Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52976

⸱

13 января 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

В этой статье

Краткое содержание

Вот протокол представлен для измерения бактериальной захвата CD4 + Т-клеток, которые произошли во время презентации антигена через transinfection из предварительно зараженных дендритных клеток (ДК). Мы покажем, как выполнить необходимые шаги: изоляция первичных клеток, инфекции формирования сопряженной клеток DC, DC / T, и измерения бактериальной трансфекции Т-клеток.

Аннотация

Недавно мы показали, вопреки описанному, что CD4+ Т-клетки, парадигма адаптивных иммунных клеток, захватывают бактерии из инфицированных дендритных клеток (ДК) с помощью процесса, называемого трансинфекцией. Здесь мы опишем анализ процесса трансинфекции, который происходит в ходе презентации антигена. Этот процесс был раскрыт с использованием CD4+ Т-клеток трансгенных мышей OTII, которые несут Т-клеточный рецептор (TCR), специфичный к пептиду овоальбумина (OVAp), который, следовательно, может образовывать стабильные иммунные комплексы с инфицированными дендритными клетками, загруженными этим специфическим OVAp. Динамику бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), во время передачи DC-T-клеток можно контролировать с помощью визуализации живых клеток, а количественную оценку бактериальной трансинфекции можно проводить с помощью проточной цитометрии. Кроме того, трансинфекция может быть количественно определена с помощью более чувствительного метода, основанного на использовании гентамицина, непроницаемого аминогликозидного антибиотика, убивающего внеклеточные бактерии, но не внутриклеточные. Этот классический метод ранее использовался в микробиологии для изучения эффективности бактериальных инфекций. Ниже мы объясняем протокол всего процесса, от выделения первичных клеток до количественной оценки трансинфекции.

Введение

Если патоген поражает своего хозяина, обычно активация врожденных и адаптивных реакций иммунной, необходимых для бактериальной очистки. Врожденный иммунитет является первой линией обороны, что не позволяет большинству инфекций. Врожденный иммунитет отличать через точный способ элементов, которые сохраняются среди широких групп микроорганизмов (патоген-ассоциированных молекулярных моделей, PAMPs) 1. Механизмы врожденного иммунитета включают в себя физические барьеры, такие как кожа, химикаты барьеры (антимикробные пептиды, лизоцим) и врожденные лейкоциты, которые включают фагоциты (макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки), тучные клетки, эозинофилы, базофилы и естественных клеток-киллеров 2. Эти клетки выявить и устранить болезнетворные микроорганизмы, либо, нападая на них при контакте или через фагоцитоза, который включает в себя возбудитель охватившим и убийство. Эта система не позволяет на протяжении всей жизни оборону, в отличие от адаптивного иммунитета, которые придают иммунологическую память против рathogens. Адаптивная иммунная система является второй линией обороны и способна распознавать и реагировать на специфические антигены множественной микробной и не микробные-веществ 3. Основными компонентами адаптивной иммунной системы являются лимфоциты, которые включают В- и Т-клеток. В-клетки участвуют в гуморального ответа, секретирующие антитела против патогенов или экзогенных белков. Однако Т-клетки представляют собой клеточный иммунитет, модуляции иммунного ответа цитокинами секреции или убивают патогенов клеток, инфицированных 4.

Антиген-представляющих клеток (БТР), включая дендритные клетки или макрофаги, составляющих иммунной системы, могут признать фагоцитировать патогенов и процесса бактериальных компонентов в антигенов, которые представлены на поверхности клеток в главный комплекс гистосовместимости (МНС). 5-7 После БТР уже фагоцитируются патогенов, они, как правило мигрируют в лимфатические узлы слива, где они взаимодействуют с Тклеток. Т-лимфоциты могут распознавать специфические комплексы пептид-МНС их Т-клеточных рецепторов. Иммунная синапса (ИС) имеет место на границе раздела между антиген-АПК и загружен лимфоцита в течение презентации антигена 8,9. Некоторые бактерии могут выжить фагоцитоз и распространять систематически в течение БТР. С этой точки зрения, зараженные БТР служить бактериальных водоемов или "троянских коней", которые облегчают распространение бактерий 10. Интимная контакт между БТР-лимфоцитов и, которые имеют место в ходе формирования также функционировать в качестве платформы для обмена части мембраны, генетический материал и экзосом и может быть угнан для некоторых вирусов заражают Т-клеток; Этот процесс называется transinfection 11-13.

Некоторые патогенные бактерии (Listeria моноцитогенес, сальмонеллы enterica и шигеллы Флекснера) могут вторгнуться в Т-лимфоциты в естественных условиях и изменить свое поведение 14-16. У нас естьНедавно описано, что Т-лимфоциты также могут захватывать бактерии от transinfection от ранее инфицированных дендритных клеток (DC) в течение 16 презентации антигена. Т-клеток бактериальной захват transinfection чрезвычайно более эффективной (1,000-4,000x), чем прямые инфекций. Т клетки патогена захват и непатогену бактерии с указанием, чем transinfection является процесс, движимый Т-клеток. Поразительно, transinfected Т (Тит) клетки быстро убили захваченных бактерий и сделал так более эффективно, чем профессиональных фагоцитов 16. Эти результаты, которые нарушают догмы иммунологии, показывают, что клетки адаптивного иммунитета может выполнять функции, которые были якобы эксклюзивные из врожденного иммунитета. Кроме того, мы показали, что Тит клетки секретируют большое количество провоспалительных цитокинов и защищают от бактериальных инфекций в естественных условиях.

Здесь мы представляем различные протоколы, используемые для изучения процесса бактериальной transinfection вмодель мыши. Эта модель основана на использовании CD4 + Т-клеток из трансгенных мышей OTII, которые несут специфического TCR для пептида 323-339 яйцеклеток (OVAp) в контексте I-Ab 17, которые взаимодействуют с бактериальной специально-инфицированной кости marrow- полученные ДК (BMDCs) 18,19 загруженные OVAp, образуя устойчивые иммунные синапсов.

Т-клеток transinfection могут быть визуализированы и отслеживаются с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, проточной цитометрии могут быть использованы для обнаружения инфицированных клеток воспользовавшись флуоресценции, испускаемой бактерий, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) 16,20. Кроме того, Т-клетки transinfection можно количественно определить более чувствительной подхода, гентамицина анализа выживаемости, который позволяет измерять большое количество событий. Гентамицин вл етс антибиотиком, который не может проникнуть эукариотических клеток. Таким образом, с помощью этого антибиотика позволяет дифференцировать внутриклеточных бактерий, который пережил антибиотиками сложение FROM внеклеточные те, которые были убиты 21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по исследованию этики Автономного университета Мадрида и провел под руководством Автономного университета Мадрида руководителя благосостояния и здоровья животных в соответствии с испанскими и европейскими рекомендациями. Мыши были выведены в специфических патогенов (SPF) жилья, и они были умерщвлены квалифицированным персоналом с использованием диоксида углерода (СО 2) методом ингаляции.

1. костного мозга мыши, полученные ДК Дифференциация и Инфекция

Примечание: На рисунке 1 представлены этот первый шаг. Все процедуры должны проводиться в капюшоне с этого момента, используя только стерильные медиа, инструменты, наконечники пипеток и культуры блюда.

  1. Костного мозга мыши, полученные ДК Дифференциация
    1. Рассеките большеберцовые кости и бедра от одного С57 / BL6 мыши 22 и передачи в пластиковую чашку с 10 мл RPMI среде.
    2. Разрежьте каждый эпифиз с, стерильными ножницами и выставить костный мозг, который имеет характерный ярко-красный цвет.
    3. Наполните внутреннюю часть кости с 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 5 ​​ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (PBS / БСА / ЭДТА буфере) с использованием стерильного шприца на стерильную чашку блюдо.
    4. Сбор клеточной суспензии и центрифуги в трубке при 600 х г в охлаждаемой центрифуге (4 ° C).
    5. Ресуспендируют клеток в 1 мл аммония-хлоридно-Калий (ACK) лизирующего буфера (0,15 М NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3 и 0,1 мМ ЭДТА) и инкубируют в течение 30 сек при комнатной температуре, чтобы исключить эритроциты.
    6. Добавьте 10 мл RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и фильтруют через клеточный фильтр (70 мкм), чтобы удалить фрагменты костей и скопления клеток перед центрифугированием при той же скорости (600 XG) из-за скопления были устранены путем фильтрации.
    7. Граф клетокд регулировки 5 × 10 5 клеток / мл RPMI с 10% FBS (содержащей 50 мкМ меркаптоэтанола B-1 мМ пирувата натрия) и добавить 20 нг / мл рекомбинантный мышиный гранулоцитов-макрофагов колонии-стимулирующий фактор (RM-GM-CSF) в конечной концентрации.
    8. Добавить это суспензии в стерильном микробиологического качества, 15 см чашки Петри, и культуры в СО 2 инкубатор (37 ° С, 5% СО 2).
    9. Каждые три дня, как спин вниз неадгезированных клеток и отдельные клетки с 5 мМ EDTA в PBS и ресуспендируют в 5 × 10 5 клеток / мл клеточной плотности, свежей средой, содержащей 20 нг / мл RM-GM-CSF.
  2. Созревание ДК и антиген Загрузка
    1. В 9-й день, ресуспендирования клеток в 5 × 10 5 клеток / мл плотности в среде, содержащей 20 нг / мл RM-GM-CSF. Затем добавить 20 нг / мл липополисахарида (ЛПС), чтобы позволить экспрессию МНС высокую-II на клетки и инкубируют в не-культуры ткани, обработанных стерильную чашку Петри 15 см в течение 24 часов.
    2. После одногодень LPS-стимуляции, окрасить некоторые клетки DC с антителами против мыши CD11c, MHCII и GR-1, чтобы проверить DCS дифференциации с помощью проточной цитометрии. Пример проточной цитометрии ДК показано на фиг 3А и 3В.
      1. Инкубируйте ДК (5 х 10 5 клеток / образец) с моноклональными антителами против мышиного CD16-/ CD32 на 2,5 мкг / мл конечной концентрации в 50 мкл PBS / BSA / EDTA буфера на образце. Затем добавляют 50 мкл антител против MHCII (IA / IE), CD11c и Gr-1, конъюгированного с различными флюорохромами 1: 100, 1: 200 и 1: 500 в PBS / BSA / EDTA буфера соответственно.
      2. Наконец, мыть ДК с PBS / BSA / EDTA буфера и анализировать с помощью проточной цитометрии в соответствии с протоколом производителя.
        Примечание: Если клетки хорошо дифференцируются, клетки готовы к антигену нагрузки.
    3. Промыть ДК с RPMI 10% FBS (без антибиотиков) и инкубируют их 10 мкг / мл OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) на пластмассовой трубки в 1 мл RMPI 10% FBS среды в 5 х 10 6 ДК для минимального 1 часа при 37 ° С. В качестве отрицательного контроля, оставить без РС инкубации с OVAp.
  3. Заражение домена
    1. Infect ДК при множественности инфекции (MOI) 10 бактерий (10 бактерий на DC) в течение 1 часа в СО2-инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).
    2. Промыть клетки DC 3x в PBS и 1х в RMPI 10% FBS и центрифуги при 450 мкг для промывки наиболее внеклеточных бактерий. Наконец, ресуспендирования клеток в RMPI 10% FBS средой (без антибиотиков) в 20 х 10 6 клеток / мл.

2. Выделение CD4 + Т-лимфоцитов из OTII трансгенных мышей

Примечание: На рисунке 1 представлены этот второй шаг. Лимфатические узлы должны быть использованы вместо селезенки для выделения CD4 + Т-клеток, поскольку доля CD4 + лимфоцитов в лимфатическом узлес (~ 50%) больше, чем в селезенке (~ 25%) и, следовательно, очищение будет более эффективным.

  1. Сделать одноклеточные подвеска лимфатических узлов
    1. Удалить паховые, подмышечные, плечевой шейки матки и брыжеечных лимфатических узлов 23 от OTII трансгенных мышей и передачи в пластиковую чашку с 10 мл RPMI 10% FBS среде.
    2. Измельчить лимфатические узлы под капотом стерильной, используя два матовых микроскопа. Поместите лимфатические узлы на стороне матового одного слайда микроскопа, и протрите с матовым стороне второго слайда до органы не были земля.
    3. Промыть суспензии отдельных клеток в PBS / BSA / EDTA буфера.
    4. Фильтр клетки, хотя клетка фильтр (70 мкм) для удаления соединительной ткани и промывают PBS / BSA / EDTA буфера.
    5. Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера для лизиса АСК и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы исключить эритроциты.
  2. Выделение CD4 + Т-клеток
    1. Вымойте снова, как в шаге 2.1.3 и подсчетаКлетки ресуспендируют в 100 их × 10 6 клеток / мл в PBS / BSA / EDTA буфера. Добавить биотинилированных антител против CD8, IgM, B220, CD19, MHC класса II (I-Ab), CD11b, CD11c и DX5 1: 250 в течение 30 мин на льду для последующего отрицательного отбора CD4 + Т-клеток.
    2. Промыть клетки в PBS / BSA / EDTA буфера и инкубируют клетки (100 × 10 6 клеток / мл) стрептавидином микросфер в концентрации, рекомендованной в протоколом производителя в течение 15 мин на льду.
    3. Вымойте клеток в PBS / BSA / EDTA буфера и фильтровать их, хотя клеточной фильтр (30 мкм) до выделения CD4 + Т-клеток.
    4. Изолировать CD4 + Т-клеток с помощью отрицательной селекции с использованием магнитной сепарации клеток машину в соответствии с протоколом производителя.
    5. Граф клеток и регулировать 4 х 10 6 клеток / мл RPMI 10% FBS среде (без антибиотиков).
    6. Fix и держать на льду, изолированных CD4 + Т-клеток (3 х 10 5 клеток), чтобы проверить чистоту потокомцитометра как описано 24. Пример CD4 + Т-клеток очистки показано на фиг.3С.

3. Т-клеток Transinfection Измерение анализе гентамицин защиты

Примечание: На рисунке 2 представлены этот третий шаг протокола.

  1. Т-клеток Transinfection
    1. Инкубируйте изолированные CD4 + Т-клеток с зараженными DC клеток (1: 1) (ДК инфицировали в течение 1 ч и промывают, чтобы исключить свободные бактерии) в течение 30 мин, чтобы позволить образование иммунного синапса в СО 2 инкубатор (37 ° C, 5% СО 2).
    2. Добавить 0,5 мл изолированных CD4 + Т-клеток (2 х 10 6 клеток) и 0,1 мл инфицированных ДК (2 х 10 6 клеток) на культуральную чашку 24-луночного. В качестве отрицательного контроля, заражают непосредственно 0,5 мл CD4 + Т-клеток в МВД 10 бактерий в течение 30 мин.
    3. Включить дополнительные элементы управления, разделяющие зараженных ДК от Т-клеток с помощьюполикарбонат Transwell барьер (с 3 мкм с размером пор), препятствуя DC-T физический контакт. Добавить 0,1 мл ДК внутри Transwell и 0,5 мл CD4 + Т-клеток в нижнем отделении скважины (24-луночный планшет).
    4. Наконец, в комплекте с RMPI среде, пока не будет 0,6 мл в каждую лунку, чтобы сделать равные объемы во всех образцах.
    5. Через 30 мин формирования иммунной синапсов, добавить 100 мкг / мл гентамицина и инкубируют в течение 1 часа перед сбором клеток в СО 2 инкубатор (37 ° С, 5% СО 2).
  2. Re-изоляции CD4 + Т-клеток
    1. Сбор неприкрепленных клеток и ресуспендируют в PBS, их / БСА / ЭДТА буфере. Большинство РС остаются прикрепленными к пластиковой пластины культуры. Вихревые трубки мягко, чтобы обеспечить клеток разбивку. Держите 500 мкл клеточного супернатанта в качестве контроля, чтобы показать, что гентамицин работал хорошо.
    2. Re-изолировать CD4 + Т-клеток из образцов, которые содержат контроллеры домена и Т-клетки вместе, как в шаге 2.2, Хотя большая часть домена должен крепится на пластине. Держите контрольные образцы на льду. Примите во внимание только эксперименты с менее чем 2% загрязнения. Пример CD4 + Т-клеток после очистки transinfection показано на рисунке 3D.
  3. Lyse Т-клеток и семя их от бактерий среднего агар пластин.
    1. Промыть CD4 + Т-клетки дважды PBS.
    2. Граф клеток и ресуспендируют их в 2 х 10 6 клеток / мл в PBS.
    3. Добавить 500 мкл 0,1% Тритона Х-100 в 500 мкл Т-клеток лизировать их на 1 × 10 6 клеток / мл, освобождая внутриклеточные бактерии из Т-клеток.
    4. Сделать 3 последовательных десятичных разведений лизированных клеток и семян 50 мкл каждого разбавления на бактерии средних чашках с агаром. Разделить пластины на 4 части и семян различных разведений лизированных клеток в каждой части. Типичные результаты показаны на рисунке 4.
      1. В качестве контроля, а также табличкахранятся клеточного супернатанта из конъюгатов на агаре, чтобы гарантировать, что гентамицин хорошо работал. Также пластины зараженные ДК в качестве дополнительного контроля. В случае низкого загрязнения ДК происходит (<2%), вычесть колониеобразующих единиц (КОЕ), соответствующие низким уровнем загрязнения постоянного тока.

4. Количественное определение Т-клеток Transinfection с помощью проточной цитометрии

Примечание: На рисунке 2 представлены этот шаг.

  1. Т-клеток Transinfection
    1. Инфекция BMDCs как в шаге 1.3, но использовать GFP выражения бактерий в этом случае.
    2. Пятно CD4 + Т-клетки (выделенные из лимфатических узлов в шаге 2.2) с сотового трекер хлорметилового аминокумарин (CMAC) в течение 30 мин при 37 ºC в соответствии с протоколом производителя.
    3. Промыть меченых CD4 + Т-клетки дважды RMPI 10% FBS (без антибиотиков).
    4. Выдержите зараженные ДК (после 1 ч инкубации с бактериями) с меченым CD4 +Т-клетки в течение 30 мин, чтобы позволить формирование иммунной синапса на 37 ºC, включая все управления, объясняющих в шаге 3.1.1.
  2. Окрашивание инфицированных CD4 + Т-клеток
    1. Через 30 мин DC-T формирования иммунной синапсов, собрать клетки и мыть их в PBS / BSA / EDTA.
    2. После двух промывок PBS / БСА / ЭДТА, отдельные агрегированные клетки осторожно вортексе трубки.
    3. Исправление образцов в 0,2 мл / пробирку PBS, содержащем 3% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть их в PBS.
    4. Инкубируйте с анти-CD16 мыши / CD32 моноклонального антитела (2,5 мкг / мл) в 50 мкл / образец PBS / BSA / EDTA в течение 15 мин на льду, чтобы блокировать Fc рецепторы дендритных клеток.
    5. Добавить кролика против бактерии антитела (10 мкг / мл в конечной концентрации) в 50 мкл / образец PBS / BSA / EDTA в течение 30 мин на льду, чтобы окрасить внеклеточные бактерии.
    6. Вымойте клеток с PBS / BSA / EDTA и инкубировать с антителом против мышиного CD11c сопряженной с фикоэритрином (PE) и а себеcondary антитело к кролику, конъюгированного с другим флуорохромом как Alexa Fluor 647-1: 200 в 100 мкл / образец PBS / BSA / EDTA в течение 30 мин на льду.
    7. Промыть клетки и анализа проб с помощью проточной цитометрии. Не забудьте включить образец transinfected Т-клеток с использованием не-люминесцентные бактерии в качестве отрицательного контроля и образцов с надписью только с одной из каждой флуорохромом используемой в эксперименте, чтобы компенсировать образцы и регулировать поток цитометрии настроек 25. Представитель анализ показано на фиг.5.
      Примечание: Если бактерии не экспрессируют GFP, чтобы отличить внутриклеточной и внеклеточной бактерии, этикетка внеклеточные бактерии, исправить, и проницаемыми образцы с Тритон Х-100 в концентрации 0,5% в PBS в течение 5 мин. Впоследствии пятно всего бактерии (внутриклеточные + внеклеточные) с различной флуорохромом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом мы описали, как выполнить Т-клеток мышей бактерий transinfection от зараженного костного мозга производного ДК и как измерить бактериальную transinfection помощью двух различных подходов: проточной цитометрии и гентамицин выживание анализ Рисунок 1 суммирует процедуру получения клеток.. ДК генерируются путем инкубации клеток костного мозга с GM-CSF в течение 9 дней. Затем, ДК созрела ЛПС увеличить MHCII на его мембране, чтобы загрузить их позже с определенного пеп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Т-клетки или Т-лимфоциты типа лейкоцитов, которые играют центральную роль в клеточного иммунитета и принадлежащих адаптивного иммунного ответа 26. Т-клетки являются невосприимчивыми к заражения в пробирке, но некоторые отчеты показывают, что они могут быть заражены в естественных условиях 14,15. Интимные контакты APC и Т-клеток иммунной во время синапса служить в качестве платформы для обмена биологический материал, в том числе 13 некоторых вирусов, таких как ВИЧ 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC от Министерства науки и инноваций Испании и PIES201020I046 от Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMIFisher ScientificSH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
Na PyruvateThermo ScientificSH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323– 339)GenScript
70 мкМBD352350
  30 мкМ шприц Filcons стерильныйBD340598
AutoMacs ClassicMiltenyi Biotec130-088-887
ГентамицинНормон624601.6
TranswellCostar3415
LBПронадиса1231
АгарПронадиса1800
Параформальдегид 16%Электронная микроскопиянаук 15710
Triton X-100
CD8 biotBD Biosciences553029
IgM BiotImmunoStepClone RMM-1
B220 BiotBD Biosciences553086
CD19 biotBD Biosciences553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)BD Biosciences553622
CD11b biotImmunostep11BB-01mg
CD11c biotImmunostep11CB3-01mg
DX5 biotBD Biosciences553856
Gr-1 biotBD Biosciences553125
CD16/CD32ImmunoStepM16PU-05MG
anti SalmonellaABD Serotec8209-4006
CD11cPEBD Biosciences553802
CD4-APCTonbo Biosciences20-0041-U100
Gr-1 APCBD Biosciences553129
MHC-II (I-A/I-E) FITCBD Biosciences553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) антитела, высокоадсорбированныйInvitrogenA-21245
CMAC (7-амино-4-хлорметилкумарин)Life technologiesC2110
BSASIGMAA7030-100G
стрептавидин МикрогранулыMiltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD Biosciences
Сетчатый фильтр

Ссылки

  1. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
  2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
  3. Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
  4. Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
  5. Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
  6. Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
  7. Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
  8. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
  9. Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
  10. Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
  11. Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
  12. Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).
  13. Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
  14. McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
  15. Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
  16. Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
  17. Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
  18. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
  19. Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  20. Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
  21. Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
  22. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).
  24. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  25. Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
  26. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Salmonella Enteritidis
Т-клеток Захват бактерий Transinfection от дендритных клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.