Определение жирных кислот и окисления Липогенез в первичных гепатоцитов мышей

Краткое содержание

De Novo липогенез и окисление β-жирных кислот представляют собой ключевые метаболические пути в гепатоцитах, пути, которые возмущенные в нескольких метаболических расстройств, в том числе жировой болезни печени. Здесь мы показываем, изоляции первичных гепатоцитов мыши и описать количественную окисления кислоты бета-жирных и липогенеза.

Аннотация

Метаболизм липидов в печени сложен. В дополнение к импорту и экспорту липидов через липопротеины, гепатоциты могут окислять липиды путем окисления жирных кислот или, в качестве альтернативы, синтезировать новые липиды посредством липогенеза de novo. Чистая сумма этих путей продиктована рядом факторов, что при определенных болезненных состояниях приводит к жировой болезни печени. Избыточное накопление липидов в печени связано с резистентностью всего организма к инсулину и ишемической болезнью сердца. Инструменты для изучения липидного обмена в гепатоцитах полезны для понимания роли липидного обмена в печени при определенных метаболических нарушениях.

В печени гепатоциты регулируют расщепление и синтез жирных кислот посредством окисления β-жирных кислот и липогенеза de novo соответственно. Количественная оценка метаболизма в этих путях дает представление о работе с липидами в печени. В отличие от количественного определения in vitro, с использованием первичных гепатоцитов, проведение измерений in vivo является технически сложным и ресурсоемким процессом. Таким образом, количественная оценка окисления β-жирных кислот и липогенеза de novo в культивируемых гепатоцитах мышей обеспечивает простой метод оценки обработки липидов гепатоцитов.

Здесь мы описываем метод выделения первичных гепатоцитов мышей и демонстрируем количественную оценку окисления β-жирных кислот и липогенеза de novo с использованием радиоактивно меченых субстратов.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени является одной из ведущих причин заболеваний печени в западных культурах^1,2. Накопление липидов в печени связано с гибелью клеток, фиброзом и печеночной недостаточностью с помощью пока неизвестных механизмов^3-6. При жировой болезни печени опосредованное гепатоцитами окисление β-жирных кислот и липогенез de novo являются важными детерминантами чистого накопления липидов^7,8. Поэтому в данной статье основное внимание будет уделено выделению гепатоцитов с последующей количественной оценкой окисления β-жирных кислот и липогенеза de novo.

Было разработано множество методологий для исследования метаболизма липидов гепатоцитов. Несмотря на то, что можно измерить метаболизм жира in vivo с использованием стабильных изотопов^9,10, эти методы являются дорогостоящими и требуют большого количества животных. Кроме того, возможность исследования влияния экзогенных химических веществ ограничена из-за характера экспериментов in vivo. Напротив, выделение первичных гепатоцитов из печени мыши обеспечивает доступный способ для изучения¹¹. Кроме того, изучение гепатоцитов в культуре позволяет исследователям изучать влияние различных химических веществ на обработку липидов, обходя трудности экспериментов in vivo. Наконец, изолированные гепатоциты избегают каких-либо смешения из-за различий в генетике, поскольку они получены из печени одного животного.

Здесь мы выделяем и культивируем гепатоциты, а также измеряем окисление β-жирных кислот и липогенез de novo, используя радиоактивно меченный пальмитат. Протокол, подробно описанный ниже, прост, эффективен и воспроизводим.

Протокол

Все эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с местными и федеральными нормами и с одобрения институциональной IACUC и радиационной безопасности администрации.

1. Подготовка

1. За несколько дней до анализа, растопить 500 мл бутылку печени Digest Medium (ЛДМ) и замораживать ~ 35 мл аликвоты в 50 мл конические пробирки. Хранить при -20 ° С до использования.
2. За день до анализа, предварительно простерилизовать чистые инструменты рассечение в автоклаве.
3. В день анализа, лечения необходимого количества культуральных планшетах с 24 лунками с коллагеном.
   1. Смешайте 1 часть 3 мг / мл коллагена хвоста крысы с 50 частями PBS. Добавить приблизительно 500 мкл в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре (RT). Удалить коллагена и позволяют пластины высохнуть на воздухе в капот. Повторите по крайней мере один дополнительное время.
      Примечание: Коллаген покрытие может быть выполнено в течение одной недели в объявленииВэнс и планшеты хранили при 4 ° С закрытой полиэтиленовой пленкой.
4. Подготовка LDM для анализа: Оттепель LDM и тепло до 37 ° С и доведения рН до 7,4 с использованием 1 N КОН. Фильтр с помощью шприц-фильтр и места 0,2 мкм в рециркуляции 42 ° С на водяной бане.
5. Теплые 25 мл печени перфузии среды до 42 ° С в циркуляционной водяной бане.
6. Подготовка 90% коллоидного диоксида кремния, покрытого раствором поливинилпирролидона: Добавить 1 мл 10Х DPBS до 9 мл коллоидного диоксида кремния, покрытого поливинилпирролидона. Отрегулируйте рН до 7,4, используя 0,1 N HCl. Фильтры стерильной шприцевой фильтр 0,2 мкм. Хранить при комнатной температуре.
7. Теплый покрытие от среднего до 37 ° C.

2. Выделение первичной Mouse гепатоцитов

1. Настройка перистальтического насоса, трубы и рассечение таблицу: стерилизовать трубки путем промывки 5 мл 70% этанола в дистиллированной воде, а затем 10 мл стерильной воды. Поместите трубку в печени перфузии среды и запустите насос для заполнениявся длина трубки.
2. Жертвоприношение мышь, институционально утвержденного метода.
3. Проанализируйте открыт в брюшную полость: Спрей живота мыши либерально 70% этанола. Использование тупым концом ножниц, сделать срединный разрез через дерму длину живота и боков отражают. Сделать подобный разрез в брюшине, чтобы выставить внутренние органы.
   1. Использование тупым инструментом, мягко сместить кишечник, чтобы разоблачить брюшной сосудистая Найдите брюшной нижнюю полую вену (IVC) и поместите нить под кровеносного сосуда, дистальнее почечной вены
4. Дистальнее шва, поместите иглу и катетер в НПВ, продвижение его за пределы уровня шва. С иглой-прежнему на месте, связать нить вокруг катетера, чтобы держать это в месте. Осторожно извлеките иглу. Если все сделано правильно, кровь потоком через катетер.
5. С помощью пипетки, заполните оставшуюся область в катетер с перфузии среды, обеспечениячто воздух не присутствует. С большой осторожностью, прикрепите трубки к катетеру.
6. Проанализируйте открыта полость легких: мягко отражают превосходные доли печени подвергать диафрагму. Осторожно проколоть мембрану с острыми ножницами кончик, а затем сделать боковой надрез, чтобы разоблачить плевральную полость, заботясь, чтобы избежать желчного пузыря и плевральной сосудистую. Поставьте бульдог зажим вокруг грудной нижней полой вены просто проксимального к печеночной вены.
7. Вырезать в портальную вену и включить насос на 3 - 4 мл / мин. Заливать печени с печеночной перфузии среды в течение 5 мин с помощью примерно 20 мл перфузии среды.
   Примечание: печень должна немедленно изменится с красного на серый / коричневый. Если части печени остаются красный, это, вероятно, указывает на плохую перфузию, и вероятность успешного изоляции значительно уменьшается. Во время перфузии, будьте осторожны, чтобы обеспечить среду не работать, и что не было пузырей ввести трубку.
8. После 5 мин инкубации, остановитьнасос и передать трубку к печени Digest Medium. Перезагрузите насос и заливать печень еще 10 - 15 мин (до среднего не будет исчерпан).
9. В конце перфузии, остановить насос. Печень должна иметь розоватый оттенок и выглядят несколько увеличены. Акцизный печень благодаря тщательной диссекции. Удалить желчный пузырь и передавать печень 10 см блюдо культуры ткани.
10. В кабинете биологической безопасности, добавляют 10 мл Покрытие Medium (Таблица 1) в печень. Аккуратно очистить печень, используя либо щипцов или скальпель, чтобы удалить гепатоциты. Суспензию фильтруют, используя фильтр клеток 100 мкм и трансфер в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины с дополнительными 10 мл Покрытие Medium и бассейн в 50 мл коническую трубку.
11. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 350 х г, 4 ° С.
12. Аспирируйте средних и ресуспендируют осадок в 10 мл Покрытие Medium и добавить 10 мл 90% коллоидного диоксида кремния покрыты роlyvinylpyrrolidone. Осторожно перемешать и центрифуги, как в шаге 2.11. После центрифугирования слой мертвых клеток будет плавать на верхней части смеси, в то время как живые клетки будут осаждения на дно.
13. Аспирируйте мертвые клетки и среду. Вымойте 2 раза с 20 мл Покрытие Medium, центрифуги, как в 2.11.
14. Ресуспендируют клеток в 10 мл среды. Покрытие Граф клеток с гемоцитометра и поместите 9 х 10 ^{4 клеток} / лунку в коллаген-лечение блюд культуры 24-а. Инкубируют в C инкубаторе тканевых культур 37 ° в течение 2 ч. Каждая пластина может быть использована как для анализа жирных кислот окислением или в липогенеза анализа.
15. При желании, изменить скважин в поддерживающую среду (Таблица 1) и культуры при 37 ° С. Клетки можно культивировать в течение 2 - 3 дней, не затрагивая результаты анализа.

3. Окисление жирных кислот Анализ

Внимание: Использование радиоактивности может быть опасным. Все закупки, хранения, обработки и диsposal радиоактивного материала должна осуществляться в соответствии с институциональными, государства и федеральных правил и руководств.

1. 16 - 20 ч до анализа, промыть клетки 2 раза теплой PBS. Изменение клетки без сыворотки сывороточного голодания среды (таблица 1) с 20 нМ глюкагона и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
   Примечание: Из-за эмбриональной бычьей сыворотки содержит неизвестной концентрации метаболических гормонов (например, инсулина, глюкагона), сыворотка голодать клетки, чтобы удалить любые смешанные эффекты это может отразиться на анализе. Клетки являются жизнеспособными в условиях сывороточного голодания среда для> 24 часов. Лечение Глюкагон используется для стимуляции окисления жирных кислот в гепатоцитах.
2. Утром анализа, подготовки предварительной инкубации среда: Ресуспендируют соответствующее количество натрия пальмитат в сверхчистой воде для получения раствора 100 мМ и нагревают до 70 ° С в течение 10 мин. В то же время, подготовить необходимое количество (0,5 мл на лунку 24-луночного планшета)из DMEM с 25 мМ HEPES, 1% БСА фракции V, и 20 нМ глюкагона. Нагревают до 37 ° С.
   1. После солюбилизации добавляют пальмитат до конечной концентрации 250 мкм в среде. Изменить гепатоциты в предварительной инкубации Medium и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 ч. Резервируют Предварительно инкубационной среде при 37 ° С для последующего использования.
3. Во время инкубации, сухой соответствующее количество ^{14 С-пальмитат} (0,5 мкКи / лунку) выпариванием при газообразного азота.
   1. Например, для измерения 24 образцов в 24-луночный планшет, передавать 120 мкл 0,1 мкКи / мл ¹⁴ С-пальмитат в 1,5 мл пробирку. Медленно выпарить растворитель этанол путем продувки газообразного азота над раствором на расстоянии 3-5 см в вытяжном шкафу. Растворитель должен испариться примерно 30 - 40 мин, в результате чего сухую ^{14-пальмитат} C в нижней части трубы.
4. Приблизительно за 15 мин до конца инкубации, ресуспендируют ¹⁴С-пальмитат в 0,1 N NaOH (12,5 мкл / мкКи). Инкубируют при 70 ° С в течение 10 мин. Добавить три тома теплой Прединкубационная Medium и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
5. Спайк каждую лунку 25 мкл разбавленного ¹⁴ C-пальмитат. Смешайте осторожно качалки пластины и инкубировать при 37 ° С в течение 90 мин. Это аналитический планшет.
6. Во время инкубации, подготовить пластину фильтровальной бумаги (рис 1).
   1. Снимите крышку с стерильную чашку 24-а. Разместите один 2 см х 2 см кусок фильтровальной бумаги на дне каждой из лунок. Перекрытие пластины с частью 4 "х 7" парафильмом.
   2. Использование большой прямоугольный объект, такой как наконечник коробки микропипетки, протереть парафильмом на скважинах перфорировать парафильмом в отверстия а и создать уплотнение в течение оставшейся части пластины. Удалить перфорированные круги парафильмом в настоящее время охватывает скважин. Пластина должна теперь быть плотно покрыты парафином во всех областях, за исключением а Openings.
7. 10 мин до конца инкубации, добавьте 200 мкл 3 N NaOH в каждую лунку бумаги пластинчатом фильтре, убедившись, что бумага фильтр поглощает всю жидкость.
   1. При желании перед замораживанием, передавать среды в свежей 24-луночного планшета. После промывания один раз PBS, лизировать оставшиеся клетки в 0,1 N HCl и рассчитать содержание белка ВСА анализа.
8. В конце инкубации, оснастку заморозить аналитического планшета в жидком азоте. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что каждый хорошо полностью заморожены, прежде чем приступить.
9. Добавить 100 мкл 70% перхлорной кислоты в каждую лунку аналитического планшета. Сразу накрыть плиты фильтровальной бумаги. Место пластин на орбитальном шейкере и рок в орбитальной скоростью 80 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 2 часов.
10. После инкубации, обрабатывать образцы:
    1. Для измерения СО ₂ фракции, передать фильтровальной бумаги квадраты 4 мл сцинтилляционной жидкости жидкости в сцинтилляционныхФлакон и мера ^{14 С} сигнала.
    2. Для измерения кислотного растворимый материал, передавать 400 мкл среды к 1,5 мл пробирке. Центрифуга на максимальной скорости в течение 10 мин. Добавить 100 мкл полученного супернатанта до 500 мкл 2: 1 хлороформ-метанол (объем / объем), и вихрь кратко.
       1. Добавить 250 мкл воды к смеси, и вихрь снова. Центрифуга образцов в течение 10 мин при 3000 х г в. Передача 200 мкл верхней фазы к 4 мл жидкой сцинтилл ционной жидкости в сцинтилляционный флакон и измерения ^{14 С} сигнала.

4. Анализ Липогенез

1. Вечером накануне начала анализа, промыть клетки 2 раза теплой PBS. Изменить гепатоцитов в условиях сывороточного голодания среде с 100 нМ инсулина. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С.
   Примечание: Из-за эмбриональной бычьей сыворотки содержит неизвестной концентрации метаболических гормонов (например, инсулин, глюкагон), В сыворотке крови голодать клетки, чтобы удалить любые смешанные эффекты это может отразиться на анализе. Клетки являются жизнеспособными в условиях сывороточного голодания среда для> 24 часов. Инсулин В этом анализе использовали, чтобы стимулировать липогенез.
2. Сделать Липогенез Medium: сывороточного голодания среде с 100 нМ инсулина, 10 мкМ холодного ацетата и 0,5 мкКи ³ Н-ацетат на лунку. Изменение клетки к липогенеза среды и инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч. Включите любые соединения, представляющие интерес для тестирования.
3. После инкубационного периода, промыть клетки 2 раза PBS. Lyse клетки, очищая в 120 мкл 0,1 N HCl. Резервный 10 мкл для анализа белка (BCA оценки по анализа), и передача 100 мкл до 1,5 мл пробирке.
4. Экстракт липидов добавлением 500 мкл 2: 1 хлороформ-метанол (объем / объем). Вихревой кратко и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 250 мкл воды, вихрь и инкубируют при комнатной температуре в течение еще 5 мин. Центрифуга образцов 10 мин при 3000 мкг в РТ. Внимательнопередать нижнюю фазу до 4 мл сцинтилляционной жидкости жидкости в сцинтилляционный флакон и измерения ^{3 H} деятельность.

Результаты

Гепатоцитов изоляция, как правило, приводят в 1 - 3 х 10 ⁷ клеток всего. После инкубации в течение ночи клетки будут появляться шестиугольной, многие из которых будут двуядерных (рисунок 2). Здоровые клетки должен быть лишен грануляций или пузырьков, которые свидетельствуют о гибели клеток.

В общем, жирных кислот Окисление анализа выполняется в три-четыре дубликатов на тест соединения. Графы для СО ₂ образцов примерно одна пятая часть, полученные из кис...

Обсуждение

Время от жертву перфузии должна быть не менее 3 мин для идеального перфузии коллагеназой и переваривания печени. После перфузии с перфузионной средой инициируется, печень должна немедленно изменить внешний вид от красного до бледно. После примерно 10 мин инкубации с LDM, печень появится распухли и розовый. В том случае, перфузии недостаточно, печень не должна демонстрировать эти изменения, и это обычно приводит к снижению выхода гепатоцитов.

После стадий промывки, изолированных гепатоцитах м...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Перфузия печени Medium	Life Technologies	17701038
Печеночное переваривание Medium	Life Technologies	17703034	аликвоте и хранить при -20 °°С; C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Коллаген	Лайф Технологии	A1048301
Коллоидный диоксид кремния, покрытый поливинилпирролидоном	GE Life Sciences	17-0891-01
Пируват натрия	Cellgro	25-000-CI
Пенициллин / Стрептомицин	Cellgro	30-001-CI
Инсулин	Sigma	I0516-5ML
Дексаметазон	Sigma	D2915-100MG
Альбумин (BSA), Фракция V	MP Biomedicals	103703
24-луночной чашкой для культивирования	Corning Falcon	353047
Tygon S3 Трубка	Cole Parmer	06460-34
Male Leur Lock to 200 Barb Connectors	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" катетер	SurFlo	SROX2419CA
перма-рука Шелковый шовный материал	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Рециркуляционная водяная баня	Fisher	13-874-3
Перистальтический насос MasterFlex C/L MasterFlex		HV-77122-24
Микрозажим	Roboz	RS-7438	Предварительная стерилизация в автоклаве
5" Прямые, тупо-тупые операционные ножницы	Roboz	RS-6810	Предварительная стерилизация в автоклаве
24 мм Лезвие Прямые ножницы для микрорассечения с острым концом	Roboz	RS-5912	Предварительная стерилизация в автоклаве
4" 0,8 мм Наконечник Микрорассекающие щипцы	Roboz	RS-5130	Предварительная стерилизация в автоклаве
4" 0,8 мм Наконечник полноразмерный микрорассекающий щипцы	Roboz	RS-5137	Предварительная стерилизация в автоклаве
60 мл Шприц	Becton Dickinson	309653
50 мл конические пробирки	Corning Falcon	352070
BCA Protein Assay	Thermo Scientific	23225
Шкаф
CO2 Инкубатор
серологический пипетки
1 000, 200, 20 и мме; l Пипетки и наконечники