Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52983

⸱

7 июля 2015 г.

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Микроглия может влиять на нейроны и другие глии в культуре с помощью различных неклеточных автономных механизмов. В этой статье мы представляем протокол селективного истощения микроглии из первичных нейронных культур. Этот метод имеет потенциал для выяснения роли микроглиально-нейронных взаимодействий с последствиями для нейродегенеративных состояний, где нейровоспаление является отличительной чертой.

Аннотация

Микроглия, резидентные иммунокомпетентные клетки ЦНС, играют многогранную роль в модуляции и контроле функции нейронов, а также в опосредовании врожденного иммунитета. Модели первичных клеточных культур грызунов значительно продвинули наше понимание нейронально-глиальных взаимодействий, но только недавно стали использоваться методы специфического устранения микроглии из смешанных культур. Одним из таких методов, описанных здесь, является использование метилового эфира L-лейцина, лизомотропного агента, который интернализуется макрофагами и микроглией, где он вызывает лизосомальное нарушение и последующий апоптоз13,14. Эксперименты с использованием метилового эфира L-лейцина позволяют выявить вклад микроглии в окружающую клеточную среду в различных условиях культивирования. Используя протокол, оптимизированный в нашей лаборатории, мы описываем, как устранить микроглию из культуры гранулярных клеток мозжечка P5 грызунов. Такой подход позволяет оценить относительное влияние микроглии на экспериментальные данные, а также определить, играют ли микроглия нейропротекторную или нейротоксическую роль в культуральных моделях неврологических состояний, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера или Паркинсона.

Введение

Человеческий мозг содержит оценкам, 85 миллиардов нейронов и дальнейшие 85 миллиардов без нервных клеток глии в том числе 1. Для большей части последних 100 лет неврологи, ориентированных преимущественно на нейронной популяции клеток, полагая, глиальные клетки, чтобы быть немного больше, чем пассивные поддерживающих клеток, которые представили структурную поддержку для нейронов - отсюда греческого этимологии "глии 'в переводе с английского, как "клей". Однако в последнее время, становится все более очевидным, что нейронные-глиальных взаимодействий может быть гораздо более фундаментальное значение для основных аспектов нейробиологии, нейрофизиологии и генезиса и прогрессирования многих нейродегенеративных заболеваний. Мозжечка ЗК (CGCs), наиболее распространенным однородная нейронная населения в человеческом мозге, доминировать в мозжечок и составляют более 90% своих клеточных составляющих. Следовательно, эти клетки широко используются в пробирке в качестве модельной системы для тон изучению развития нейронов, функции и патологии 2-6.

Тем не менее, CGC культуры по-прежнему содержат микроглии и других глии в возможно значительных пропорциях. В результате, данные, отображающие CGC предположительно прямые нейрональные ответов на различных обработок клеток на самом деле может возникнуть - в частично или полностью - от косвенного вторичной реакции соседних глии в культуре. Для оценки этого, мы селективно элиминируют микроглии от CGC нейрональных культур с помощью L-лейцина метилового сложного эфира (LME). LME является lysomotropic агент первоначально использовались выборочно уничтожать макрофагов 7, и с тех пор используется также выборочно разрушают микроглии от нервных, астроцитов и глиальных культур смешанных 8,9,10. ЛБМ интернализуется макрофагами и микроглии, в котором он вызывает нарушение лизосом и последующее апоптоз 13,14. Макрофаги и микроглии характерно богаты лизосом, заставляя их быть particulaжелезная дорога уязвимы при воздействии лечения LME. Этот протокол обеспечивает мощный, но простой и легкий способ удостовериться вклад микроглии в экспериментах с использованием CGC и другие нейронные системы / глиальные культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, описанные здесь, были выполнены в соответствии с Соединенным Королевством животных (научные процедуры) Закона 1986 года.

1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда

  1. Приготовьте два из нержавеющей стали лаборатории рассекает ножницы и два из нержавеющей стали лабораторные щипцы. Автоклав все инструменты и место в культуре капот O / N в ультрафиолетовом свете (УФ) светом для стерилизации.
  2. Сделать 500 мл минимальной необходимой медиа (MEM) культуральной среды (10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 20 мМ KCl, 25 мМ NaHCO 3, 30 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 6 мкг / мл ампициллина) и фильтр стерилизуют. Хранить при 4 ° С в течение месяца.
  3. Подготовка 24-луночные культуры, содержащие 14 мм, толщиной 1 номер покровные. Автоклав покровные и пальто в 100 мг / л поли-D-лизина (PDL), как описано ранее 3. УФ-свет стерилизации O / N.

2. Подготовка CGC культуры Solutions

  1. Готовят раствор "А" (100 мл) в автоклаве, обработанной УФ-светом, стерильной дН 2 O, содержащий 250 мг глюкозы, 300 мг бычьего сывороточного альбумина [BSA] 955 мг в забуференном фосфатом солевом растворе PBS [] (Са 2+ и Mg + бесплатно), и 1 мл 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. Готовят раствор 'В' (10 мл), содержащий 1 мл 5 мг / мл трипсина, разведенного в 9 мл раствора А.
  3. Подготовка 'C' решение (10 мл), содержащие 1000 единиц ДНКазы, 0,5 мг ингибитора трипсина сои, 100 мкл 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, разбавленные до 10 мл раствора А.
  4. Готовят раствор 'D' (20 мл), содержащий 3,2 мл раствора С, разбавленного до 20 мл раствора А.
  5. Подготовка сбалансированный солевой раствор (EBSS) решение BSA / Эрла, содержащий EBSS, 25 мМ NaHCO 3, 3 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, и4% БСА, рН 7,4, как описано ранее 3.
  6. Подготовьте LME добавлением чистой LME в 5 мл культуральной среды МЕМ, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ LME, возвращают раствор до рН 7,4 с помощью рН-метр настольный, и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприца фильтр.

3. Культивирование CGCs

  1. Соберите мозжечка от 4-7-дневных крысят, как описано ранее 3. Сразу же в чашку Петри, содержащую 5 мл раствора А на льду.
  2. Вылейте излишки раствора из мозжечка и место ткани в блюдо крышкой Петри.
  3. Чоп ткани мелко с хорошо пылал лезвием по крайней мере в трех различных направлениях.
  4. Добавить нарезанный ткани в раствор Б (ополоснуть чашку Петри с раствором, чтобы обеспечить ограниченную ткани теряется) и поместить в водяную баню при 37 ° С в течение 5 мин. Слегка встряхнуть каждую пару минут.
  5. Добавить решение D (20 мл) в пробирку, чтобы нейтрализовать трипсина, встряхнуть и центаrifuge на 65 мкг в течение 5 мин.
  6. Вылейте супернатант.
  7. Ресуспендируют в 4 мл раствора C. растирают а (примерно в 10 раз каждый) с тремя Flamed стеклянных пипеток уменьшением диаметра, пока суспензия не является как можно более однородным.
  8. Медленно и осторожно добавить несколько капель этого гомогената на вершине BSA / EBSS. Если он начинает тонуть через BSA / EBSS, растереть все больше и / или добавить немного больше раствора C. Гомогенат должны сидеть в слое на верхней части BSA / EBSS. Не трясти. Спин на 100 мкг в течение 5 мин.
  9. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок (мягкие) в 1 мл среды МЕМ.
  10. Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины на 800000 клеток / покровное в 500 мкл среды МЕМ. Место в инкубаторе при 37 ° С с 6% СО 2.
  11. Изменить среды на следующий день (24-36 ч после подготовки). Сделать раствор среде МЕМ, содержащей 10 мкМ ингибитора клеточного цикла Арабинофуранозил цитидина (AraC).
    1. Для каждогопокровное, сохраняют 250 мкл старой среды в свежем 24-луночного планшета, аспирация остальное, добавить 250 мкл нормальной среде МЕМ и аспирации это мыть клетки, затем добавить 250 мкл среды старой обратно в клетки и верхней вверх 250 мкл AraC среде, содержащей.
      Примечание: Клетки могут быть использованы из 6 дней в пробирке (DIV).

4. Выборочное разрушающие микроглии (Исполняется на 6 DIV)

  1. Добавить чистого LME 5 мл отдельной аликвоте среде МЕМ с получением конечной концентрации 150 мМ LME.
  2. Вернуться решение до рН 7,4 и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприц фильтр.
  3. Разбавленным раствором до концентрации 50 мм (2 х LME) в среде МЕМ и место в водяной бане при 37 ° С в течение 10 мин вместе с нормальной среде МЕМ для контрольных культурах.
  4. Удалить половину (250 мкл) в среду MEM от CGC культур и сохраняют при 37 ° С.
  5. Лечить клеткис среды МЕМ, содержащей 2 х LME (250 мкл), т.е. разбавляют 1: 1 дает концентрацию а 25 мм, или с подогретого MEM среде без LME (250 мкл) в контрольных культурах.
  6. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 6% CO 2 в течение 1 часа.
  7. Промывают клетки дважды в свежей предварительно нагретой среде МЕМ, чтобы удалить LME-содержащей среде, а затем заменить удерживается культуральную среду и равный объем свежего подогретого MEM среде в соответствующие лунки.
  8. Возвращение культуры в инкубатор (увлажненный с 6% CO 2 при 37 ° С) и оставить на 24 часов перед дальнейшей обработкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Способность этого метода избирательного устранения микроглии от CGC и / или смешанных культур опирается на последующее способности следователя точно определить и дифференцировать микроглии от окружающих их клеток. Это может быть достигнуто с использованием микроглии конкретных производителя клеток, таких как isolectin-В4, как показано на рисунке 1. Как показано на рисунке 2, не наблюдаемые изменения астроцитов и нейронов плотности и морфологии не были записаны по отношению к каждой осно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важные шаги для обеспечения успешного селективное удаление микроглии от CGC и / или смешанных культур являются: 1) поддержание стерильной и здоровый CGC культуры; 2) Фильтр стерилизации LME-среде, содержащей и возвращение раствора до рН 7,4; 3) ведение нераспределенной CGC массовой информации и на ЛБМ, содержащих носители на 37 ° C, чтобы избежать теплового шока; и 4) работает быстро, чтобы уменьшить время клетки остаются вне инкубатора.

Мы использовали 25 мМ LME истоща...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Aims2Cure, Великобритания и аспирантурой UCL Impact Award в JMP и аспирантурой MRC Capacity Building в области деменции в JMP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы Sigma-AldrichF4142Изогнутый конец облегчает удаление мозжечка...
Микропрепарирующие ножницыSigma-AldrichS3146Прямой, острый конец облегчает вскрытие грызунов P4-7 
L-лейцина метиловый эфир гидрохлоридSigma-Aldrich7517-19-3
раствор EBSS Sigma-AldrichE7510-500 мл
Poly-D-лизинSigma-Aldrich27964-99-4Покровные стекла за 1 день до применения 
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-AldrichA9418
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-AldrichP4417
ДНКазаSigma-AldrichD5025
Ингибитор трипсина сои Sigma-AldrichT6414
Мышиное антитело к ED1 Абкамab31630

Ссылки

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.