Методическая статья

Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

DOI:

10.3791/52989

⸱

18 августа 2015 г.

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги печени, называемые клетками Купфера, отвечают за захват циркулирующих наночастиц. Здесь мы описываем метод выделения клеток Купфера, обладающий высокой чистотой клеток и выходом. Модифицированный анализ LDH используется здесь для измерения токсичности, индуцированной углеродными нанотрубками в клетках Купфера.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство в пробирке nanotoxicological исследований использовали увековечены клеточных линий для их практичности. Тем не менее, результаты испытаний на токсичность наночастиц в бессмертных клеточных линий или первичных клеток показали расхождения, подчеркнув необходимость расширить использование первичных клеток для анализов в пробирке. Этот протокол описывает выделение макрофагами печени мышей, названные клетки Купфера, и их использование для изучения наночастиц токсичности. Купфер клетки наиболее распространенным населения макрофагов в организме и составляют часть ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), ответственного за захват циркулирующих наночастиц. Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой ​​перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Метод, основанный на коллагеназы пищеварения и центрифугирования в градиенте плотности, приспособлен от оригинального протокола, разработанного Smedsrød др. предназначен для крыс isolatio клеток печенин и обеспечивает высокий выход (до 14 × 10 6 клеток на мышь) и высокой чистоты (> 95%) в клетках Купфера. Этот метод изоляции не требует сложного или дорогостоящего оборудования и, следовательно, представляет собой идеальный компромисс между сложностью и выходом клеток. Использование более тяжелых мышей (35-45 г) улучшает выход способа выделени, но также облегчает заметно процедуру катетеризации воротной вены. Токсичность функционализированных углеродных нанотрубок F -CNTs измеряли в этой модели с помощью модифицированного LDH анализа. Этот метод оценивает жизнеспособность клеток путем измерения отсутствие структурной целостности клеточной мембраны купферовских после инкубации с F -CNTs. Токсичность индуцируется F -CNTs может быть измерена с помощью последовательно этот анализ, подчеркнув, что изолированные клетки Купфера полезны для тестирования наночастиц токсичности. Общая понимание нанотоксикологии могли извлечь выгоду из таких моделей, что делает выбор наночастиц для клинического перевода более эффекциент.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поле нанотоксикологии исследований направлена ​​охарактеризовать биологическое действие наночастиц. Токсикологические исследования, основанные на исследованиях в естественных условиях остаются наиболее точных методов. Тем не менее, их применение ограничено их стоимости, трудовых и временных требований 1. Как анализы альтернатив, в пробирке были использованы из-за их простоты и возможности разработки высокой пропускной в пробирке тестирования платформ 2 - так увеличения количества тестируемых условиях. Большинство nanotoxicological исследования проводили с использованием в анализах пробирке с иммортализованных клеточных линий. Тем не менее, существуют опасения относительно экстраполяции этих экспериментальных данных в естественных условиях токсикологических эффектов 3. Действительно, свойства иммортализованных клеточных линий может быть существенно отличается от тканей они были получены из, например, генетической трансформации 4, ухудшение ключевых морфологических признаков5, потеря сотовой полярности 6 и функциональных изменений, таких как регулирование медиаторов воспаления 7.

Клетки Купфера являются наиболее распространенными население макрофагов в организме и непосредственно в контакте с кровью, выравнивая стенки синусоиды печени. В рамках ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС), эти макрофаги несут ответственность за захват циркулирующих наночастиц и поэтому представляют собой весьма подходящую модель для изучения наночастиц токсичности. В естественных условиях 8 и в пробирке были опубликованы в другом месте 9 исследования воспалительных реакций, связанных с клетками Купфера, подверженных наночастиц. Клетки Купфера также участвуют в патогенезе заболеваний печени, таких как алкогольная болезнь печени, 10 фиброза печени 11 или вирусного гепатита 12. Было сообщено, что изолированные клетки Купфера обеспечить полезную информацию для описания клеточных механизмов инвolved к нарушению печени 13,14.

Несколько методов были зарегистрированы для выделения и очистки клетки Купфера. Изолятор может быть результатом механического или ферментативного разложения 15. Коллагеназа пищеварения показывает преимущество сохранения функциональной целостности клеток Купфера, в то время как ведущие к высокой доходности купферовских клеток 16. Многие экспериментальные подходы, различные по сложности и затрат, были использованы, чтобы отделить клетки Купфера от других популяций клеток печени. Например, чистота Купфера клетка может быть достигнуто с помощью иммуноаффинной 17, электрофорез поток 18, селективной адгезии 16 или центробежными методами 16, которые отбирают клетки в зависимости от их размера и плотности. Сочетание этих методов может быть выбран, чтобы повысить чистоту населения 16. Там нет консенсуса о идеального метода для выделения клеток Купфера, а это в основном зависит от применения и имеющихся оборудование длят. Тем не менее, в случае испытаний на токсичность наночастиц, простота и высокий выход техники, связанной с сохранением функциональной клетки Купфера оказались наиболее подходящим для этого применения.

Способ изоляции клеток Купфера сообщалось здесь, основан на методе 2-ступенчатой ​​перфузии с последующей очисткой по градиенту плотности. Этот метод был модифицирован из исходной протоколу, разработанному Smedsrød др. 16 предназначен для выделения клеток печени крысы. Большинство исследований сообщает и описал изоляции клеток Купфера печени крыс с. При этом мы опишем метод, чтобы изолировать клетки Купфера печени от мыши, с высоким выходом и чистотой. Использование мышей снижает стоимость эксперимента и позволяет обработка нескольких печени, чтобы получить большие количества клеток Купфера для тестирования наночастиц токсичности.

В следующем протоколе, клетки Купфера инкубировали с функционализированных углеродных нанотрубок (е -CNTs). Уникальные физико-химические свойства УНТ - т.е. высокое отношение длины к диаметру и большой площадью поверхности, сделали УНТ интересных кандидатов в качестве векторов для целей терапии и диагностики. Тем не менее, проблемы были подняты о токсичности УНТ 19 и разработке новых в пробирке тесты направлена ​​на повышение понимания УНТ биологического эффекта. Токсичность в Клетка Купфера связано с отсутствием структурной целостности клеточных мембран. Этот процесс измеряется потерей цитоплазматического фермента ЛДГ из клетки в супернатанте. Принцип этого метода, таким образом, чтобы удалить любой выпущенный ЛДГ и измерить то, что осталось в клетках 20. Это делается в предпочтении к измерению выпущенный ЛДГ в супернатанте, так как наличие нанотрубок в надосадочной жидкости мешает анализа 21.

Мы предлагаем использовать этот простой и экономически эффективной мето изоляции Купфера клеткиd, чтобы изолировать большое количество функциональных клеток Купфера. Это позволяет скрининг токсичности в диапазоне наночастиц, в соответствующей первичной модели макрофагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были выполнены в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Протокол демонстрируется была выполнена под руководством и утверждении Положения внутренних дел Великобритании

1. перфузии и сбора клеток (рисунок 1)

figure-protocol-1
Рисунок 1:. Печень перфузии после анестезии мыши, желудочно-кишечного тракта в боковом перемещении влево живота для того, чтобы в портальную вену (PV) доступной. П.В. канюлю с помощью медленной скорости потока (1-3 мл / мин) EGTA / HBSS раствора и низший veina вены (НПВ) немедленно разрывается, чтобы избежать избыточного давления в печени. В первую минуту перфузии, расход постепенно повышают до 7 мл / мин. Раствора коллагеназы затем перфузии при 10 мл / мин до тех пор, его полное переваривание пока не будет достигнута.

  1. Подготовительномповторно свежую все реагенты, описанные в таблице материала.
  2. Теплый EGTA (этиленгликоль тетра-уксусной кислоты) / HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) раствор (50 мл на мышь) и раствором коллагеназы (100 мл на мышь) в течение 30 мин при 40 ° С.
  3. Промыть насос гибкий шланг сначала 70% -ным этанолом. Налейте 40 мл ЭГТА / HBSS раствора в пробирку для центрифугирования, погруженного в ванну с водой и ополосните насоса гибкий шланг с подогретого ЭГТА / HBSS решение.
  4. Выполните терминала анестезии с использованием барбитурата надежно производить бессознательное, прежде дыхания и смерти. Вводите фенобарбитал в дозе 1 мг / кг, IP в женской или мужской CD1 мыши (35-45 г). Подтвердите анестезия пальца щипать.
  5. Бритье волос брюшной и стерилизовать в животе поверхность, используя 70% раствор этанола.
  6. Вырезать через брюшную полость и подвергать воротной вены и нижней полой вены путем перемещения в кишечник в поперечном направлении к левой части брюшной полости.
  7. Звездат насос со скоростью 1-3 мл / мин с EGTA / HBSS раствора и иглу в портальную вену с использованием 23 г бабочка иглы (обрезают крылья). Зажмите раздел воротной вены канюлированного с 23 G иглой, а затем переверните сосудистый зажим пинцет на поверхности открытой брюшной полости мыши. Печень должна быстро бледно в течение первых 30 сек ЭГТА / ССРХ Solution перфузии.
  8. Быстро надрезать нижнюю часть нижней полой вены, чтобы избежать избыточного давления здания в печени, а затем увеличить скорость потока постепенно до 7 мл / мин, в течение первой минуты перфузии. Животное умирает из-за кровотечения вторичной полой вены венепункции.
  9. При менее 5 мл / ЭГТА HBSS решение является оставшиеся в центрифужную пробирку, заполнить его с раствором коллагеназы (40-50 мл). Увеличение скорости потока постепенно до 10 мл / мин, в течение 30 сек.
  10. Сделать выпуклость печени путем приложения давления к нижней полой вене, с помощью пинцета, в течение 5-10 с интервалами. Тхис может быть сделано периодически (в 5-10 раз во время пищеварения). Этот шаг позволит повысить диссоциации клеток печени и сократить время перфузии коллагеназой.
  11. При менее чем 10 мл раствора коллагеназы остается в центрифужную пробирку, заливают 40-50 мл подогретого раствора коллагеназы в центрифужную пробирку.
  12. После 10-15 мин перфузии и 70-80 мл раствора коллагеназы перфузии, нанесите небольшое давление на поверхности печени с пинцетом. Печати давления указывает, что клетки печени диссоциируют.
  13. Удалить печень от брюшной полости, как один кусок и поместить его в центрифужную пробирку, содержащую 20-30 мл клеток Купфера изоляции Medium. Хранить клетки печени на льду или при 4 ° С в течение максимального периода 3 часов, чтобы избежать влияния на жизнеспособность клеток печени.
  14. Повторите процедуру перфузии на нескольких животных, если это необходимо, при сохранении печени, поддерживаемой перфузией на льду. Бассейн 2:59 печени для очистки и заполните стадии 3.

2. Подготовка градиент плотности для центрифугирования (Рисунок 2)

figure-protocol-2
Рисунок 2:. Подготовка градиента плотности Все процедуры проводятся в стерильных состоянии. SIP получают путем смешивания 15,3 мл раствора с покрытием частиц кремнезема с 1,7 мл 10 х PBS. Через 5 мл SIP смешивают с 15 мл PBS, чтобы 20 мл 25% -ного раствора SIP. 10 мл SIP смешивают с 10 мл PBS, чтобы 20 мл 50% -ного раствора SIP. Центрифужную пробирку, содержащую 50% раствора SIP (20 мл) наклонена и 25% -ный раствор SIP (20 мл) медленно добавляют с помощью пипетки мл серологической 25.

  1. Перейдите с помощью следующих шагов (раздел 2., 3. и 5.) под стерильном состоянии и сохранить клетки на льду или при 4 ° С. Подготовка SIP (решение изотонический покрытием частиц кремнезема) путем смешивания 15,3 мл раствора с покрытием частиц кремнезема с 1,7 мл 10 х PBS. Для того, чтобы 20 мл 25% -ного раствора SIP, смешать 5 мл SIP с 15 мл PBS. Для того, чтобы 20 мл 50% -ного раствора SIP, смешать 10 мл SIP с 10 мл PBS.
  2. Наполните одну центрифужную пробирку с 20 мл 50% раствора SIP. Наклон центрифужную пробирку под углом, близким к 90 ° и добавить медленно в 25% -ный раствор SIP (20 мл) на боковой стенке трубы с помощью 25 мл серологической пипеткой, не касаясь поверхности 50% SIP слоя. При добавлении 25% -ного раствора SIP, постепенно уменьшить угол трубки. Держите градиент плотности на льду до использования.

3. Клетка Купфера Очистка (Рисунок 3)

figure-protocol-3
Рисунок 3:. Очистка клетки Купфера центрифугированием в градиенте плотности и адгезии клеток Все процедуры проводятся в стерильных состоянии. (А) После разрыва капсулы в Глиссона, в клетки печени фильтруют через 100 мкм фильтр. Суспензию центрифугируют при х 50 г, чтобы отменить гепатоциты (пеллеты) и собрать без паренхимы фракции клеток (супернатант). Этот шаг повторяется 3 раза. Номера паренхиматозные клетки добавили сверху прерывистой изотонического градиента и центрифугировали при 800 х г в течение 15 мин. Купфера клетки, собранные из 25% SIP подушки очищают далее путем выбора клеточной адгезии. (B) Клетки высевают в 24-луночный планшет и инкубировали при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 30 мин. Неприлипающие клетки один раз промывали 500 мкл HBSS. Клетки Купфера отображать их приверженцем морфология 4 часа после посева, когда F -CNTs могут быть добавлены к клеткам. Шкалы представляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Положите одну перфузии печени в чашке Петри с 15 мл Купфера сотовый изоляции Medium. Разрыв капсулы в Глиссон (вмембрана печени) с помощью ножниц и освободить всех клеток печени в изоляторе среды купферовских. Фильтр решение, хотя фильтр 100 мкм клеток, которые будут собраны в центрифужную пробирку. Повторите процедуру перфузии на дополнительных перфузии печени и объединить ячейки в той же центрифужную пробирку (15 мл из одной мыши, до 45 мл из трех мышей).
  2. Центрифуга клеточной суспензии в 50 мкг в течение 2 мин при 4 ° С. Паренхимных клеток (гепатоциты) будет в осадок и не паренхиматозные клетки (в том числе клетки Купфера) будет в надосадочной жидкости.
  3. Собирают супернатант в чистую центрифужную пробирку и центрифугируют при 50 мкг в течение 2 минут каждый. Повторите этот шаг еще три раза.
  4. Центрифуга при 1350 мкг в течение 15 мин для осаждения без паренхиматозных клеток. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл Купфера сотовый изоляции Medium.
  5. Добавьте без паренхимы решение клеток на разрывной изотонического градиента 25/50%, как описано в 2.3. Центrifuge на 850 мкг в течение 15 мин без ускорения или перерыва.
  6. Локализация обогащенный Kupffer клеточной фракции, появляющийся в мутной 25% SIP фракции, близком к интерфейсу SIP 25/50% (рисунок 3). Использование 10 мл серологические пипетки, аспирации около 12 мл обогащенной фракции клеток купферовских. Передача клеток в центрифужную пробирку, содержащую 35-40 мл Купфера сотовый изоляции среде. Тщательно перемешать и центрифуге при 1350 х г в течение 15 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
  7. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 5-10 мл подогретого Купфера клеточной культуральной среды. Граф клеток (гемоцитометре) и определения жизнеспособности с использованием трипанового синего окрашивания.
  8. Пластина очищенные без паренхимных клеток в 24-луночные планшеты при плотности 5 × 10 5 клеток / лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 (рисунок 3). Через 30 мин, осторожно удалить носитель, промыть предварительно нагревают сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) один раз, затем заменитьэто 500 мкл свежей и предварительно нагревают Купфера клеточной культуральной среде (на лунку).
  9. Оставьте клетки Купфера, по крайней мере, 4 ч при 37 ° С и 5% СО 2 перед обработкой с наночастицами, чтобы позволить им приобретают клейкий морфологию.

4. Характеристика

  1. Клетки Купфера Чистота
    1. Готовят свежий раствор PBS / BSA, используемый для поддержания жизнеспособности клеток Купфера. Промыть клетки один раз с 500 мкл раствора PBS / BSA. Удалить раствор PBS / BSA и отделить клетки Купфера в 500 мкл свежего раствора PBS / BSA с использованием нежный соскоб. Когда клетки высевают в 24-луночные планшеты, сократить конечностей скребковых лопастей с ножницами, чтобы сделать проще отряд, чтобы продолжить. Перевести клетки в проточной цитометрии труб.
    2. Граф Купфера клетки, используя гемоцитометра и центрифуги 1 х 10 5 клеток на 1350 х г. Ресуспендируют клетки Купфера в 30 мкл F4 / 80 антителом (чистый). Все хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Хранить неокрашенных клеток (не инкубированных с антителом) на льду.
    3. Добавить 2 мл раствора PBS / BSA в окрашенных клеток, центрифуги при 1350 г в течение 5 мин и отбросить полученного супернатанта. Ресуспендируют окрашенных клеток в 200 мкл PBS / BSA.
    4. Для анализа потока цитометрии, ворота 10000 запятнано Купфера клетки в зависимости от их размера (вперед разброс) и детализации (боковой разброс). Анализ флуоресценции закрытых ячеек в Флорида-1 канала.
    5. Повторите процедуру для окрашенных клеток Купфера, сохраняя те же параметры, используемые для анализа потока цитометрии неокрашенных клеток Купфера. Выбрать и количественной оценки флуоресценции клеток, окрашенных для оценки чистоты Клетка Купфера.
  2. Купфер сотовый фагоцитарной активности
    1. Заменить носитель с 0,5% (об / об) флуоресцентные шарики в Купфера клеточной культуральной среды и инкубируют в течение 4 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    2. Для того, чтобы удалить без усвоенные бусы, центрифуг клетки Купфера при 1350 мкг, диSCard супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл PBS / BSA решение. Повторите этот шаг еще в 2 раза.
    3. Scrape клетки Купфера в 500 мкл PBS / BSA решение и передачи клеток в проточной цитометрии трубки.
    4. Центрифуга клетки Купфера при 1350 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в 200 мкл PBS / BSA решение.
    5. Для анализа потока цитометрии, ворота 10000 запятнано Купфера клетки в зависимости от их размера (вперед разброс) и детализации (боковой разброс). Анализ флуоресценции закрытых ячеек в Флорида-2 канала.

5. Инкубационный химически функционализованных углеродных нанотрубок (F -CNTs)

  1. Готовят дисперсию F -CNTs (1 мг / мл) в воде при обработке ультразвуком в течение 15 мин перед использованием. F -CNTs готовят в доме 22.
  2. Подготовка 2x концентрированные f-УНТ дисперсия в Купфера клеточной культуральной среды. Соникатные f- УНТ, диспергированные в среде для2 мин, прежде чем приступить к шагу 5.3).
  3. Для каждой лунки, заменить 250 мкл старой среды с 250 мкл 2x F -CNTs дисперсии. Необработанные скважины (250 мкл кондиционированной среды + 250 мкл свежей Купфера клеточной культуральной среды) и скважины обрабатывают 10% ДМСО использовали в качестве негативного и позитивного контроля, соответственно.
  4. Инкубируйте клетки Купфера при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 или 72 ч.

6. Токсичность Оценка F -CNTs в клетках Купфера по модифицированной лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Пробирной

  1. Удалите супернатант.
  2. Добавить 200 мкл (на лунку 24-луночного планшета) буфера для лизиса и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин-1 час.
  3. После проведения активную пипеткой, собирают лизируют клетки Купфера в микроцентрифужных пробирках и центрифугируют при 40000 х г в течение 10 мин для осаждения F -CNTs, которые были приняты до клетками и клеточного дебриса.
  4. Сбор супернатанты (ƒ-CNT бесплатно) вмикроцентрифужные трубы и хранить при температуре -20 ° С или перейдите к шагу 6.5).
  5. Передача 50 мкл в 96-луночный планшет и добавляют равный объем раствора субстрата смесь (LDH комплекта) в каждую лунку. Накройте тарелку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин перед добавлением 50 мкл стоп-раствора (ЛДГ комплект). Добавить трижды пустых лунок, содержащих 50 мкл буфера для лизиса, 50 мкл раствора субстрата смеси и 50 мкл стоп-раствора.
  6. Измерить оптическую плотность при 490 нм в микропланшетного и использовать следующую формулу для вычисления (%) жизнеспособность клеток.

figure-protocol-4

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количество не очищенных паренхиматозных клеток согласуется и колебалась между 8 и 14 х 10 6 клеток на мышь (проводились 17 изоляция). Каждый изоляция мыши было достаточно, чтобы пластина 16 до 28 скважин. Жизнеспособность клеток путем окрашивания трипановым синим показала жизнеспособность клеток ~ 95%. Клетки Купфера показали круглую форму в течение 30 мин инкубации при 37 ° С, в связи с их неполной клейкого морфологии (фиг.4А). В 4 часа инкубации и впоследствии клетки распространились и клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие шаги имеют решающее значение для достижения высокой урожайности и высокой жизнеспособности клеток Купфера. Асептических условиях должны быть использованы, чтобы снизить риск бактериального и грибкового загрязнения. Все инструменты должны быть стерилизованы перед использованием. Реагенты должны быть свежеприготовленной перед проведением процедуры выделения.

Выбор коллагеназы IV с низкой активностью трипсином, имеет решающее значение. Различные много из того же поставщика есть другой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана программой EU FP7-ITN Marie-Curie Network RADDEL. MB и KAJ выражают благодарность Джо Варгезе и Руи Серра Майя за их помощь и предложения по оптимизации выделения клеток Купфера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эутатал (пентобарбитал натрия)Мышей Merial
CD1Charles River   -Вес мыши должен варьироваться от 35 до 45 г. Мы рекомендуем использовать самцов мышей CD1, так как их вес быстро увеличивается (<например>например вес самца мыши CD1 в возрасте 7 недель превышает 35 г). Также рекомендуется заранее связаться с поставщиком животных, чтобы договориться о доставке более старых животных. В качестве альтернативы животные могут находиться в помещении для достижения желаемого веса.
HBSS (Ca2+ и Mg2+ free, с бикарбонатом)   Технологии жизни   14175-053HBSS должен быть  Ca2+ бесплатно. 
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA) тетранатриевая соль Сигма-Олдрич   E8145   ЭДТА также может быть использована, но EGTA имеет преимущество в хелатировании Ca2+ селективно.
ГЕПЕС (1 М) Технологии жизни   15630-056 100 мл 
Коллагеназа типа IV Уортингтон CSL-4 Рекомендуется протестировать разные партии коллагеназы или хотя бы сообщить поставщику, что продукт должен быть пригодным для выделения клеток печени.
  Низкий уровень глюкозы DMEM Сигма-Олдрич   D5523 500 мл 
RPMI (с пируватом натрия и глутамаксом)Технологии жизни   12633-012 500 мл
Пенициллин/Стептомицин Технологии жизни   15140-122100 мл
Фетальная бычья сыворотка Первая-ссылка   60-00-850 500 мл 
Раствор трипана синего Сигма-Олдрич Т8154 100 мл 
Покрытый раствор частиц диоксида кремния (Percoll)GE Healtcare   17-0891-02 Percoll® очень стабилен и может храниться в течение нескольких лет;
1x Фосфатно-солевой буфер   Технологии жизни   10010-023500 мл 
10x Фосфатно-солевой буфер   Технологии жизни   70011-036500 мл
Диметилсульфоксид Рыбак D/4120/PB08 500 мл 
Набор для ЛДГ (CytoTox 96) Promega G1781 Хранить в защищенном от света месте;
ДММ фенол красный свободный LifeTechnologies   31053-028 500 мл 
F4/80 антитело (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488Не разбавлять, используется в чистом виде для проточной цитометрии
Флуоресцентные шарикиSigmaL2778Латексные шарики, аминомодифицированный полистирол, флуоресцентный красный. 1 мл
Название материалаКомпания Каталожный номер Комментарии/Описание 
Набор для сбора крови бабочек (трубка длиной 23 г/305 мм)   BD 
Шприцевые фильтры (0,22 μ m Blue Rim) Минисарт 16534-K 
Центрифужные пробирки (50 мл Blue Cap) BD Biosciences, Falcon 35 2070 
Чашка Петри (90 x 15 мм) Thermo Fisher Scientific   BSN 101VR20 
100 μ Ситечко для клеток M   BD   352360
Перистальтический насос Уотсон Марлоу SciQ 300   Промывайте трубки до и после каждого использования стерильным PBS и 70% этанолом.
24-луночные планшетыCorning   3526
96-луночные планшеты Corning   3595
Центрифуга Eppendorf5810R
Считыватель пластинBMG LabtechFLUOstar Omega
Serrefine щипцыHammacher GmbH Арт. No HSE 004-35 / Кат. No 221-0051Зубчатые щипцы позволяют зажимать сосуд, канюлированный иглой 23 G, без необходимости удерживать щипцы во время процедуры перфузии. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Пробирки проточной цитометрииBD Biosciences, Falcon 
Микроцентрифуга пробирки (1,5 мл)Elkay  000-MICR-150
Скребок для клетокBD Biosciences, Falcon353086Разрежьте лезвия конечностей с помощью ножниц для соскабливания клеток в 24-луночных планшетах.
Наименование компании, производящей реагенты Каталожный номер Комментарии/Описание 
  Раствор EGTA (Этиленгликоль тетрауксусная кислота)/HBSS (Сбалансированный раствор соли Хэнка) HBSS, содержащий 0,5 мМ EGTA и 25 mM HEPES. Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 50 мл на каждую печень для перфузии.  
Раствор коллагеназы DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащая коллагеназу IV типа в дозе 100 ЕД/мл, 15 мМ HEPES и 1% пеникллин/стрептамицин (v/v). Отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте по 100 мл на каждую печень для перфузии. После добавления коллагеназы рекомендуется прогреть раствор в течение 30 минут перед использованием. Это позволяет проводить оптимальную активность коллагеназы.
Среда для выделения клеток Kupffer RPMI содержит, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакс® (v/v) и 1% пеникллин/стрептомицин (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени.  
Среда для культивирования клеток Kupffer RPMI содержит 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% заменимых аминокислот (v/v), 1% глутамакс® (v/v) и 1% пеникллин/стрептамицин (v/v). Приготовьте не менее 100 мл на 1-3 печени.  
SIP (раствор изотонически покрытых частиц диоксида кремния)Смешайте 1,7 мл 10x фосфатного буферного раствора с 15,3 мл Percoll® для получения 17 мл SIP.
25% SIP решение Смешайте 5 мл SIP с 15 мл 1x Фосфатно-солевой буфер   
50% SIP решение Смешайте 10 мл SIP с 10 мл 1x Фосфатного буферного раствора 
Лизисный буферDMEM media с 0,9% раствором
PBS/BSAПриготовьте свежий фосфатный буферный физиологический раствор pH 7,4 с 1% бычьего сывороточного альбумина.
367288352052 Triton X-100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Kupffer Cell IsolationNanoparticle Toxicity TestingMouse Liver MacrophagesCollagenase DigestionDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisFunctionalized Carbon NanotubesModified LDH AssayNon Parenchymal CellsPortal Vein Cannulation

Похожие статьи