Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Тромботическая хода модели, основанной на переходных гипоксии мозга-ишемии

14.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52978

⸱

18 августа 2015 г.

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Neurology, The Emory University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Модели тромбоэмболического инсульта являются жизненно важными инструментами для оптимизации реканализационной терапии. В данной работе мы сообщаем о модели тромботического инсульта у мышей, основанной на транзиторном церебральном гипоксически-ишемическом (tHI) инсульте, который провоцирует тромбоз и инфаркт и благоприятно реагирует на фибринолиз, опосредованный тканевым плазминогеном (tPA)-опосредованным фибринолизом в терапевтическом окне, аналогичном таковым у пациентов с инсультом.

Аннотация

Ход исследования пережил множество неудач в переводе нейропротекторные терапии в клинической практике. В отличие от реального мира терапия (тромболизис ТАП) редко производит преимущества в механических окклюзии на основе экспериментальных моделей, которые доминируют доклинические исследования хода. Этот раскол между скамейке и кровати предполагает необходимость использования ТАП отзывчивые модели в доклинических исследований инсульта. С этой целью, простой и ТРА-реактивного тромботической модели инсульта изобретен и описано здесь. Эта модель состоит из переходного окклюзии одностороннего общей сонной артерии и доставки 7,5% кислорода через лицевую маску у взрослых мышей в течение 30 мин, при поддержании температуры ректальное животных на 37,5 ± 0,5 ° C. Несмотря на то, обратимо лигирование сонной артерии одностороннего или гипоксии друг подавляется мозговое кровообращение лишь временно, сочетание обоих инсультов вызваны дефицитом прочного реперфузии фибрин и отложение тромбоцитов и большой infarКТ на территории средней мозговой артерии, в комплект поставки. Важно отметить, что в хвостовую вену рекомбинантного ТАП в 0,5, 1 или 4 ч после Тхи (10 мг / кг), при условии, зависящих от времени снижение уровня смертности и инфаркта размера. Эта новая модель хода проста и может быть стандартизированы по лабораториям сравнивать экспериментальные результаты. Кроме того, он вызывает тромбоз без удаление фрагментов костей черепа или введения предварительно сформированный эмболии. Учитывая эти уникальные достоинства, модель Тхи является полезным дополнением к репертуару доклинических исследований инсульта.

Введение

Тромболизис и реканализация наиболее эффективная терапия острого ишемического инсульта в клинической практике 1. Тем не менее, большинство доклинических исследований нейропротекции была выполнена в переходном механической модели обструкции (внутрипросветного шов окклюзии средней мозговой артерии), который производит быстрое восстановление мозгового кровотока после снятия окклюзии сосудов и показывает практически нет преимущества, ТАП тромболизиса. Было высказано предположение, что сомнительно выбор моделей инсульта способствовало, по крайней мере частично, с трудностью в переводе нейропротекторное терапии для пациентов 2,3. Следовательно, есть увеличение вызов для трудоустройства ТАП отзывчивые модели тромбоэмболических инсульта в доклинических исследований, но такие модели также есть технические проблемы (см Обсуждение) 4-7. Здесь мы опишем новую модель тромбо инсульта на основе одностороннего переходного гипоксически-ишемическая (Тхи) оскорбление и его ответов на внутривенное ТАП терапии 8.

Модель Тхи ход был разработан на основе процедуры Levine (постоянное лигирования одностороннего общей сонной артерии с последующим воздействием на переходном гипоксии в камере), который был изобретен для экспериментов со взрослыми крысами в 1960 году 9. Первоначальная процедура Левин канули в безвестность, потому что это производится только переменную повреждение головного мозга, но то же самое оскорбление вызвало последовательное невропатологии грызунов щенков, когда он был вновь введен Робертом Vannucci и его коллегами в модели новорожденных гипоксически-ишемической энцефалопатии (HIE) в 1981 году 10. В последние годы, некоторые Исследователи повторно адаптированы модели Левина-Vannucci взрослым мышам путем регулирования температуры в гипоксической камере 11. Вполне вероятно, что противоречивые поражения головного мозга в оригинальной методике Левина может возникнуть от колебаний температуры тела взрослых грызунов в гипоксической камере. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изменили процедуру Левин путем введения гипоксического газачерез маску, при сохранении внутренней температуры грызунов при 37 ° С на операционном столе 12. Как и ожидалось, контроль температуры тела жесткими значительно увеличилось воспроизводимость HI-индуцированной патологии головного мозга. HI оскорбление также вызывает коагуляцию, аутофагии, и серо и белого вещества травмы 13. Другие исследователи также использовали модель HI, чтобы исследовать после инсульта воспалительные реакции 14.

Уникальной особенностью модели HI инсульта является то, что внимательно следит триаде Вирхова образования тромбов, в том числе застой кровотока, повреждения эндотелия (например, вследствие HI-индуцированного окислительного стресса), и гиперкоагуляции (активации тромбоцитов HI-индуцированной) ( 1А) 15. Таким образом, модель HI может захватить некоторые патофизиологические механизмы, имеющие отношение к реальной ишемического инсульта. С этой идеей в виду, мы далее уточнили модель HI с реверсивным перевязки ООНilateral общей сонной артерии (поэтому, чтобы создать переходный HI оскорбление), и проходят его ответов на ТАП тромболизиса с или без Edaravone. Edaravone является свободных радикалов уже одобрен в Японии для лечения ишемического инсульта в течение 24 часов в начале 9. Наши эксперименты показали, что, как краткое, как 30 мин переходный HI вызывает тромботические миокарда, и что комбинированное лечение ТАП Edaravone дает синергический эффект 8. Здесь мы описываем подробные хирургических процедур и методологические аспекты модели Thi, которые могут быть использованы для оптимизации реперфузии лечения острого ишемического инсульта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол утвержден уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) из Университета Эмори в и следует Национальные институты здравоохранения руководящего по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Настройка

  1. Подготовка хирургического кровать на площадку потепления, связанного с тепловым насосом при температуре 37 ° С в течение не менее 15 мин до операции. Поместите рулон шеи, используя ствол 3 мл шприц на операционном кровати. Подготовка анестезии газа с 2% изофлуран в медицинской воздуха.
  2. Подготовка автоклавного щипцы, ножницы, микро иглодержатели, кровоостанавливающего, ватные тампоны и швов. Подготовка ткани клей и глазную мазь.
  3. Настройте систему гипоксия и температурные контроллеры с отопительной лампы и прямой кишки зондом. Подготовка гипоксия газ с 2% изофлуран в 7,5% O 2 уравновешивается 92,5% N 2.
  4. За один час до операции мышей analgesized путем подкожной инъекции с медленным высвобождением мелоксикам (4,0 мг / кг).
<р = класс "jove_title"> 2. Переходный гипоксии мозга, ишемия (1В)

  1. Обезболить 10-13 неделя старый мужской C57BL / 6 мышей весом от 22 до 30 г в анестезии индукции камеры с 3% изофлуран пока животное не реагирует на ноги сжать, а затем удалить волосы на правой шеи с помощью электронного бритву.
  2. Место мышей на хирургическом постели, связанной с 2% изофлуран в медицинской воздухе при скорости потока 2 л / мин. Безопасные передние растягивается вдоль шеи ролл по бокам, используя медицинскую ленту.
  3. Очистите место операции для разреза с бетадином последующим алкоголя и затем ватным тампоном.
  4. Под микроскопом рассекает, сделать 0,5 см справа шейки разрез с помощью прямых щипцов и микро ножницы около 0,2 см отвода от средней линии кожи.
  5. Используйте пару мелких зубчатых щипцов растащить фасции и ткани, чтобы выставить правильный общей сонной артерии (АРУК). Осторожно отделите АРУК от блуждающего нерва с помощью пары тонких гладких щипцов.
  6. Живая узел два нарезанные 5-0 шелковый шов (разъемную) на АРУК, а затем зашить кожу, используя 4-0 Нейлон мононити шов (рис 1в).
  7. Применить глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  8. Быстро передавать мышей системы гипоксии и поставить нос и рот в лицевую маску с 2% изофлуран в 7,5% O 2 при скорости потока 0,5-1 л / мин в течение 30 мин.
    1. При гипоксии, использовать регуляторы температуры нагревательными лампами контролировать ректальную температуру в 37,5 ± 0,5 ° C. Монитор дыхания на 80-120 вдохов / мин. Поддержание температуры тела выше 37 ° С в течение гипоксии важно создать последовательную инфаркта головного мозга. Низкая частота дыхания, как правило, происходит после 20 мин гипоксии. Снимите лицевую маску и позволить нормальную подачу воздуха, если частота дыхания падает ниже 40. Это занимает 1-2 минут, а не рассчитывать на длительности 30 мин гипоксии.
  9. После гипоксии, трансфермышей хирургической кровати и освободить двух швов из АРУК. Закройте рану, используя ткани клей, а затем вернуться мышей в клетку. Исключить животных, если оба из двух живых сучков неожиданно освобожден после гипоксии.
  10. Монитор мышей в течение 5-10 мин, чтобы оправиться от гипоксии и анестезии. Поместите смоченную еду в клетку и вернуть его ухода за животными.
    Примечание: Животные, показывающие легкой до тяжелой поведения по кругу на 24 часов после того, как Тхи коррелируют с мозга нарушения. Большинство животных с симптомами приступов умирают до 24 ч после временной точки Тхи.

3. Лазерная спекл Контрастность изображений

Примечание: Хотя это не является существенным процедура модели Thi, двумерная система 16 контраст изображения лазерного спекл может быть использован для характеристики изменений мозгового кровотока (CBF) во время или после транзиторной ишемии-гипоксии. Чтобы немедленно документировать изменения на CBF под Тхи, запись после улEP 2.6. Кроме того, для сравнения восстановление после CBF Thi инсульта, эти процедуры могут быть выполнены после стадии 2.10.

  1. Разместить наркозом мышь в положении лежа и выполнить 1 см длиной срединный разрез на коже головы с черепом открытой, но закрытой.
  2. Монитор МК в обоих полушариях головного мозга под кровотока тепловизора в соответствии с протоколом производителя и начать немедленно записи мозговой кровоток после операции CCAO (шаг 2.6). Продолжить в течение 50 мин.
  3. Показать CBF изображение с произвольных единицах в 16-цветной палитре и анализировать в режиме реального времени выбранные регионы с помощью программного обеспечения MoorFLPI следуя инструкциям изготовителя (рисунок 2).
  4. После записи изображения CBF, закрыть головы с тканевой клей и вернуть животное к клетке.

Администрация 4. ТАП

  1. Вводите животных в хвостовую вену с растворителем или 10 мг / кг рекомбинантного ТАП (220-300 &# 956; л 1 мг / м ТАП) при 0,5, 1 или 4 ч после tCCAo плюс гипоксии (фиг.4).

5. Повреждение мозга обнаружения с несколько различных вариантов

Примечание: Для того, чтобы собрать образцы мозга, усыпить мышей через 1, 4 или 24 ч после Тхи.

  1. Метод Выполните количественного объема инфаркта по в естественных условиях 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТК) в 24 часов после того, как Тхи оскорбление как предыдущая описано. 17
    1. Внутрибрюшинно вводят животным с 1,4 М раствора маннита (~ 0,1 мл / г веса тела) за 30 минут до transcardial перфузии. Transcardial заливать мышей с PBS следуют 10 мл 2% ТТС.
    2. Удалить мозг животных с хирургическими инструментами через 10 мин и поместить в 4% параформальдегида для фиксации ночь и секции в толщиной 1 мм с vibratome.
    3. Привязать серию из четырех секционных слайдов головного мозга с помощью цифрового микроскопа и квантаримента объем инфаркта как отношение зоны инфаркта (белая область в правой части) в области неповрежденной, контралатерального полушария с помощью программного обеспечения ImageJ.
  2. Кроме того, выполнять формирование тромбоза с помощью иммунофлуоресценции на 1 ч после Тхи оскорбление.
    1. Замораживание фиксированный мозг в октябре соединения и секции мозги в 12 мкм толщиной, используя криостат.
    2. Инкубируйте мозга слайд с кроличьей анти-фибриногена антител (1: 100), следующих козьих антител против кроличьего Alexa Fluro 488 красителя (1: 200) для наблюдения флуоресценции под флуоресцентным микроскопом.
  3. Кроме того, выполнение закупорке сосуда путем инъекции в хвостовую вену 100 мкл 2% синего красителя Эванса в 4 ч после инсульта Thi.
    1. Усыпить мышей и быстро вырезать голову, чтобы удалить мозги в 4% параформальдегида после Эванса синего инъекции. Примечание: Это займет 5-10 минут для голубого Эванса обращения с синим цветом и передних и задних конечностей.
    2. Sectiна фиксированных мозги толщиной 100 мкм с использованием скользящего микротома и наблюдать флуоресценцию с помощью фильтра выбросов по 680 нм на флуоресцентного микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Двумерная лазерной спекл Контрастность изображения (LSCI) 16 был использован для сравнения изменений мозгового кровотока (CBF) на 30 мин переходного одностороннее сонной окклюзии (tCCAO), 30 мин воздействия гипоксии (7,5% кислорода), и 30 мин одностороннее сонных перевязка в условиях гипоксии (Тхи). Этот эксперимент показал, что tCCAO под нормоксии подавляется БФК на сонной лигировали полушария ~ 50% от исходного уровня, который быстро восстанавливаться выше 85% после выпуска сонной окклюзии (R на рис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инсульт является основной проблемой здоровья растет значение для любого общества с старение населения. В глобальном масштабе, инсульт является второй ведущей причиной смерти оценкам 5,9 млн роковых событий в 2010 году, что эквивалентно 11,1% всех случаев смерти 18. Инсульт также третьего по значимости причиной лет жизни, скорректированных на инвалидность (DALY) потеряны по всему миру в 2010 году, поднявшись с пятой позиции в 1990 году 19. Эти эпидемиологические данные подчеркивают необходимость бол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом NIH NS074559 (C. K.). Мы благодарим всех сотрудников, которые внесли свой вклад в написание наших исследовательских статей, на которых основан настоящий методологический отчет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
взрослые самцы мышейCharles RiverC57BL/6 10-13 недель (22-30 г)
Мобильная система анестезии лабораторных животныхVetEquip901807анестезии
Баллон с медицинским воздухом (сжатым) воздухомАэрогазUN1002анестезия
ИзофлуранПирамал ЗдравоохранениеNDC 66794-013-25анестезия
Многостанционная система анестезии лабораторных животныхСистема для анестезии SurgivetV703501система
гипоксии7,5% O2 уравновешивается 92,5% N2 бакAirgasUN1956система гипоксии
Регулятор температуры с нагревательной лампой Коул Пармер EW-89000-10регуляторы температуры
Ректальный зондCole Parmer NCI-00141PGРегуляторы температуры
Препарирующий микроскоп Олимп Хирургический наборSZ40
Тепловой насос с согревающей прокладкойGaymar Хирургический наборTP700
Тонкие изогнутые щипцы (зубчатые)FST11370-31хирургический
инструмент Тонкие изогнутые щипцы (гладкие)FST11373-12хирургический инструмент
микроножницыFST15000-03хирургический инструмент
микроиглодержателиFST12060-01хирургический инструмент
Halsted-Mosquito гемостатикиFST13008-12хирургический инструмент
5-0 шелковый шов Гарвардский аппарат624143хирургические принадлежности
4-0 Нейлоновая монофиламентная шовная тканьLOOK766BХирургические принадлежности
Тканевый клейAbbott LaboratoriesNC9855218хирургические принадлежности
Puralube Vet мазьFisherNC0138063 Профилактика сухости глаз 
MoorFLPI-2 Визуализатор кровотокаMoor780-нм лазерный источникЛазерная спекл-контрастная визуализация
МаннитолSigmaM4125in vivo TTC
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (TTC) SigmaT8877in vivo TTC
VibratomeStoelting51425секция мозга для in vivo TTC 
Цифровой микроскопDino-LiteAM2111визуализации всего мозга
O.C.T соединениеSakura Finetek4583
козий анти-кролик Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Иммуногистохимия
CryostatVibratomeultrapro 5000срез мозга для IHC
Evans blueSigmaE2129Обнаружение сосудистых перфузия
МикротомЭлектронная микроскопия Sciences5000срез мозга для гистологии
Авертин (2, 2, 2-Триброметанол)SigmaT48402эвтаназия
Флуоресцентный микроскопOlympusDP73
Мелоксикам SRЗооФармНПВП анальгезия
для

Ссылки

  1. Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
  2. Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
  3. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  4. Macrae, I. M. Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
  5. Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
  6. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
  8. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807(2014).
  9. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
  10. Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  11. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
  12. Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
  13. Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
  14. Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
  15. Zoppo, G. J. Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
  16. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  17. Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
  18. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
  19. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
  20. Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
  21. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  22. Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
  23. Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
  24. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

tPA
Тромботическая хода модели, основанной на переходных гипоксии мозга-ишемии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.