Эта статья демонстрирует хирургические процедуры гастроэзофагеального рефлюкса с мышами. Эти модели являются полезными инструментами для исследования механизмов и лечения болезни гастроэзофагеального рефлюкса и потенциально болезни Барретта и аденокарциномы пищевода.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хирургические Модели гастроэзофагеальной рефлюксной с мышами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Было сообщено о множестве хирургичесkých процедур, которые могут вызвать гастроэзофагеальную рефлюксу у животных. В данной работе мы описываем три хирургичесkých модели с мышами с целью индукции рефлюксу желудочного содержимого, содержимого двенадцатиперстной кишки или смешанного содержимого. Хирургические процедуры и общие принципы были подробно описаны. Исследователь с хирургичесским опытом должен быть в состоянии освоить технику после короткого периода практики. После операции большинство мышей могут выжить и развить рефлюкс-эзофагит, похожий на таковой у людей. Однако следует отметить, что гистологические различия между пищеводом мыши и человеческим являются присущими ограничениями этих хирургичесkých моделей. Если используются для исследования барретовского пищевода и аденокарциномы, эти процедуры могут потребовать комбинации с генетическими модификациями.
Введение
Болезнь гастроэзофагального рефлюкса (БГЭР) – это хроническое заболевание, вызываемое длительным воздействием содержимого желудка или желудочно-двенадцатиперстной кишки на дистальную часть пищевода1. Длительное воздействие этих вредных рефлюксатов нарушает внутренние защитные механизмы слизистой оболочки пищевода и, таким образом, приводит к эзофагиту2. Барретт-пищевод возникает при хроническом рефлюксе и является предраковым поражением с повышенным риском развития аденокарциномы пищевода3,4. Несмотря на клиническую важность, механизмы БГЭР, Барретт-пищевода и аденокарциномы до сих пор не полностью понятны.
Животные модели необходимы для исследований этиологии, патологии, молекулярных механизмов, профилактики и лечения человеческих заболеваний. По настоящее время были разработаны различные животные модели БГЭР, Барретт-пищевода и аденокарциномы с использованием модельных животных5,6. Пищевод мыши выстлан многослойным плоским эпителием, гистологически схожим с человеческим пищеводом. Хотя мышиный пищевод отличается от человеческого пищевода в плане кератизации и отсутствия подслизистых желез, мышь все равно является привлекательной модельной животной из-за относительно низкой стоимости содержания и потенциала сложных генетических модификаций. Для моделирования БГЭР, Барретт-пищевода и аденокарциномы у мышей обычно используются два подхода: хирургия рефлюкса и генетические модификации. Хирургия рефлюкса является лучшим способом вызвать рефлюкс, а генетические модификации имитируют молекулярные изменения5,7. Хирургия рефлюкса может быть комбинирована с генетическими модификациями для более глубокого понимания механизмов заболевания8.
Множество хирургических процедур было описано нами и другими авторами6,9: (1) желудочный рефлюкс: пилорическая лигатура, пилорическое сужение с лигатурой преджелудка, кардиопластика Венделя и эзофагогастростомия; (2) смешанный рефлюкс: эзофагогастродуоденальная анастомоз, эзофагодуоденальная анастомоз (или эзофагоеюностомия); (3) дуоденальный рефлюкс: эзофагогастродуоденальная анастомоз плюс гастректомия; (4) рефлюкс химических компонентов: желчный рефлюкс, поджелудочная рефлюксия, перфузия пищевода; и (5) трансплантация пищевода5. Недавно была описана микрохирургическая модель мыши, которая позволяет создать рефлюкс тонкой кишки с помощью эзофагоеюностомии с магнетами10. Эти хирургические модели имеют преимущества перед in vitro моделями клеточной культуры или органотипной культуры. In vitro, клетки пищевода не могут переносить среду с высокой кислотностью или высокой концентрацией желчных кислот. Неконъюгированные желчные кислоты, которые обычно используются для создания изменений в клетках эпителия пищевода in vitro , обычно отсутствуют в дуоденальном рефлюксате in vivo. Таким образом, выводы, сделанные на основе таких in vitro исследований, следует рассматривать с осторожностью.
Хирургия на мышином пищеводе остается технической проблемой из-за его малого размера. Низкая степень выживаемости после операции не позволяет проводить эксперименты, требующие определенного размера выборки для достижения статистически обоснованных выводов. В прошлом мы успешно разработали и охарактеризовали хирургические модели желудочного рефлюкса, смешанного рефлюкса, дуоденального рефлюкса с мышами в долгосрочных экспериментах9,11,12. Мы также предоставляли консультации нескольким другим группам в их хирургии мышей. Здесь мы описываем три хирургические процедуры у мышей, чтобы помочь сообществу установить эти модели в своих лабораториях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.
1. Подготовка Мышь
- Используйте мышь над ~ 20 г массы тела или выше ~ 6 недель в возрасте для хирургии.
- До операции, дать мышам лаборатории чау и воды вволю и поддерживать на 12:12 час свет-темнота цикла.
- Бритье хирургического зона с машинки для стрижки волос. Обезболить мышей внутрибрюшинным введением 80 мг / кг кетамина и 12 мг / кг ксилазина. Эта доза ставит мышей в сон в течение нескольких минут и обеспечивает достаточное обезболивание для следующих хирургических процедур.
- Подтвердите правильное обезболивания, основанный на отсутствии роговицы рефлекс и конечностей втягивания, когда разбойник зажат. Применить смазочных глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Стерилизовать кожу бетадином решения.
2. желудочного рефлюкса Модель (1В)
- Сделайте верхнийсрединный разрез от ~ 2 см, начиная с мечевидным указывая на анус.
- Откройте брюшной полости через линии. Удалить мечевидного для повышения экспозиции с ножницами.
- Отдельная и сократить соединительной ткани между печени и желудка. Лигировать и вырезать пучок сосудов между селезенки и глазного дна, чтобы полностью освободить дно.
- Поверните глазного дна немного влево и выставить левую сторону желудочно-перехода в поле. Сделайте 5 мм продольный разрез на мышцы вдоль дистального отдела пищевода с использованием пары острых ножниц, чтобы выставить эпителий.
- Разрежьте эпителий в том же направлении (разрез 1, 1В). Сделать три разрезы на forestomach (2 разреза, 3 и 4, Фигура 1В), чтобы отрезать большую часть forestomach с острыми ножницами эксплуатации. Если желудок не пуст, тщательно удалить содержимое желудка.
- Поставьте 8-0 проленовой ŞuţuRe (с конической точки иглы) через точку А (на пищеводе) и точка А '(на forestomach) с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции. Аналогичным образом место швы через точку В и точка В ', и другими парами точек, соответственно. Равномерно пространстве эти швы 3-4 мм друг от друга.
- Вымойте брюшной полости физиологическим раствором для очистки крови и содержимого желудка. Закройте брюшной стенки с шелковыми швами и кожу с металлическими зажимами.
3. Смешанный рефлюкс Модель (рис 1С)
- Последующие шаги 2.1 до 2.4, чтобы разоблачить желудочно-пищеводного соединения.
- Аккуратно отделить спинной стороне пищевода из кровеносных сосудов позади пищевода. Пройдите небольшой кончик хлопок между пищеводом и кровеносных сосудов.
Примечание: Хлопок может быть частично удаляют из наконечника, чтобы уменьшить его размер. Этот совет хлопок служит двум целям, поднимая пищевод и защиты кровеносных сосудов. - Сделайте два 5 мм продольное вклisions друг на желудочно-перехода и проксимальный конец двенадцатиперстной кишки, прилегающей к привратника с острыми ножницами эксплуатации. Для разреза на двенадцатиперстную кишку, во избежание кровеносные сосуды и разместить на анти-брыжеечной границе.
- Анастомозирует разрезы с точным слизистой слизистой оболочки оппозиции прерванных 8-0 Prolene швов. Обычно место 3-4 швов на спинной стороне и 2-3 швов на лицевой стороне.
- Снимите наконечник хлопка. Промыть брюшную полость с физиологического раствора и закрыть брюшной стенки и кожу.
4. двенадцатиперстной рефлюкс Модель (рис 1D)
- Следуйте шаг 3.1 до 3.4 для создания смешанного рефлюкса.
- Осторожно поднимите живот, чтобы выставить свою обратную сторону. Выступ печени может быть захвачен соединительной ткани между печени и задней части желудка. Аккуратно вырежьте соединительной ткани, должным образом защитить печень, и выставить кровеносные сосуды на спинной стороне пищевода.
- Перевязывать исократить кровеносные сосуды. Перевязывать и сократить пищевод в желудочно-перехода.
- Перевязывать двенадцатиперстную кишку на привратника. Перевязывать и сократить брыжейки. Снять целый желудок.
- Промыть брюшную полость с физиологического раствора. Закройте брюшной стенки и кожу.
5. После хирургического лечения
- После операции поддержания температуры тела с грелку. Лишь после восстановления грудины лежачее положение, место мышей обратно с другими животными.
- Дайте антибиотики и обезболивающее для предотвращения инфекции и облегчить боль. Вводите Baytril (10 мг / кг, внутрибрюшинно, ежедневно, в течение 3 дней), чтобы предотвратить инфекцию, и бупренорфин гидрохлорид (0,05 мг / кг, подкожно, ставка. В течение двух дней), как болеутоляющее средство. Пост не является необходимым после операции.
Жидкость или мягкое диета может быть предоставлена. - Оценить общее состояние здоровья на ежедневной basis.If мышей показывают следующие признаки (драматическая потеря веса> 15%, отсутствие приложенияetite, вокализации, выделения из носа, рта или глаз, сгорбившись жест, бездействия, ненормальное уход деятельности), усыпить мышей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Большинство мышей (> 95%) может пережить операцию. В послеоперационном периоде, ведущие причины смерти включают передозировку анестетиков, кровотечение и неизвестные причины.
Четыре недели после операции,> 90% мышей с желудочного рефлюкса или смешанной рефлюкса и> 80% мышей с двенадцатиперстной рефлюкса могут выжить. В течение этого периода, в первую очередь мышей умирают от пищевода стриктуры и невозможность поесть. Эти мыши обнаруживают признаки сильного стресса (сгорбившись позе,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Различные хирургические модели были созданы, чтобы имитировать желудка, язва двенадцатиперстной и смешанный рефлюкс у грызунов. Эти три процедуры, описанные здесь, подходят для долгосрочных экспериментов с разумным ценам послеоперационного выживания. Исследователь с опытом хирургического должны быть в состоянии понять технику после короткого периода практики.
Кровотечение может быть результатом внутрибрюшинной инъекции анестетиков до операции, рваные раны печени во время разделения соедините...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Один из авторов (XC) получил финансирование, предоставленное компанией Takeda Pharmaceutical Company Ltd, которая поддерживает фундаментальные исследования, связанные с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью. Ни одно из реагентов или инструментов, использованных в этой статье, не производится этой компанией.
Благодарности
Мы зарегистрированы как организация, получающая гранты на исследования от Национального фонда естественных наук Китая (NO. 81400590), Национального института здравоохранения (U54 CA156735) и фармацевтической компании Takeda Pharmaceutical Company Ltd. (MA-NC-D-156).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
Ссылки
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59(2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
