нервной ткани на основе шелка и коллагена, напоминающую архитектуру, подобную мозгу. Модель может быть использована для изучения сборки нейронной сети, аксонального руководства, межклеточных взаимодействий и электрической активности.

Аннотация

Несмотря на огромные усилия по расшифровке анатомии, состава и функции мозга, он остается наименее изученным органом человеческого тела. Чтобы получить более глубокое понимание нервной системы, ученые стремятся упрощенно реконструировать ткань, собрав ее in vitro из основных строительных блоков с использованием подхода тканевой инженерии. Наша группа разработала тканеинженерную 3D-модель мозга на основе шелка и коллагена, напоминающую белое и серое вещество коры головного мозга. Модель состоит из шелковой пористой губки, которая предварительно засеяна нейронами мозга крысы, погруженными в мягкую коллагеновую матрицу. Наблюдается разрастание поляризованных нейронов и формирование сети при раздельной локализации аксонов и тела клетки. Такая компартментная архитектура позволяет разрабатывать уникальные ниши, имитирующие нативную нервную ткань, что позволяет проводить исследования сборки нейронных сетей, аксонального руководства, межклеточных и межклеточных взаимодействий и электрических функций.

Введение

Центральная нервная система (ЦНС) могут быть затронуты различными нарушениями, связанных с сосудистой, структурные, функциональные, инфекционный или дегенеративный. По оценкам 6,8 млн человек ежегодно умирают в результате неврологических расстройств, что представляет собой растущую социально-экономическое бремя во всем мире 1. Тем не менее, лишь немногие из нарушений есть доступные процедуры. Таким образом, существует острая необходимость в инновационных терапевтических стратегий для пациентов, страдающих от неврологических расстройств. К сожалению, многие ЦНС целевые терапевтические неудачу в ходе клинических испытаний, в частности, из-за использования неадекватных доклинических исследований моделей, которые не позволяют оценить острых и хронических воздействий с физиологически соответствующих функциональных показаний.

Несмотря на значительные усилия исследования в течение последних десятилетий, есть огромное количество неизвестно о структуре и функции ЦНС. Для того, чтобы получить больше знаний, модели животных часто намред модели патологических состояний, таких как травмы головного мозга травматического (TBI) или слабоумия, особенно в доклинических исследованиях. Тем не менее, животные существенно отличаются от людей как в анатомии ЦНС, а также в функции, экспрессии генов и метаболизма 2-4. С другой стороны, 2D культур в пробирке являются распространенным методом для исследования клеточной биологии и которые обычно используются для открытия новых лекарств. Однако культуры клеток 2D хватает сложность и физиологическое значение по сравнению с человеческим мозгом 5-7. Хотя не является заменой для низкой стоимости и простоты 2D исследований на клеточных культурах или сложности, предоставленной на животных моделях, 3D тканевой инженерии может генерировать усовершенствованные исследовательские модели, чтобы закрыть разрыв, который существует между 2D в пробирке и в естественных подходов. 3D тканевой инженерии обеспечивает более физиологически соответствующие экспериментальные условия, достигнутые 3D межклеточных взаимодействий и внеклеточных сигналов, предусмотренных биоматериала лесов. DespITE значительное доказательство за стоимости 3D культур, в настоящее время существует лишь несколько моделей ткани 3D ЦНС, таких как стволовые клетки получены Органоид культур 8-10, neurospheroids 11 и диспергируют гидрогеля культуры 12,13. Перспективные технические методы, включая многослойной литографии 14, и 3D-печати 15 были использованы для изучения легких, печени, почек и ткани. Тем не менее, есть отсутствие моделей 3D ЦНС, которые позволяют на секции роста нейронов, таких как имитируя корковой архитектуру и биологию. Отдельно рост нейритов из нейрональных клеток органов ранее продемонстрировано в 2D культур с помощью микрообработки 16,17 позволяя изучение трассировки аксонов тракта, притока кальция, сетевой архитектуры и деятельности. Эта идея вдохновила нас к разработке 3D поляризованного нервной ткани, где сотовые органы и аксонов массивы, расположенные в разных отсеках имитируя многоуровневую архитектуру мозга 18 . Наш подход основан на использовании уникального дизайна шелковой лесов который вмещает высокую плотность клеток в ограниченном объеме и позволяет разрастание плотной аксонов сети в коллагеновый гель. Здесь мы демонстрируем полную процедуру сборки головного мозга, как ткани, включая изготовление лесов и нейронов культуры.

Протокол

Протокол изоляции ткани мозга была одобрена Institutional Комитета по уходу и использованию животных Университета Тафтса по и соответствует Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care и использования комитета B2011-45).

1. Подготовка Шелковый леса

  1. Подготовка раствора из шелка тутовый шелкопряд коконов, как описано ранее 19,20.
    1. Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов в течение 5 г фрагментированных коконов. (15 мин)
    2. Подготовьте 2 л 0,02 М Na 2 CO 3 раствором и довести его до кипения, используя горячую плиту. (15 мин)
    3. Взвесьте 5 г фрагментированных коконов и варить их в Na 2 CO 3 раствором в течение 30 мин. Движение кипящей шелковые каждую пару минут с помощью шпателя. Этот шаг, называемый также де-гуммирование, очищает фиброин шелка из гидрофильных белков, sericins. (30 мин)
      4. Отожмите фиброин от руки и промойте его в дистиллированной воде, по крайней мере три раза, чтобы промыть все оставшиеся серицин и химических веществ. (5 мин)
    4. Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушить экстракт фиброина в капот потока O / N.
    5. На следующий день взвешивают сухой массы фиброина и поместите фиброин в стеклянном стакане. (15 мин)
    6. Для того, чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитать необходимый объем (в мл) LiBr путем умножения массы сухого фиброина на 4. Медленно залить LiBr раствора над шелковой фиброина и погружают все фиброина волокон с помощью шпателя. Накройте стакан для предотвращения испарения и поместить его при 60 ° С в течение 4 ч, чтобы позволить волокна, чтобы растворить. (15 мин)
    7. Использование шприца, собирать фиброина решение от стакана и загрузить его в MWCO 3500 диализных кассетах. Выполнение диализ против дистиллированной воды в течение 48 ч. Меняйте воду каждые два часа.
    8. Использование шприца, собирать фиброина решение откассеты в 50 мл конические пробирки и центрифугируют дважды при 9000 оборотах в минуту (~ 12700 х г) при 4 ° С в течение 20 мин. Налейте надосадочную жидкость в новую пробирку после каждого шага центрифугирования и отбросить гранул. (40 мин)
    9. Измерение концентрации фиброина путем оценки сухого веса. Залить 1 мл раствора шелка в весовой лодке. Сушат образца в печи при 60 ° С в течение 2 ч. Взвесить сухой фиброин шелка и расчета концентрации шелка фиброина раствора путем умножения полученного вес 100. ожидаемую концентрационную шелка раствора 6-9% (вес / объем).
    10. Регулировка концентрации шелка до 6% (вес / объем) разбавлением дистиллированной водой.
      Остановка точка: жидкость шелк фиброина можно хранить при 4 ° С в течение одного месяца в закрытом контейнере.
  2. Подготовка пористых каркасов из шелка решения.
    1. Сито гранулированного NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, который будет использоваться на последующих этапах. Откажитесь от гранулс размером менее 500 мкм и выше 600 мкм. (15 мин)
    2. Налейте 30 мл 6% раствора шелка в политетрафторэтилена (ПТФЭ) формы (Рисунок 1). Аккуратно рассеивают 60 г просеянной NaCl над шелка. Нажмите контейнер, чтобы получить однородный слой соли. Инкубируют 48 ч при комнатной температуре для полимеризации шелк.
    3. Поместите строительных лесов, содержащего ПТФЭ форму в печи при 60 ° С в течение 1 часа, чтобы завершить полимеризацию и испарить оставшуюся жидкость.
    4. Поместите содержание ПТФЭ плесени в химический стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды в течение 48 ч, чтобы выщелачивание соли. Менять воду 2-3 раза в день. Извлеките губку каркасов из форм, когда соль полностью вымывается точки остановки:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания.
    5. Когда все будет готово, вырезать подмости с 5 мм диаметром биопсии удар. Нарезанные каркасов для достижения около 2 мм в высоту. ПуNCH ​​из центра на эшафот с 2 мм биопсии удар диаметр (рис 2А). (1 час)
    6. Автоклав каркасов погружают в воду, чтобы стерилизовать их (мокрый цикл, 121 ° C, 20 минут) Остановка точку:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания.
    7. Перед запланированной посева клеток, погружают каркасов в стерильной 0,1 мг / мл поли-D-лизином раствора (PDL). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
    8. Промыть 3 раза каркасы с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы удалить не связанный PDL. (30 мин)

2. Выделение Крыса корковых нейронов

  1. Проанализируйте кору из эмбриональных день 18 (E18) Спрэг Dawley крыс, как описано ранее Пачифичи и Перуцци 27 после утвержденного протокола животное получается. (2 ч)
  2. Инкубируют 10 кору в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазы I (от поджелудочной железы быка) в течение 20 мин при 37 ° С.
  3. Инактивации трипсина, добавив равный объем 1 мг / мл соевого белка.
  4. Растирают кору, используя 10 мл пипетки Пастера от пипетки вверх и вниз 20 раз, пока один клеточной суспензии не генерируется. Будьте нежны и избежать образования пузырьков воздуха. (10 мин)
  5. Центрифуга клеточной суспензии в 127 мкг в течение 5 мин.
  6. Повторное приостановить осадок клеток в 10 мл культуральной среды (Neurobasal среднего, 1x B27 добавки, 1x Glutamax, 1% пенициллина / стрептомицина). Граф клеток. Ожидаемый концентрации клеток примерно 2х10 7 / мл. (20 мин)

3. Построить Ассамблею и культура

  1. Леса посев с клетками.
    1. Перемещение стерильные каркасов и все необходимые столовые приборы внутри капот культуре клеток. Использование стерильного пинцета поместить каркасы в клеточной культуре 96-луночного планшета выделении одного каркас на лунку. (10 мин)
    2. Погрузитесь каркасов в среде для культивирования клеток, чтобы уравновесить их до клеток семениIng. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. (10 мин)
    3. Аспирируйте избыток среды от лесов.
    4. Применить 100 мкл клеточной суспензии / эшафот. (10 мин)
    5. Инкубируйте клетки при 37 ° CO / N, чтобы для прикрепления клеток к плахе.
    6. На следующее утро аспирации непривязанными клетки и применить 200 мкл / лунку свежую культуральную среду. (10 мин)
  2. Строительные леса встраивания с коллагеновой матрицы. (2 ч)
    1. Поместите 10x PBS, водой, 1 N NaOH и хвоста крысы коллагена на льду. Подготовка рабочего раствора коллагена в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание на льду до конструкты клеток-затравку не готовы (до 1 ч).
    2. Удалить клеточные семенами шелковые конструкции из инкубатора и аспирата избыток среды.
    3. Использование стерильного пинцета передачи каркасов на пустые лунки на пластину погружают а каждый и каркас в 100 мкл 3 мг / мл раствора коллагена. Поместите планшета для культуры ткани обратнов инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полимеризации коллагена.
    4. Применить 100 мкл подогретого клеточной культуральной среды / лунку. Культура конструкты в течение одной недели замены среды ежедневно путем замены только половину объема среды.

4. Анализ микроскопии

  1. Live / мертвых окрашивания (1 час)
    1. Подготовка исходного раствора пропидийиодидом (PI) 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде.
    2. Подготовка исходного раствора флуоресцеина диацетата (FDA) 2 мг / мл в ацетоне.
    3. Подготовить рабочий раствор, содержащий 10 мкМ PI и 0,15 мкМ FDA разбавленный в PBS. Предварительно нагреть раствор до 37 ° С на водяной бане.
    4. Вымойте клеток с подогретого PBS, чтобы удалить сывороточные эстеразы. Аспирируйте PBS.
    5. Нанесите подогретого рабочего раствора на клетки в течение 2 мин и промойте его PBS.
    6. Используйте эпифлуоресцентной микроскопа изображение клетки (ПИ экс λ = 490 нм, λ = EM 570 нм; FDA экс Л = 490 Нм, ет λ = 514 нм). Пятно остается стабильным в течение 40 мин. Длительное окрашивание может привести к неспецифической окрашивания в результате поглощения PI клетками и со-локализации ИП / FDA в клетках.
  2. Иммуноокрашивание
    1. В заданное время точки культуры фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Из-за токсичности PFA дымит шаг крепления должны быть выполнены в химической вытяжкой.
    2. Промыть каркасов с 3x PBS точки остановки:. ПФА-фиксированные конструкции могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, прежде чем приступить дальнейших шагов.
    3. Инкубируйте каркасов в 0,2% Triton, 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, содержащие первичное антитело O / N при 4 ° С.
    4. На следующий день отказаться от окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного первичного антитела.
    5. Инкубируйте образцы с вторичным антителом, разведенным в 0,2% Тритон, 0,25% BSA в PBS в течение 2ч при комнатной температуре.
    6. Удалить окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного вторичного антитела.
    7. Изображение каркасы, использующие конфокальной микроскопии с 20X цели, принимая 100 мкм Z-секции образца с 1 мкм шагом. Для визуализации тонких нейриты разрешение изображения должно быть минимальной 1,024 х 1,024 пикселей.
  3. РНК, ДНК и белка изоляция
    Примечание: РНК, ДНК и выделение протеина, использу коммерческий AllPrep ДНК / РНК / белок Mini Kit в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Использование стерильного пинцета передачи каркасов из культурального планшета в 2 мл стерильной пробирке. Разместите один эшафот за трубку.
    2. Добавить 200 мкл буфера RLT в каждую пробирку.
    3. Лишить конструкцию фрагментируя его стерильными microscissors.
    4. Для гомогенизации нарушенную ткань, передавать содержимое тубы на ротационную колонку. Спин в течение 2 мин на полной скорости в микроцентрифуге.Лизат гомогенизируют, как она проходит через ротационную колонку.
    5. Собирают поток через и использовать его немедленно выделения РНК, ДНК и белка в соответствии с протоколом производителя.
    6. Количественно выход нуклеиновых кислот любой другой совместимый метод (например, NanoDrop).
    7. Количественная выход белка, используя BCA анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте результаты анализа с помощью планшетного на длине волны 562 нм.
      Примечание: Ожидаемый выход нуклеиновых кислот и белка в конструкции по отношению к плотности клеток, показан на рисунке 4.

Результаты

Твердые шелковые губки нарезанные по форме пончика, представляют собой уникальную и простую идею, чтобы достичь разобщенным архитектуру, напоминающую нервной ткани (рис 2а). Высоко пористая структура помост с размером пор 500 мкм приводит к исключительно высокой площадью поверхности, позволяющих посев и рост высокой плотности клеток в малом объеме (2x10 7 / мл) (2В). Кроме того, высокая пористость эшафот позволяет для неограниченного распространения питательных веществ и отходов, образующихся в превосходной жизнеспособности плотных клеточных культур в течение длительного времени кадров. После посева нейроны быстро и равномерно прикрепить к поверхности каркасных порах.

После прикрепления клеток является полным и клетки уравновешивали в шелковой подложке, губка каркас заполняется мягкой коллагеновой матрицы, чтобы обеспечить среду для 3D аксонов формирования сети (рис 3 ). При отсутствии в коллагеновой матрице Компартментализация аксонов и клеточных тел невозможно, так как нейроны растут расширения только на поверхности пор в результате смешанных сетей, как обнаружено с 2D поверхностей (фигура 3В). В противоположность этому, коллагеновый гель обеспечивает сетчатую структуру, которая поддерживает обширный аксонный отросток в 3D, а нейронные клеточные тела остаются прикрепленными к шелковой помост (рис 3C). Эта модель роста приводит к разобщенности клеток органов и чистых аксонов сетей (рис 3D), который напоминает серого и белого вещества коры головного мозга.

Помимо микроскопии, конструкции могут быть оценены с различными другими методами 18, в зависимости от вопроса за эксперимента. Например, выделение ДНК, РНК и белка из конструкций может быть легко выполнена с использованием коммерческих наборов (рисунок 4). Выход нуклеиновых кислот и белков PEг конструкция зависит от количества клеток изначально посеянных на шелковых каркасов. Чем больше клеток высевали тем выше выход ДНК, РНК и белка.

figure-results-1
Рисунок 1. ПТФЭ формы используются для приготовления шелк губка лесов Размеры:.. 10 см в диаметре, 2 см высота Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. 3D мозга, как модель ткани. (А) пористого шелк губка эшафот. (Б) Live / мертвых окрашивания нейронов в 1 день на посев на шелковой эшафот, прежде чем коллаген встраивания (зеленый-живых клеток, красных мертвые клетки). Панели на правой стороне показать маgnification площади захваченного в красных рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. нейронов разобщенным вырост в 3D-модели мозга, как ткани (A) Леса отсеков:. Кузовом купе красных клеток, Blue-купе аксонов. (Б) нейронов модель роста в 1-й день после посева до коллагена вложения. (С). Нейронов вырост на 7 день после посева в теле клетки отсека. (D) нейронов вырост на 7 день после посева в аксонов отсеке. Зеленый -. ΒIIITubulin Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этогофигура.

figure-results-4
Рисунок 4. Ожидаемые выход (A) РНК и ДНК, и (б) белка в конструкции по отношению к количеству клеток, посеянных на эшафот (± SD, п = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Обсуждение

В этой статье мы описали рекомендации по сборке разделенной 3D-модели ткани, похожей на мозг. Модель характеризуется плотной поляризованной культурой нейронов, что приводит к развитию двух морфологически различных компартментов: один содержит плотно упакованные клеточные тела, второй — чистые аксональные сети. В целом, архитектура каркаса и характер роста имитируют корковую ткань головного мозга, включая шесть ламинарных слоев и тракты белого вещества21.

Модель ткани на основе шелкового белка в форме пончика позволяет модифицировать и настраивать механические свойства, универсальные структурные формы, гидрогелевые наполнители и клеточные компоненты. Таким образом, эта тканевая модель создает базовую платформу для широкого спектра исследований. Шелк является благоприятным кандидатом для платформ биоматериалов благодаря своей биосовместимости, обработке на водной основе, а также надежным механическим и разрушающим свойствам22. Шелковая матрица также служит стабильным якорем для уменьшения сокращения коллагенового геля с течением времени в культуре. Такие свойства, как концентрация шелка и пористость каркаса, используемые в этой модели, были предварительно скорректированы для достижения оптимального роста клеток и механических свойств, приводящих к эластичности мозговой ткани18,23,24. Мы предлагаем поддерживать эти параметры постоянными, чтобы обеспечить успешный результат и воспроизводимость экспериментов.

Формирование 3D-нейронной сети было достигнуто путем объединения двух типов биоматериалов с различными механическими свойствами: жесткого каркаса для обеспечения закрепления нейронов и более мягкой гелевой матрицы для обеспечения проникновения аксонов и связи в 3D. Селективные предпочтения материалов шелкового каркаса и мягкого гидрогеля обеспечивают основной принцип отделения нейронов от аксональных связей. Из-за инертной природы шелкового каркаса для прикрепления нейронов требуется функционализация поли-D-лизином. Тем не менее, могут быть применены другие факторы, способствующие клеточной адгезии, такие как RGD25 или фибронектин26. Для формирования 3D-сети шелковый каркас необходимо своевременно заполнить гидрогелем, как только нейроны прикрепятся к каркасу. Аналогичным образом, филлер коллагенового матрикса может быть заменен другими гидрогелями, что позволяет изучать влияние трехмерных внеклеточных сред на формирование аксональной сети и служить платформой для оценки новых гидрогелей с точки зрения совместимости нейронов. Кроме того, помимо нейронов коры головного мозга крыс, могут быть использованы и другие нейронные источники, такие как нейроны гиппокампа или нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных клеток (iPSc). Кроме того, тканевая модель может быть использована для изучения гетероклеточных взаимодействий путем включения глиальных клеток вместе с нейронами, а также для создания более сложной мозговой ткани.

Как было показано ранее, наша модель может быть использована для оценки функциональности нейронов в трехмерном микроокружении с помощью различных анализов, таких как жизнеспособность клеток, экспрессия генов, ЖХ-МС/МС и электрофизиология, тем самым демонстрируя физиологическую значимость модели18. Другие методы, которые часто используются для оценки 3D-тканеинженерных конструкций, такие как иммуноокрашивание и микроскопия8,9,11 , также могут быть использованы для оценки распределения клеток и степени формирования аксональной сети. Однако следует отметить, что из-за высокой плотности коллагенового матрикса проникновение антител и глубина визуализации ограничены несколькими сотнями микрометров. Кроме того, на отношение сигнал/шум может влиять неспецифическая фоновая флуоресценция. Это можно преодолеть с помощью липофильных клеточных индикаторов и генетически экспрессированных флуоресцентных белков, которые уменьшают потребность виммуноокрашивании. В качестве альтернативы, визуализация может быть выполнена с помощью 2-фотонной микроскопии вместо обычного однофотонного метода, что может уменьшить потерю сигнала, фотообесцвечивание и может быть увеличено до нескольких сотен микрометров на глубину.

Подводя итог, можно сказать, что мозговая ткань на основе шелка и коллагена предлагает надежную платформу для изучения нейронных сетей в 3D и является отправной точкой для разработки более продвинутых моделей неврологических расстройств в будущем. Независимо от способа оценки, относительная простота этой модели ткани поддерживает ее полезность, успех и воспроизводимость.

Раскрытие информации

Публикация этого видео-статьи авторами Corning.

Благодарности

Мы благодарим лабораторию доктора Стивена Мосса за предоставление эмбриональных тканей мозга крысы. Доктор медицинских наук разработал оригинальный протокол. Эта работа была профинансирована грантом Национального института здравоохранения P41 Ресурсного центра тканевой инженерии EB002520. К.С. получил стипендию для постдокторантов от Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) (CH 1400/2-1).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
диализные кассеты MWCO 3500 Thermo Fisher66110
Нагревательная пластинаFisher ScientificIsotemp
Centrifuge 5804 REppendorf
СитоFisher ScientificNo. 270, No. 35, No. 30
из ПТФЭсобственного производства (Рисунок 1) 10 см диаметр, высота 2 см
NaClSigma-Aldrich71382
Пуанс для биопсии 5  mmWorld Precision Instrument501909
Biopsy Punch 2  мм World Precision Instrument501908
поли-D-лизинаSigma-AldrichP6407-5MGконечная концентрация 10  μ г/мл, растворенный в воде
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
ТрипсинSigma-AldrichT4049-500ML
DNазаRoche10104159001конечной концентрацией 0,3%
Соевый белокSigma-AldrichT6522-100MGконечная концентрация 1  мг/мл
Нейробазальная средаGibco21103049прогреть до 37  ° C перед применением
добавка B27 50xGibco17504-044
ГлутамаксGibco35050-061
Пеницилин стрептомицинCorning30-002-CI
Коллаген I, крысиный хвост, 100  мгCorning354236конечной концентрации 3  мг/мл
NaOHSigma-AldrichS2770коррозионный
йодид пропидиумаSigma-AldrichP4170-10MGтоксичный
диацетат флуоресцеинаSigma-AldrichF7378-5G
Olympus MVX10Olympus
параформальдегидSigma-AldrichP6148токсичный, конечная концентрация 4%
бычий Сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906-10G
анти-&бета; IIIТубулин антитела Sigma-AldrichT2200кролик 1:500
анти-кролик Alexa-546молекулярные зондыA11010козья сыворотка 1:250
козья сывороткаSigma-AldrichG9023-5ML
Leica SP2 конфокальный микроскоп Leicaобъектив 20X
QIAизмельчительQiagen79654
AllPrep мини-набор ДНК/РНК/белкаQiagen80004
Спирт этиловый, чистыйSigma-AldrichE7023 
2-МеркаптоэтанолSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis спектрофотометрThermo Scientific
BCA анализ белкаThermo Scientific23225
Планшетный ридер Spectramax M2Молекулярные устройстваабсорбция 562 нм
Микроножницы, эконом, тип VannasTedPella1346
Форма

Ссылки

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.