Методическая статья

Порядок Decellularization из печени крыс в перфузии устройство Качающийся давления

DOI:

10.3791/53029

⸱

10 августа 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1General, Visceral, and Transplantation Surgery, Charité – Universitätsmedizin Berlin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные методы забора печени, канюляции и перфузии с использованием нашего запатентованного устройства позволяют создавать сложные перфузионные установки для улучшения экспериментов по децеллюляризации и рецеллюляризации в печени крыс.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Децеллюляризация и рецеллюляризация паренхиматозных органов могут обеспечить генерацию функциональных органов in vitro, и уже опубликовано несколько протоколов децеллюляризации печени грызунов. Мы стремились улучшить процесс децеллюляризации путем создания запатентованного перфузионного устройства, позволяющего селективно проводить перфузию через воротную вену и/или печеночную артерию. Кроме того, мы стремились выполнить перфузию в условиях колеблющегося окружающего давления для улучшения однородности децеллюляризации. Гомогенность перфузионной децеллюляризации до настоящего времени была недооцененным фактором. Во время децеллюляризации области внутри органа, которые плохо перфузируются, могут все еще содержать клетки, в то время как внеклеточный матрикс (ВКМ) в хорошо перфузированных областях может уже быть поражен щелочными детергентами. Осциллирующие изменения давления могут имитировать изменения внутрибрюшного давления, которые происходят во время дыхания, чтобы оптимизировать микроперфузию внутри печени. В представленном здесь исследовании децеллюляризованные матрицы печени крыс были проанализированы путем гистологического окрашивания, анализа содержания ДНК и коррозионного литья. Перфузия через печеночную артерию показала более однородные результаты, чем перфузия портальных вен. Применение условий колебательного давления повысило эффективность перфузионной децеллюляризации. Печень, перфузированная через печеночную артерию и в условиях колебательного давления, показала наилучшие результаты. Представленные методы забора печени, канюляции и перфузии с использованием нашего запатентованного устройства позволяют создавать сложные перфузионные установки для улучшения экспериментов по децеллюляризации и рецеллюляризации печени крыс.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decellularization и recellularization может позволить поколение функциональных, трансплантации органов в пробирке 1. Путем удаления клеток и антигенного материала (например., ДНК, альфа-гал эпитопы) из органа, не- или менее иммуногенной внеклеточного матрикса (ЕСМ) может быть получена. Эта матрица сохраняет трехмерное микроанатомии органа и может служить в качестве идеального биоматрицы для заселения с клетками другом, возможно, ксеногенной происхождения 2. Таким образом, decellularized крысы матрица печени может быть заселен клетками печени человека. Это гуманизированный микро-печени может служить экс естественных условиях модели для исследования на заболевания (например, врожденные., Метаболические заболевания, вирусные заболевания или злокачественные новообразования) или для доклинических испытаний фармацевтической 3.

Несколько различных протоколов для перфузии печени крыс decellularization уже были опубликованы 4-13. Во всех протоколов, decellularлизации была достигнута путем перфузии щелочных ионных или неионных детергентов через канюлированную воротную вену. Для нашим сведениям, мы были первой группой, чтобы сообщить крыс decellularization печени путем селективного перфузии через портальную вену и / или печеночной артерии крысы 14. Включение селективного перфузию различных сосудистых систем в печени может позволить лучшие результаты decellularization и, кроме того, могут играть важную роль в клеточном репопуляции.

В исследовании подробно здесь, печень перфузии в заказ фирменной перфузии устройства, что позволяет перфузии при колеблющихся условиях давления. Эти условия давления имитировать физиологическую дыхательных-зависимую перфузии печени: в месте, печени висит под связки диафрагмы, чьи движения при дыхании имеет прямое влияние на перфузии печени. Вдохновение, специально приводит к снижению диафрагмы и сжимая печени, оптимизациигепато-венозный отток, в то время истечения приводит к высоте в печени и снижение внутрибрюшного давления, чтобы оптимизировать портального венозного притока 15.

Наша цель в том, чтобы оценить, насколько условия колеблющиеся давления имеют влияние на однородность перфузии печени крыс decellularization имитируя условия внутрибрюшного бывших естественных условиях. Однородность процесса decellularization может быть недооценена фактором перфузии decellularization. Все известные вещества, используемые для decellularization печени вызывают изменения в ECM. Клетки плохо перфузированных районах по-прежнему в ECM, в то время как другие области уже полностью decellularized. Чтобы растворить остальные клетки, продолжительность перфузии или давление должно быть повышенным, в результате чего несколько изменений в хорошо увлажненную областей. Таким образом, моющие средства для decellularization должны быть распределены равномерно внутри органа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные содержались в фонд экспериментальной медицины (МКЭ, Шарите, Берлин, Германия), и все экспериментальные протоколы были рассмотрены и утверждены Государственным управлением здравоохранения и местных дел (LAGeSo, Берлин, Германия;. Рег номер О 0365 / 11).

1. Печень урожая

  1. Предоперационная подготовка
    1. Используйте пробки пластину для фиксации. Положите медицинской драпировка на тарелку. Используя четыре иглы, исправить ингаляции маску на пробковой пластины для интраоперационной ингаляционного наркоза.
  2. Предварительной договоренности о портальной венозной канюли
    1. Подключите периферийное венозный катетер (G 20) в трехходовым краном. Венозный катетер следует обрезать под углом, длиной ок. 1,5 см.
    2. Де-воздух системы с помощью шприца 10 мл, заполненный раствором Рингера. Это очень важно тщательно де-воздух, потому что газ эмболии может негативно повлиять на перфузии decellularization.
  3. Предварительная договоренностьартериальной канюли
    1. Использование бабочки канюли и сократить иглу длиной 5 мм. Установите трубку 5 см (0,58 мм ID; ОД 0.96 мм) в 5 мм иглы и закрепите его суперклеем. Вставьте 2 см длиной трубки с (ID 0,28 мм; 0,61 мм ОД) в большей трубки и закрепите его суперклеем.
    2. Слип другую трубу над этой конструкции в качестве упора и закрепите его суперклеем. Де-воздух артериальной канюлей со шприцем 5 мл, заполненной раствором Рингера.
  4. Анестезия и Обезболивание
    1. Вызвать наркоза крыс в анестезии индукции камеры на 3,5% изофлуран в кислороде при расходе 1,5 л / мин.
    2. Для обеспечения безопасной обезболивание во время операции, инъекции метамизол (100 мг / кг массы тела) и низкой дозы кетамина / медетомидин (10 мг / 0,1 мг на кг массы тела) внутрибрюшинно.
    3. Поставка 1,5% изофлуран в 1 л / мин кислорода с помощью маски для ингаляции для последующего поддержания хирургической анестезии.
  5. Предоперационное Устройства <ол>
  6. Бритье живот либерально с электрическим сдвига машины. Смочите бритая разрез сайт в животе с 70% этанола для дезинфекции.
  7. Поместите животное в положении лежа на спине на подготовленную тарелку, вставить голову в ингаляционной маске и исправить конечностей с медицинской ленты и булавки. Удалите излишки этанола и мех с марлевой компресса.
  • Оценка Анестезия
    1. Оценить глубину анестезии, наблюдая частоту дыхания. Когда анестезия кажется достаточно глубоко (40-60 вдохов / мин), проверьте обезболивание достаточно, пытаясь спровоцировать палец щепотку рефлекс, используя хирургические щипцы ущипнуть кожу между пальцами обеих задних конечностей.
  • Брюшной подход
    1. Сделать средний разрез в хвостовой брюшной стенки над мочевым пузырем. Вырезать из этой точки с обеих боковых реберных дуг в V-образной форме. Позаботьтесь, чтобы не врезаться в мембрану. Потяните вырезать брюшной стенки на груди.
      2. Fix мечевидного с Оверхолт зажима, потяните его краниально и закрепить его резинкой. Используйте мокрую ватные тампоны, чтобы эвакуировать в кишечник. Оберните кишечник в мокрой марлевой повязкой. Кроме того, охватывают все брюшные поля с влажными бинтами.
  • Подготовка печени
    1. Проанализируйте серповидной связки. Используйте влажную марлевую повязку, чтобы держать медиальной и левой долей печени краниально под куполом диафрагмы. Expose гепатодуоденальной связки и верхнюю сальника доли печени.
    2. Используйте два microforceps и весенние ножницы, чтобы тщательно анализировать связки, прикрепленный к верхней сальниковой доли до доли не мобильная. Перемещение с помощью влажных доли ватные тампоны под марлевой компресс, держа медиальной и левой долей на месте.
    3. После мобилизации верхнего сальника доле печени, желудка двигаться влево. Закрепите живот с зажимом и рассекают незначительные сальник с microforceps и весенних ножницами.
    4. Мобилизовать нижнюю omentaл доля печени до тех пор, пока мобильная и впоследствии переместить обратно в мочку ее полости. Использование зажима Бакхаус сохранить в двенадцатиперстную кишку. Перемещение в двенадцатиперстную кишку, чтобы левая растянуть и выставить печеночно связки. Ограничить общий желчный проток в растянутой печеночно связки.
    5. Проанализируйте желчный проток из жировой ткани поджелудочной железы и. Вырезать желчного протока 1,5 см от желчных протоков бифуркации. Проанализируйте воротной вены из окружающей жировой ткани. Expose гастродуоденальной вену.
    6. Перевязывать гастродуоденальной вены в два раза с шелком 6-0 и разделить вену между 2 лигатур. Проанализируйте чревного ствола и общей печеночной артерии от окружающей ткани, пока все артериальной ветви не выявлено.
    7. Освободи гастродуоденальной артерии от окружающих тканей. Свяжите гастродуоденальной артерии в два раза с шелком 6-0, с связи удаленных друг от друга. Проанализируйте гастродуоденальной артерии между 2 лигатур.
    8. Освободи селезеночной артерииот окружающей ткани. Tie селезеночной артерии дважды шелка 6-0, с связи удаленных друг от друга. Проанализируйте селезеночной артерии между 2 лигатур.
    9. Освободить левую артерию желудка от окружающей ткани. Tie левой желудочной артерии дважды шелка 6-0, с связи удаленных друг от друга. Проанализируйте артерию между 2 лигатур.
    10. Ограничить в нижней полой вены между правой почки и правого бокового доле печени. Проанализируйте вены из забрюшинного пространства. Expose аорты, следуя чревного ствола.
    11. Проанализируйте забрюшинного жировой ткани. Вводите 1000 IE гепарин в 1 мл физиологического раствора в нижнюю полую вену. Уберите канюли и закрыть разрез с ватным тампоном. Подождите 1-2 минуты для системного эффекта гепарина.
    12. Ограничить аорты с щипцами. Проанализируйте аорты и обескровить крысу. Кроме того, рассекать нижнюю полую вену дистально из почек.
  • Воротной вены катетеризации (использование канюли подготовлен в разделе 1.2)
    1. Сделайте рыбы рот разрез в дистальной воротной вены. Откройте разрез с пинцетом и иглу в портальную вену. Промойте печень с 20 мл раствора Рингера, пока обесцвечивает печени и исправить канюли с лигатур (шелк 6-0).
  • Артериальная катетеризация (использование канюли подготовлен в разделе 1.3)
    1. Проанализируйте выше чревного ствола аорты. Освободи аорты сегмент из забрюшинного пространства. Вырезать аорты сегмент в продольном направлении генерировать аорты патч. Вставьте построенного собственными канюли в статическом держателя.
    2. Используйте пинцет, чтобы 2 скольжения аорты повязку на канюли. Перевязывать печеночной артерии с шелком 6-0 над канюли и зафиксировать пластырь на упора.
  • Печень Эксплантация
    1. Откройте диафрагму, сделать круговые разрез и рассекать печень от окружающих структур.
  • Хранение
    1. СтоRe печени в стерильной бака 500 мл, наполненной 350 мл раствора Рингера до использования.

    • 2. моющих растворов

    1. 10% Тритон Х-100 раствор
      1. Заполните 1000 мл флакон с 900 мл дистиллированной воды. и добавляют 100 мл Triton X-100 (99,9%). Используйте мешалку для растворения Triton X-100. Наполните бутылку с дистиллированной водой. до общего объема 1000 мл не будет достигнута.
    2. 1% Тритон Х-100
      1. Добавить 100 мл исходного раствора (10%) с бутылкой на 1000 мл. Добавить 900 мл дистиллированной воды. и встряхнуть бутылку в два раза. Фильтр 1% раствора Triton X-100 через стерильный фильтр.
    3. 10% SDS маточного раствора
      1. Заполните 1000 мл флакон с 900 мл дистиллированной воды. и добавить 66,99 г SDS (99,9%, плотность 0,67). Используйте мешалку для растворения SDS. Наполните бутылку с дистиллированной водой. до общего объема 1000 мл не будет достигнута.
    4. 1% ДСН
      1. Добавить 100 мл исходного раствора (10%) в 1000 мл роботаTLE. Добавить 900 мл дистиллированной воды. и встряхнуть бутылку в два раза. Фильтр 1% раствора SDS через стерильный фильтр.

    3. Decellularization

    1. Настройка перфузии устройство figure-protocol-1

    Рисунок 1:. Схема перфузии устройство для селективного артериальной и венозной перфузии Portal Четырех печени крыс при колебательных условиях давления (. Редактировался Struecker др 14)

    1. Ссылка на утечку в трехходовым краном и расширением Heidelberger регулирования уровня заполнения и заполнить реактор 500 мл 0,9% NaCl.
      figure-protocol-2

    Рисунок 2:. Схема перфузии настройке Ссылка на перфузии камеры (1) (1400 см 3) к дальнему концу (4) пузырьковой ловушки (5) через воротной вены доступа (2) или с помощью артериального переменногопроцесса (3). Пузырь ловушку (5) должен быть оснащен обтурации (4) на дистальном конце и отверстием (6). Подключите пузырь ловушку (5) расширение Heidelberger (7). Ссылка на расширение Heidelberger к насосу сегменте (8). Кроме того, подключить насос сегмент (8) на другой добавочный Heidelberger (9). Вставьте последний Heidelberger расширение (9) в бутылку моющего раствора (10). Подключение респиратор (11) к перфузионной камеры (или к распределителю давления в случае нескольких перфузии). Для слива жидкости реакторных подключите отток в бутылке отходов (12).

    1. Вставьте насос сегмент в насос. Для включения насоса для заполнения цикл с PBS, закрыть дистальный конец пузыря ловушку и открыть вентиль. Когда нижняя часть пузыря надежно покрыты PBS (2-3 см), закрыть отверстие и открыть дистальный конец пузыря ловушку.
    2. Установка печени
      1. Ссылка трехходовой кран воротной вены канюлю соответствующего доступа реактора. Ски подключить артериальной канюлей к артериальной доступа. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что воздух не поступает в системы.
    3. Применение колебательных Условия Давление
      1. Использовать респиратор с частотой 15 ударов в минуту и ​​амплитудой 26 мбар (мин. 4 мбар, макс. 30 мбар). Подключение респиратор с распределением давления в камере и подключить камеру в реактор. Запуск приложения давления.
    4. Decellularization протокол
      1. Выполнение шагов перфузии со скоростью потока 5 мл / мин. Начало decellularization с перфузии печени с 1% Тритон Х-100 в течение 90 мин. Разрешить отходов эффлюента через отток перфузионной устройства, чтобы уровень жидкости внутри постоянной перфузии камеры и выше перфузии печени. Через 90 мин изменить моющего средства 1% SDS.
        figure-protocol-3
        figure-protocol-4
    <р> Рисунок 3: перфузии протокола для всех экспериментальных групп.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Однородность и, таким образом, эффективность различных протоколов decellularization были оценены макроскопическим наблюдением, гистологического анализа и анализа остаточным содержанием ДНК в decellularized матриц печени. Кроме того, коррозия литье с целью визуализации нетронутыми микроанатомии из печени после decellularization.

    Макроскопии

    Во decellularization, печень становится Lucent, указывающий удаление клеточного содержимого. Печень перфузии через воротную в...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Хотя представлены техника для уборки печени крысы и decellularization легко воспроизводимым, есть определенные критические шаги, чтобы рассмотреть:

    В ходе подготовки к заготовке печени, важно, чтобы избежать кровотечение, потому что он активирует свертывание крови и может привести к образованию тромба в печени. На наш взгляд, это выгодно надрезать брюшной аорты непосредственно перед тем катетеризации воротной вены, чтобы избежать притока крови через печеночную артерию при перфузии через сист...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы хотели бы выразить благодарность Штеффену Липперту, Халиду Алиеву, Коринне Йёренс и Катарине Струкер за их помощь во время этого проекта.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Самостоятельно построенная артериальная канюля
      Portex Нестерильная полиэтиленовая трубкаSIMS PortexREF 800/110/1000,28 мм ID 0,61 мм OD
      Portex Нестерильная полиэтиленовая трубкаSIMS PortexREF 800/110/2000,58 мм ID 0,96 мм
    OD Venodrop Безопасный катетер-бабочкаFresenius Kabi327585121 G
    канюля для воротной вены
    Периферический венозный катетерBD393224BD Venflon Pro 20G
    Трехходовой стоп-кранsmiths медицинский888-101RE
    ватные палочкиHecht-Assistent4302
    ватные диски Шаосин Чжэндэ Хирургическая повязка13H118-03
    Марлевая повязкаХубэй Хайгэ  Медицинские инструменты14388
      Ringer SolutionFresenius Kabi13 HKP0221000 мл
    10 мл ШприцBraun4606108V10 мл/ Luer Solo
    5 мл ШприцBraun4606061V5 мл /Luer Solo
    Шовный материал (Шелк 6/0)ResorbaH1FLOT 105001.81
    медицинская простыняShaoxing Zhengde Хирургическая повязкаD0613011
    surgical инструменты
    иглодержательGeuder17570
    микрощипцыInox-Electronic91150-20
    микроножницыMartin11-740-11
    микрощипцыS& Т 
    ЗажимЭскулапBH111R
    ножницыF S T 14501-14
    хирургический щипцыAesculapBD 557
    Децеллюляризация
    РеспираторResmed14.24.11.0004SmartAIR ST
    перфузионное устройствоCharite, медицинская инженерная лабораторияизготовленное на заказ устройстводецеллюляризации
    перистальтического насоса ismatec reglo ICCIDEXISM4408 4-канальный
    Удлинитель Heidelberger 75 см Fresenius Kabi287375 см
    MS/CA насос-сегментIDEXIS 3510 MS/CA/click'n'go/POM-C
    CA 2-стопорная трубкаPharmedBPT NSF-51
    ловушка для пузырьков изготовленный на заказ товар
    соединитель шланга Luer LockNeolabNo 02-1887
    Моющие средства
    SDS пеллетыCarl Roth CN30.4 2,5 кг
    Triton X-100Карл Рот 3051.1 10 л
    ПБС Gibco14190-094DPBS
    окрашивание
    Eosin 1%Morphisto10177
    Mayer гематоксилинAppliChemA4840
    окрашивание гомориMorphisto11104
    AlcainBlue-PAS окрашиваниеMorphisto11388
    Direct Red 80 Сигма Олдрич365548
    <td colspan="4">хирургические112314

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
    2. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
    3. Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
    4. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
    5. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
    6. Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
    7. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
    8. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
    9. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
    10. De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
    11. Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
    12. Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
    13. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
    14. Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
    15. Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Triton X 100SDS

    Похожие статьи