Микрожидком Платформа Точность Малый объем пробы обработке и использовании в биологических Размер Отдельные частиц с акустической микроустройство

Summary

Этот протокол описывает архитектуру системы для выполнения автоматизированного разделения частиц малого объема (0,15–1,5 мл) с использованием микрофлюидного устройства, а также обсуждает методы оптимизации производительности и работы акустофлюидного устройства.

Abstract

Основным преимуществом является микрожидкостных устройств способность манипулировать малые объемы проб, тем самым уменьшая реагента отходов и сохранить драгоценный образец. Тем не менее, для достижения надежной манипуляции образца необходимо обратиться интеграцию устройств с макромасштабном среды. Для реализации повторяемые, чувствительный разделение частиц с микрофлюидных устройств, этот протокол представляет полный автоматизированный и интегрированный микрожидкостных платформу, которая позволяет точно обработку 0.15-1.5 мл образцов с использованием микрожидкостных устройств. Важные аспекты этой системы относятся макет модульное устройство и надежные приборы результате в надежного и гибкого мире чип соединений, и полностью автоматизированную обработку жидкости, которая завершала отбор проб с замкнутым контуром, уборка системы и грунтовки меры для обеспечения повторяемые операции. Различные микрофлюидальные устройства могут быть использованы взаимозаменяемо с этой архитектуры. Здесь мы включаем в acoustofluidic устройство, подробно его characterizвания, оптимизации производительности, а также продемонстрировать его использование для размера сепарации биологических образцов. С помощью обратной связи в режиме реального времени во время экспериментов по выделению, сбор образцов оптимизирован для сохранения и сосредоточиться образца. Несмотря на то, требующих интеграции нескольких единиц оборудования, преимущества этой архитектуры включают в себя возможность обработки неизвестных образцов без дополнительной оптимизации системы, легкость замены устройств и точный, надежный обработки образца.

Introduction

Разделение образца и фракционирования является одним из наиболее перспективных областей применения для микрофлюидных технологий. Такие шаги подготовки пробы являются неотъемлемой эффективных клинической диагностики, терапевтического развития, усилия биомониторингу, и прогресс в области наук о жизни исследований и технологий. Несметное микрофлюидных стратегии разделения были продемонстрированы жидкостью взвешенных частиц и коллоидов, а также для химических и биологических видов; несколько обзоров дается обзор недавних прогрессе и событиях в этих областях ^{1 - 9.} Хотя многие из этих микрофлюидных технологий разделения (далее именуемые «Основные устройства") были широко охарактеризованы, несколько докладов считаются проблема разделения образца на системном уровне. Базовые устройства, как правило, отдельные сантиметрового масштаба фишки, сопряженные с фторполимерной трубки, с жидкости, подаваемой смещение или давления насоса.Тем не менее, если обещание микрофлюидики - включая увеличение автоматизации, надежности и снижение объемов выборки - это стало реальностью, по крайней мере, эквивалентный усилия должны быть направлены на проектирование полного разделения системы, в которую Основной устройство интегрировано ,

Кроме того, серьезной проблемой для микрофлюидных подходов к biodetection макрос для микро-интерфейс. Это относится не только к физическим "Мир-в-чипе" связей микрожидком устройства к макромасштабных компонентов и несоответствие между типичными объемов клинических или аналитический образец (~ 0,1-10 мл) и внутреннего объема микрофлюидных чипов (~ 0,01-10 мкл), но также статистических ограничений, вытекающих из выборки преодоления этих размеров весы. Эти вопросы способствуют восприятию, что образец предварительной обработки и подготовки являются "слабым звеном" в biodetection. ¹⁰ Платформа описанной в этой работе таKES основные шаги в направлении решения этих проблем.

Принимая вид на системном уровне, этот протокол детализирует надежную обработку точно отмеренных объемов-аналитическая масштаба (начиная от 0,15 до 1,5 мл) на ~ 10-минутных временных масштабах. Это операция "одной кнопкой": как только источник флакон, содержащий образец и назначения флаконов для сбора фракции размещаются в систему, команда "Выполнить" инициирует процедуру, и все шаги, контролируется компьютером. В конце прогона, флаконы для сбора может быть удален из системы для последующего анализа разделенных фракций.

Ядро устройства в этой системе является чип acoustophoresis который извлекает млекопитающих частиц (5-20 мкм) клетки размером от образца. Acoustophoretic разделение выбрали здесь, прежде всего, потому что это с высокой пропускной (до 100е мкл / мин), этикетки-бесплатно, и бесконтактные, таким образом предлагая преимущества в разделении жизнеспособной ViruSES из клеток, что несколько других микрофлюидных методы могут совпадать. Физика акустической частицы фокусировки были подробно описаны, ^{11 - 13 и} не являются предметом данного протокола, но краткое изложение основных концепций следует помочь в понимании приложение к микрожидкостных разделения.

Ультразвуковые стоячие волны резонирующие в заполненных жидкостью микроканалов производить поля давления, которые порождают силы, которые управляют частицы к узлам низкого давления. Сила величина зависит от объема частицы, а на акустической коэффициент контрастности, полученной из относительных плотностей и сжимаемости частицы и суспендирующей жидкости. ¹⁴ По существу, акустические фокусировки идеально подходит для разделения клеток размера (~ 7-15 мкм) от вирусных размера (~ 50-200 нм) частиц. Более крупные частицы мигрируют в сторону узла давления; Однако, так как сила величины очень малы дляЧастицы менее 2-3 мкм, Эти мелкие частицы, растворенные или видов вряд ли двигаться вообще. Наша конкретная реализация акустического разделения, как описано выше, включает в себя ¹⁵ тонкую стенку разделить канал жидкости и позволяет перестраиваемый асимметричный размещение положении фокусировки. Это добавляет гибкости в конструкции прибора, и производительность преимущества, в том числе повышения качества разделения и скорости-полностью описаны в другом месте. ^16,17

Тем не менее, одним из основных преимуществ проектного подхода на уровне системы, описанной в данной работе является то, что адаптируется к большим разнообразием микрофлюидных основных узлов. Например, большинство других режимов разделения непрерывного потока, в том числе инерциальной, поток поля фракционирования, детерминированной бокового смещения (DLD), и различных типов электрокинетических устройств могут быть легко включены, с соответствующими корректировками сделал для учета изменений в конфигурации на входе / выходе , расход,и образец тома. Устройства с различными типами на-чипе полей (электрических, магнитных) или градиентов (тепловые, химические) могут потребоваться дополнительные соединения с чипом, или интеграции дополнительного оборудования, который вмещает эта платформа.

Этот протокол обеспечивает шаги, необходимые для разработки микрожидкостных устройство разделения, и для изготовления кремния стеклянных осколков глубокой реактивного ионного травления (DRIE, процесс плазменной травления доступные во многих учреждениях микроструктур, который использует чередующихся циклов травления и пассивации, чтобы достичь глубокого функции с вертикальным боковым стенкам ^18). Далее, мы опишем характеристику acoustofluidic устройства, чтобы определить оптимальные параметры работы отделения и, наконец, подробно полностью интегрированная система сепарации, а также порядок обработки биологических образцов. Типичные результаты характеристика устройства и обработка данных выборки затем представлены и обсуждены, и ключевые преимущества этого утверждения предметовACH выделены, в том числе модульность, надежность, точность и автоматизации.

Protocol

1. Acoustophoretic Дизайн устройства и Photomask Макет

ПРИМЕЧАНИЕ: Общие соображения и рекомендации для проектирования процесса микротехнологий и макет маски можно найти в текстах на микротехнологий и учебники дизайна фотошаблона ^{19 - 21.}

1. Выложите Маска 1, жидкостный слой (лицевая сторона), с использованием соответствующего программного обеспечения CAD. Выбрать геометрию, которая позволяет вводимого образца и разделение подходящую для требуемого применения.
   1. Для акустической фокусировки, установите струйный ширину канала W, чтобы обеспечить резонансную частоту _F N больше, чем 1 МГц в соответствии с уравнением _F N = пс / 2w, где с скорость звука в соответствующем жидкости и п число стоячих волн узлов (например, для широкого канала 900 мкм, двух- узел резонанс ожидается на _F 2 = 1,65 МГц).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ЧастицаS занимая различные позиции боковые ближе к концу канала разделения должны выйти из различных точек. В этом протоколе, частицы отделяются от размера, так что выходы обозначены SPO и LPO, при малых частиц и выхода крупных частиц, соответственно, как показано на рисунке 1.
   2. Установите длину канала для жидкости, чтобы управлять длина частиц времени подвергаются области разделения на определенной скорости потока. Более на чип время пребывания частицы мигрировать из-за разделения сил должно быть проданы с учетом увеличения требуемого чипа след.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В наших акустических устройств, направленных, канал потока делает три прохода вниз обломок для увеличения времени пребывания (рис 2а). В типичной общей скорости потока 200 мкл / мин, частиц, проходящих через 300 х 200 мкм поперечного сечения, 117 мм длиной канала разделения проводят в среднем 2,1 сек в акустическом поле.
2. Включить жидкостных порты в маске Layoут для подключения к стандартной трубки расположены на стандартизованный сетки (5 мм поле). Включить соответствующие координатные метки для выравнивания масок друг к другу во время изготовления и перетасовки отдельных устройств.
3. Выложите Маска 2, Via Layer (задняя сторона), которая включает в себя только жидкостных порты. Включить координатных меток для выравнивания, чтобы маска 1.

Рисунок 1. Acoustofluidic устройств. Схема эскизы архитектуры acoustophoretic устройства. (А) Вид сверху, показано общую конфигурацию H-фильтра (не в масштабе). (Б) Схема поперечного сечения канала в месте, отмеченного черным пунктирная линия в пункте (а), показывающий поле давления (синий пунктирные линии), и чувство акустических первичных сил излучения (PRF), которые управляют частиц к узловые плоскости (красные стрелки). Поперечное сечение канала900 × 200 мкм со стеной приблизительно 10 мкм, разделяющей основной (300 мкм) и широкой обводных каналов. (С) 3D представление разделения частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. чистых помещений Изготовление микрофлюидных чипы для Acoustophoresis

1. Шаблон задней стороны порты жидкость, используя маску 2 на двойной стороне полированный 0,5 мм толщиной, 100-мм диаметр <100> кремниевой пластины с помощью стандартного положительно противостоять фотолитографии. Etch этот геометрии глубокой реактивного ионного травления (DRIE) на глубину 350-400 мкм.
2. Включите пластины над и геометрии канала шаблон передней стороне жидкости с помощью маски 1 по стандартным положительно противостоять фотолитографии на другой стороне кремния. Затем установите пластину устройства на второй (пустой) кремния пластины несущей с помощью фоторезиста.
3. Протравить каналов, также DRIE, на глубину 200 мкм, через травления кремния в местах порта (пластина несущей защищает поверхность инструмента DRIE). Де-крепление пластины устройства от пустой кремниевой пластины путем замачивания в устоять зачистки решение.
4. Очистить пластины устройства и невыразительную 0,5 мм толщиной из боросиликатного стекла пластины с использованием раствора серной Piranha (кислоту и перекись водорода в соотношении 3: 1).
5. Печать проточных каналов по анодно склеивания стекла и кремниевых пластин с использованием следующих параметров: давления в камере при 3 мторр, давление поршня на 1000 N, температура в 350 ° C, и не применять 750 V до ток падает ниже 0,2 мА.
6. Разрежьте отдельные чипы, кроме с алмазным лезвием для резки на чипы на пиле.

3. Окончательный Устройство Ассамблея

1. Приложение пьезоэлектрический преобразователь
   Примечание: Ультразвук генерируется в микрожидкостных чипа пьезокерамического преобразователя в прикрепленной к стороне кремния.
   1. От вWO-компонента с низкой вязкостью эпоксидной комплект, взвесить рекомендуемое соотношение обоих компонентов и смешать их полностью.
   2. Разлить смесь эпоксидной с пипеткой и равномерно через цирконат-титанат свинца (ЦТС) пьезокерамики создать тонкий слой, даже (примерно 10 мкл смеси эпоксидной для пьезоэлектрического с размерами 37,5 × 10 × 0,5 мм).
   3. С помощью подходящего джигу или приспособление, совместите эпоксидной сторону пьезокерамики с микрожидкостных чипа, обеспечивая нависающий участок на одной стороне для последующего присоединения проводов (рис 2а), и принести двух компонентов в контакт. Зажмите узел в тисках, заботясь, чтобы не треснуть любого из компонентов, и вылечить при температуре и продолжительности рекомендованной эпоксидной производителем.
   4. После эпоксидной вылечил, приложите тонкую проволока приводит к каждой стороне пьезокерамики, пайкой с тонкой наконечником паяльника, делая как можно более короткое контакт с пьезо, чтобы избежать тhermally де-поляризационный его. В качестве альтернативы, используйте проводящий клей для склеивания провода к пьезо.

Рисунок 2. Жидкостная Макет, Чип Монтаж и Всемирный к Chip Интерфейс. Фото (с) акустической микрожидкостных чипа (внешние размеры 70 × 9 × 1 мм) с прикрепленными проволочных выводов пьезоэлектрический преобразователь, показывая три прохода разделения канал вниз чипа, (б) обычай струйные винтовые фитинги и обработанные компоненты трубки для интерфейса чип-на-мире, (C) чип, установленный на нижней стороне текучей плате с использованием зажимные приспособления, охватывая отверстие в плате, чтобы вентилятор охлаждения, (d) вид сверху плате с прикрепленными соединений труб и охлаждающего вентилятора, и (е) в разрезе схема винтов арматуры что интерфейс Tubiнг с установленными микрожидкостных чипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Устройство Монтаж и мира до стружки Interfacing
   1. Прикрепите чип на плате »текучей" (пластинка с сеткой регулярно интервал резьбой через отверстия), используя зажимные приспособления. Прикрепите охлаждающий вентилятор к плате регулировать температуру во время акустических экспериментов (см рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа без охлаждающего вентилятора при типичных напряжениях привода повышает температуру устройства для 70-80 ° С. Это значительно сдвигает резонансную частоту из-за измененного скорости звука в жидкости, и может негативно повлиять на жизнеспособность любых биологических частиц, которые были обработаны.
   2. Винт в чип-в-мире разъемов, описано ранее в другом месте ^{22 и} показано на рисунке 2. Регистрация Их яnterface трубки к дополнительной трубки на входах и выходах, использующие стандарт ¼ "-28 союзы для 1/16" трубки.

4. Характеристика акустической характеристики фокусировки

ПРИМЕЧАНИЕ: Системные компоненты, необходимые для акустической фокусировки характеристики группируются в список материалов. Шаги 4.1 и 4.2 ниже, применяются к любому Основной Устройства, используемого с этой платформой, в то время как последующие шаги описывают операции, характерные для acoustofluidic устройства обсуждаемой здесь.

1. Конфигурация системы
   1. Соберите микрожидкостных чип, используя всемирно к микросхеме соединений на плате жидкостной, как описано в разделе 3. Убедитесь соединений с помощью трубок (например, 1/16 "диаметр труб наружный Фторполимер) в жидкости насоса и сбора флаконов. Установите плате сборки на этапе микроскопа, способного флуоресценции изображений, оснащенного ПЗС-камеры.
   2. Подключите длины малого внутреннего diameteг (ID) трубки (0,006 "рекомендуется) сразу после чипа (см рис 4) в качестве ограничителей потока, которые стабилизируют систему и контроля расщепление потока между выходами микросхем. Используйте большие трубы ID, такие как 0,01 или 0,03 "", для всех других соединений.
      1. Оцените гидродинамического сопротивления потока _R H каждой части трубки с длиной L и диаметром D внутренней используя уравнение R _{H =} 128 мкл / πD ^{4, где} μ является динамическая вязкость жидкости в. Перепад давления Δ Р-за каждой длины труб под данной скорости потока Q задается Δ P = QR _ч.
      2. Выберите соотношение длин ограничителя, чтобы разделить поток между выходами, которые необходимы для разделения метод используется. Оптимальное разделение с акустическими чипов в этом протоколе требует SPO: соотношение ПОЛ потока приближенииДЕТАЛЬ 65: 35%.
      3. Выбрать длину ограничителей потока на выходе, так что их сопротивление текучей крайней мере в 3-4 раза больше, чем общее сопротивление в остальной части системы (соответственно подведены последовательно или параллельно). Для acoustophoresis устройства, используемого в данной работе, длины шлангов 35 и 65 см для ПОЛ и SPO подходят.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание должно быть уделено R _ч любого микрожидкостных Основной устройства. Для нашей акустической фокусировки чип в этой работе, _R H является низким из-за его относительно большие размеры канала, так что подключенные сопротивления трубки легко превысить его. Для устройств с меньшими размерами каналов, сопротивление чипа может преобладать в трубки системы, в этом случае дизайн и контроль на чипе канала R _ч является дополнительным фактором в шаге 1 этого протокола. Подробные принципы и руководящие дизайн доступны в литературе. ^23,24
2. Проверка системы
   1. Проверьте утечки, чтобы убедиться, что устройство Микрожидкостных не имеет дефектов, и все соединения труб уплотнены. Разливают воду через впускные трубы по мере необходимости с помощью шприца и контролировать любой жидкости протекать в основном канале.
   2. Не включать известный объем через чип, и измеряют объемы собранных из точек, чтобы обеспечить, что отношение потока, как ожидалось. Отклонения от ожидаемого объемном соотношении может указывать завалов в одной из торговых точек или утечки соединений.
      1. Для поддержания чистоты и предотвращения системного засорения флеш всю систему (жидкостный труб и чип) с соответствующими чистящими растворами (например, отбеливатель, этанол, вода) до и после выполнения каких-либо экспериментов.
      2. В случае сабо или завалов в одной из торговых точек, промойте систему в то время как подключить четкое выход, чтобы очистить блокировку. Если это не удается, изменить направление потока при промывке,возможно, нанесение быстрые импульсы обратного потока (используя вручную приводом шприца). Наконец, если засорение до сих пор не могут быть удалены, следует заменить или чип, при необходимости.
3. Частота сканирования Настройка для акустической фокусировки
   1. Заполните обводной канал (рисунок 1) с жидкостью, например деионизированной воды, этанол или фосфатным буферным раствором (PBS) путем ручного введения с помощью шприца. Обратите внимание, что эта жидкость не вступает в контакт с образцом обрабатывается. Детали регулировки положения узла с использованием различных жидкостей обходные описаны в другом месте ^16,17. Вкратце, если узел должен быть ближе к разделительной стенкой, использовать меньше плотности жидкости перепускной, таком как этанол; для размещения узла ближе к образца входного потока, выбрать более плотную жидкость, такую ​​как раствора глицерина.
   2. Сделать шарик раствор приблизительно 0,01% (вес / объем) 5-8 мкм флуоресцентные полимерные гранулы суспендировали в буфере PBS, таких как с0,05% твин-20 и заполнить образец входной шприц с раствором борта. Заполните впускной буфера шприц с тем же самым буфером (это не нужно быть таким же, как и в жидкости обводного канала). Отметим, что в целом, буфер выбран в соответствии с приложением (см Шаг 5.1).
   3. С текучей плате на столике микроскопа, фокус примерно на полпути в глубину канала в прямой области канала непосредственно перед выходом с в обоих каналах (разделение и байпас) в поле зрения. Дополнительный косой угол внешним источником света может потребоваться, чтобы стенки каналов видно, для успешного постобработки данных изображения.
4. Автоматизированная Частота сканирования и захвата изображения
   1. Сделайте электрические соединения, используя экранированные кабели (например, RG-58, оснащенные разъемами BNC) к функции генератора с частотой (ВЧ) усилитель доставить сигнал возбуждения в преобразователь пьезо. При желании, подключить осциллограф квыход функционального генератора для контроля фактического напряжения, подаваемого на преобразователь.
   2. Включите охлаждающего вентилятора, и установить генератор функций, таких, что выход на радиочастотный усилитель к преобразователю пьезо в диапазоне 12-25 вольт пик-пик _(п-п).
   3. Установите оба шприцы той же скорости потока между 50 и 200 мкл / мин. Использование одного шприцевой насос для привода обоих шприцев с тем же двигателем рекомендуется, чтобы минимизировать возмущения в поток.
   4. Выполните процедуру сканирования частоты, указав начальную и конечную частоты, размер шага между частотными значениями, а пьезоприводу напряжения с помощью автоматизации инструментарий лаборатории, такие как National Instruments LabVIEW.
   5. На каждом шаге частоты, применить напряжение в течение 15 секунд, чтобы позволить системе, чтобы уравновесить, то захват 10 изображений бус, проходящих через чип для последующего анализа (время экспозиции от 10 до 100 мс, рекомендуется).
   6. Между еACH применяется частотный шаг, выключите напряжение примерно 20 сек, чтобы шарики распространять равномерно по каналу и удалить уклон в сосредоточении от ранее применяемого шага частоты.
5. Анализ изображений для определения резонансной частоты и положение фокусировки
   1. Запустите сценарий анализа изображений (например, сценарий AF_freqScanPlotter.m MATLAB, поставленного с данным протокола) и введите необходимую информацию в подсказок: выберите список файлов изображений, генерируемых в шаге 4.4, введите Начать сканирование и остановить частоты и размер шага, полная ширина канала, расположение стены, и, наконец, выберите регион на изображение, чтобы проанализировать, в том числе как разделение и обводных каналов.
   2. Соблюдайте средней сценарий анализа набор изображений, снятых на каждом шаге частоты, и средние значения интенсивности вдоль направления потока. Это приводит к поперечной линии сканирования интенсивности флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: частота, соответствующая ВЫСО ул интенсивность определяется как резонансной частоты (рис 3, средний ряд), и положением в канале, где самая высокая интенсивность происходит это положение фокусировки (фиг.3, нижний ряд).

Рисунок 3. Представитель сканирование частот. Пример данных частоты развертки для хорошо сочетании (А) и слабо связанной (B) и пьезо чипа. Верхний ряд: интенсивность флуоресценции из бисера (красный представляет высокий, и синий представляет низкой интенсивности). Средний ряд: максимальная интенсивность на каждой частоте. Нижний ряд: расположение максимальной интенсивностью, где красная пунктирная линия указывает прогнозируемого фокусировки позицию, и красные алмазы показывают резонансную частоту, как определяется максимальной интенсивности.г "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

5. Автоматизированная Разделение

ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная эксперимент разделения запустить, чтобы отделить крупные частицы от мелких частиц из-за размера зависит от акустических фокусировки сил, приложенных в микрожидкостных чипа. Необходимые компоненты системы объединены в список материалов.

1. Конфигурация системы и подготовки проб
   1. Подключите микрожидкостных чип в шприцевой насос, мульти-порт с компьютерным управлением отбора клапаны, ПК-интерфейсом расходомеры, и трубки, как показано на рисунке 4. Эта конфигурация позволяет автоматизировать обработку образцов через микрожидкостных чип разделения, а также автоматизированное очистки шаги между экспериментами, чтобы удалить перекрестное загрязнение и образец унос.
   2. Использование буфера выборок, пригодных для клеток или частиц должны быть разделены, или в соответствии с требованиями к пробирного анализаиспользоваться после разделения. Как и на шаге 4.3.2, буфер восстановления (но не обязательно байпас жидкости) должно совпадать с образца текучей среды.
      Примечание: Любые водные буферы, обычно используемые в биологических образцах (например, PBS) имеют акустические свойства, подобные воде и не будет заметно изменить характеристики акустического устройства. Использование образцов жидкостей с плотностью и вязкостью, значительно отличающейся от воды можно, но рекомендуется только для операторов с большим опытом acoustophoresis.

Рисунок 4. Конфигурация системы Акустическая для автоматизированных экспериментов по выделению. Синие линии проследить путь главного потока через систему. Все зеленые и черные линии 0,03 "Внутренний диаметр (ID) трубы, и все синие и серые цвета линии 0.01" ID трубки с еxception холдинга катушек, которые 0.03 "ID, и ограничители расхода, которые 0,006" ID. Шприцы заполнены буфера и холдинговые катушки имеют достаточный объем (550 мкл), чтобы предотвратить поглощение каких-либо образцов или реагентов для очистки в шприцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Порядок разделения
   1. Состояние предварительного запуска. Перед запуском разделение, гарантировать, что очистка реагентов резервуары (отбеливатель, этанол, буфер) имеют достаточную жидкость, резервуары для отходов, не полностью, а жидкость линии грунтовкой (т.е., наполненный раствором). Если последнее условие является неопределенным, или если система в настоящее время работают в первый раз после холостого хода (например, в первый раз в определенный день), запустить автоматическую процедуру очистки (см Шаг 5.3 ниже). Установите клапаны 3 и 4 на выходах микросхем течь тратить ResErvoirs первоначально.
   2. Включите вентилятор охлаждения, и установите функцию генератора на резонансной частоте для акустической чип используется, как определено на этапе 4.5. Отрегулируйте уставки напряжения на генераторе функции, так что усилитель РФ выходы между 12 и 25 V _PP, как подходит для требуемого разделения.
   3. Подключите входная выборка флакон, флакон входной буфер, и соответствующие флаконы сбора к системе. Просто перед установкой образца входных флакон его пикап трубки, вихревые флакон кратко повторно приостанавливать любые частицы, которые могут быть урегулированы. Затем прикрепите флакон и инициировать процедуру разделения без промедления.
      ВНИМАНИЕ: Если образец для обработки содержит потенциально инфекционные агенты, флаконы должны быть такого типа, с завинчивающейся крышкой, чтобы сохранить герметичную систему и предотвратить образец аэрозолизацию. Кроме того, при работе с биологически опасными материалами, обрабатывать все флаконы и трубки при ношении необходимую защитную экипировку и с помощью REQuired управления опасности и процедуры для Группы биологического риска и уровня биобезопасности в зависимости от материала. Обратитесь институциональной политики и протоколов в случае любой неопределенности.
   4. Использование программы в лабораторной автоматизации инструментария для управления клапанами, датчиками расхода и насоса осуществлять полностью автоматическую процедуру разделения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура переключает клапаны, приводит шприцевой насос снятие и настой, и мониторы расходомер данные для правильного ГРМ сбор пример вывода фракций. Основные шаги приведены ниже в 5.2.4.1 5.2.4.3 через, как если бы выполняться вручную.
      1. Премьер-пикап трубки. Вывод примерно 15 мкл из пробы ввода флакона, чтобы полностью заполнить трубу, соединяющую его с Valve 1. Одновременно, премьер-трубка подключения входной буфер флакон клапан 2. Аналогичным образом, премьер впускной воздушный клапан 1 для того, чтобы это не содержит жидкости. Наконец, перейдем Клапаны 1 и 2, чтобы изгнать тратитьИзбыток жидкости или воздуха, который вошел в катушку загрузки.
      2. Загрузить образец катушки, как показано на фиг.5а. Типичная последовательность загрузки для обработки 250-мкл образец вывести 25 мкл воздуха при 50 мкл / мин, затем 250 мкл образца при 200 мкл / мин, с последующими 35 мкл ведущего буфера при 200 мкл / мин и, наконец, еще 25 мкл воздуха при 50 мкл / мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы и скорости потока по выбору пользователя. Следует отметить, что эта нагрузка последовательность в обратном порядке, как жидкость заглушки будет течь через устройство для разделения.
      3. Начните вливание образца. Установить шприцевые насосы влить загруженные пробки жидкости с желаемой скоростью (обычно 100 мкл / мин). Монитор скорости потока на SPO и ПОЛ с расходомерами, чтобы обеспечить поток устойчив и при соотношении, определенном на шаге 4.1, и что засорение не произошло.
      4. Соберите разделенных фракций. Когда датчики расхода обнаружить всплеск расхода, с указанием годовыхSsage первого воздушного зазора, включите соответствующий выходной клапан от отходов (где он в шаге 5.2.1) в пробирку для сбора образца.
      5. После прохождения образца от чипа, наблюдать Расходомер обнаружить второй воздушный зазор. На данный момент, переключиться выходные клапаны обратно в отходы. После полный объем загружен с шага 5.2.4.2 разливают, остановить вливание шприцевой насос, и прекращает процедуру автоматизации, когда скорость потока достигает нуля.
   5. После окончания эксперимента разделение завершится, отсоедините SPO и примеры ПОЛ сбора флаконов и хранить их надлежащим образом для последующего анализа.
3. Автоматизированная Очистка и обеззараживание
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед обработкой каждого образца, флеш и обеззараживания весь жидкостный систему, используя следующую процедуру автоматизированной.
   1. Закрепите SPO и ПОЛ коллекция флаконов трубы, а также образец пикап трубку в пустые флаконы для сбора избыточного чистящие что будут сброшены throuGH трубы.
   2. Начните процедуры автоматической очистки системы. Как и в автоматизированной процедуры разделения на шаге 5.2, программа должна управлять клапанами и шприцевой насос, чтобы последовательно загрузить удерживающую катушку с очистки реагентов и промывки их через систему.
   3. Выполните следующую процедуру очистки: на одном уровне с 10% хлорной, затем 70% -ным этанолом, и в конечном водой или соответствующим буфером физиологическим раствором (например, 1x PBS или буфер, используемый для обработки образцов). Используйте следующие объемы: флеш 450 мкл для отбеливателя и этанола, и 1000 мкл для воды / буфера.
   4. Во время промывки шагов, промыть каждого реагента в то время как SPO выпускной клапан ПОЛ установлен в порту, который блокируется, а затем наоборот, чтобы удалить любые потенциальные засорения в ограничители потока на выходе. Поддержание отмены и настой потока темпы 300-500 мкл / мин, чтобы минимизировать образование пузырьков в насосно-компрессорных труб и противодавления накопления, когда либо СПО или ПОЛ заблокирован.
   5. Discaий лишние промывке решения и флаконы, в которых они, собранные после проведения соответствующих процедур для обработки биологического или химического отходов.

Results

Основные особенности конструкции акустической-Микрожидкостных устройства выделены на рисунке 1, и полностью описаны в другом месте. ¹⁵ В кратком, потока два потока жидкости бок о бок в канале разделения, отделяется от параллельного канала байпаса тонкой кремниевой стене. Поскольку первичное излучение силой величина весы с объемом частиц, крупных частиц мигрировать из входного потока смешанного образца в направлении узла акустического давления, расположенного в смежном потока восстановления жидкости, в то время как мелкие частицы остаются в исходном потоке (Фиг.1В, С). Подразделенной архитектура двухканальный улучшает разделение частиц ¹⁷ и позволяет регулировку положения узла с помощью различных жидкостей обводной канал. ¹⁶ жидкостный макет и светильники обеспечивает надежную платформу для мира, чтобы чип связи, и модульный дизайн позволяет быстро изменение между струйных чипов (Рисунок 2). Это сonfiguration также позволяет обратимые жидкости соединения, которые уплотняют до 1000 фунтов на квадратный дюйм, чтобы быть быстро и надежно (2В, Е).

Резонансные частоты F _{разрешением} на чипе можно оценить с помощью простых 1D аналитических расчетов (см Шаг 1.1.1). С более полной 2D конечно-элементной модели нашего устройства поперечного сечения, ^16, ожидается, положение фокусировки для 2-узла резонанса 225 мкм от стены и ожидаемая частота 1,68 МГц является. Тем не менее, F _{разрешением} реальных устройств может варьироваться в пределах ± 100 кГц, в зависимости от рабочей температуры и сцепления продольных и поперечных резонансов. Таким образом, после сборки устройства, F _{разрешением} должны быть проверены эмпирически на соответствующих скоростей потоков и пьезоприводу напряжений, как описано в пункте 4 протокола. 3 показаны частотные представителем сканирования, принятые на 200 мкл / мин, с водой в основной и обводных каналов, и 20 В _п.п. подается на пьезоэлектрический. При соединении между пьезоэлементом и микрожидкостных устройства хорошо, частицы будут сосредоточены плотно на резонансной частоте, в результате чего четкого пика в интенсивности флуоресценции и миграции к ожидаемому фокусировки положении (фиг.3А). В противоположность этому, когда муфта плохое, частицы будут не нацелены также и результаты сканирования частоты будет похож на Фиг.3В. В таких устройствах, преобразователь пьезоэлектрический возможно, должны быть установлены повторно, если был использован реверсивный клей; в противном случае, это устройство является неподходящим, когда высокое качество фокусировки или быстрый поток имеет решающее значение для требуемого применения. Данные на фиг.3 информировать выбор рабочей частоты для последующих экспериментов, а напряжение и поток диапазон скорости, доступной для эффективного разделения частиц.

Файлы / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Автоматизированная обработка проб. (А) Схема образца, загруженного в образце катушки. (B), представитель профиль потока успешного эксперимента разделения. (С) профиля потока из отделения запуска, в течение которого на выходе СПО забиты приблизительно 220 сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После идентификации чипов, которые являются эффективными сепараторы, они включены в системе, показанной на рисунке 4. Общее Система рабочий объем минимизируется посредством трубки с 0,01 "внутреннего диаметра вдоль главного пути потока (синие линии). 5А иллюстрирует грим типичного образца вилки переплетаются через систему. Небольшое количество «ведущего буфера" (~ 35 мкл) требуется PRECEде образец в потоке, чтобы устранить колебания потока в то время как образец движется через чип разделения. 5В показана потока данных в результате успешного автоматизированного эксперимента акустического разделения. Ключевые особенности успешного запуска включают в себя: (1) кратковременное повышение скорости потока в обоих ПОЛ и SPO в давление строит и жидкость начинает течь через систему (2) резкий рост указывает прохождение воздушного пузыря (The Вставка показывает расширенную профиль одиночного пузырька), который должен достичь SPO перед ПОЛ за счет неравномерного потока от двух точек, (3) стабильный поток через обе точках между двумя воздушными пузырьками в качестве образца движется через систему, и (4) постепенное уменьшение скорости потока в обоих точках после полного объема образца поступает в систему. Проблемные работает сразу видно из профилей потока подобных 5С, где он появляется, что СПО стал забиты после примерно 220 секунд. В Тхи с случаем, процедура очистки аналогична описанной в пункте 5.3 должна быть запущена, чтобы прочистить канал.

Рисунок перестройки частоты 6. Устройство: Размер частиц и эффекты напряжения. Процент полистирола микросфер, выделенных в ПОЛ зависит от размера частиц и напряжения, подаваемого на пьезокерамики. Каждая строка соответствует различным рабочим напряжением на резонансной частоте, определяемой, как описано в шаге 4. Общий расход через устройство 200 мкл / мин, с прикладными частот приводных между 1,62 и 1,64 МГц. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение по крайней мере, трех отдельных экспериментов. Воспроизводится и изменены разрешения Королевского общества химии из http://pubs.rsc.org / EN / Содержание / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.цель = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 показывает результаты разделения составлен с использованием различных размеров полистирола частиц и пьезо вождения напряжения, демонстрирующие рабочие параметры, необходимые для эффективного разделения. В целом, более высокие напряжения (например, большие акустические сил) требуется, чтобы извлечь мелкие частицы, как и ожидалось. Напряжения Привод не может быть бесконечно увеличена, однако, из-за большей теплоотдачей и увеличения воздействия акустического течения. ¹³ Сюжет служит в качестве общего руководства для частиц размеров разделения частиц, которые показывают значительно отличается восстановление при напряжении конкретных привода (например, 10- и частицы 2-мкм в 8,8 V _PP) будет отделять хорошо. Как правило, население частиц с большой разницей в размере, например, вирусов (~ 100 нм) и клеток (~ 10 мкм) могут быть быстро и эффективно разделены, как может клетках Diffразмеры различны (например, 6-8 мкм дисковидные эритроциты и лейкоциты 8-15 мкм). Конкретные условия, необходимые для работы с другими типами клеток должны быть определены эмпирически, а формы клеток, плотности и сжимаемости влияет на его акустический контраст, в дополнение к размеру клеток. Для этого, процедуры в шаге 4 полезны для определения используемые условия разделения для любого нового элемента или частицы типа, а не только для оценки качества конкретного acoustophoresis устройства.

Рисунок 7. Разделение Эффективность сотовый Касперского с шипами образцов. Результаты разделения из (а) Raji клеток шипами с вирусом денге (DENV) и (В) Raji клеток и клеток почек Boa шипами с Golden Gate Касперского (GGV). Проценты, полученные определяются как доля вирусов или клеток, выходящих из конкретноговыходе по сравнению с общим количеством выходящего из чипа. Столбики ошибок для (а) стандартное отклонение 3 испытаний, в то время как образцы в (б) были обработаны только один раз из-за низких количествах, доступных. 1X PBS использовали в качестве буфера и восстановления образца жидкости, с водой в обводной канал для всех экспериментов. Чип рабочие частоты в диапазоне между 1,60 и 1,64 МГц, с приводными напряжений между 16 и 20 V _стр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы продемонстрировать полезность этой платформы для разделения биологических частиц, мы впервые использовали его для обработки хорошо изученными биологических образцов человека: Raji клеток (10 ⁵ клеток / мл, средний диаметр 8-10 мкм ²⁵⁾ с шипами вируса денге (DENV, 10 ⁵ БОЕ / мл, приблизительный диаметр 50 нм ^26). Рисунок 7А показывает процент Raji клеток и DENV собранных как в SPO и ПОЛ (определяется как доля каждого типа частиц, собранных из каждой розетки по сравнению с общей суммы каждой частицы, собранные от чипа). Эксперимент был повторен в трех экземплярах, и Raji клетки количественно с использованием счетчика Coulter с, в то время как DENV количественно с использованием обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (ОТ-КПЦР).

Далее, производительность системы была проверена в сценарии, что более реально для обработки клинических образцов, в которых точные физические характеристики частиц могут быть неизвестны, и доступные образцы величины ниже. Здесь мы оценивали разделение недавно идентифицированного вируса Золотые ворота (GGV), змея патоген, поражающие клетки почек удав. ²⁷ Размер вирусной частицы GGV еще не были измерены, но так ГГВ принадлежит к семейству Arenaviridae, это это всего имеетаналогичного размера, между 100 и 150 нм. ²⁸ Мы обработали образцы с GGV шипами (10 ⁴ БОЕ / мл) в Raji клеток человека (не целевых инфекция для вируса), и клеток удав почек (цели инфекции на GGV, приблизительный размер 10 ²⁷ мкм), с обоих типах клеток в 10 ⁴ клеток / мл. Поскольку эти образцы были доступны в небольших количествах, разлучение вытекает из только одного экспериментального запуска приведены в этой работе. 7В показывает процент клеток Raji, Boa клеток и ГГВ собраны из ПОФ и ПОЛ. Клетки количественно в этих экспериментах путем подсчета на гемацитометре и вирусы количественно RT-КПЦР.

Discussion

Этот протокол представляет интеграцию на уровне системы микрожидкостных устройств к макромасштабном оборудования для выполнения автоматизированной обработки биологической пробы. Модульность этой платформы позволяет быть адаптированы к любой непрерывной устройства потока, и, в качестве примера, представленный протокол фокусируется на характеристики и оптимизации производительности на acoustofluidic устройства для разделения частиц. Три основные преимущества этого протокола выделены: (я) модульность и чип-в-мире интерфейсов, (II) надежная характеристика работы устройства и (III) автоматизированная обработка точно дозированных объемов выборки для разделения частиц.

я. Модульность и чип-в-мире сопряжения

Как показано на рисунке 2, Микрожидкостных чип установлен на плате пользовательского легко помещается на столик микроскопа для непосредственного наблюдения. Макетная содержит # 6-40 UNF резьбовые отверстия на 5 мм шаг сетки, ENAпобрякушки чип быть обеспечено, и соединения жидкости, чтобы быть сделаны. Жидкость соединения PEEK трубки с обработанными концами, которые уплотняют против жидкостного чипа с резиновой лица уплотнения прокладки и втулка из нержавеющей стали. Эта схема интерфейса делает для легкой замены чипа и быстрого реконструкции устройств, требующих мало или каких-либо изменений в других компонентов системы, при условии, следы чип соответствовать формату сетки. Например, мы использовали эту платформу с микрофлюидных чипов для электрофореза непрерывного потока, лизис клеток, тепловой ²⁹ быстрого смешивания реагентов для химического синтеза, и захвата одноклеточного и допроса.

II. Прочная характеристика работы устройства

Для того, чтобы оптимизировать производительность любой микрожидкостных разделительного устройства, его работа должна быть сначала тщательно характеризуется. Описанная система здесь поддерживает развитие быстрых и автоматизированных протоколов, чтобы сделать это. Для конкретного exampле акустических фокусировки устройств, качество фокусировки, рабочей частоты и положения, ориентированных частиц в микрожидкостных канала должна быть измерена для каждого отдельного устройства. Эти измерения требуют радикальных через ряд пьезокерамический приводных частот, напряжений и скоростей потока, чтобы определить оптимальные комбинации параметра для разделения высокого качества. Представленный протокол автоматически изменяется эти настраиваемые параметры и захватывает соответствующий данные- т.е. флуоресцентные изображения частиц, проходящих в канале, которые после обработки для получения необходимых измерений частицы качество фокусировки, частоту и положение (рисунок 3).

Полное характеристика производительности акустическое устройство требует повторения шагов 4.4 и 4.5 в случае необходимости в различных экспериментальных условиях. Например, абсолютный положение фокусировки чипе находится выполнив частоты сканирования при относительно низких скоростях потока и высокого напряженияс для обеспечения полного перехода на месте узла. Кроме того, такая частота сканирования могут оценить качество сборки устройства (при запуске с полистирольных шариков известного размера), или определить, как ранее неизвестный тип частиц будет вести себя в системе (после чип характеризуется бисером). Чип с хорошей передачи энергии от пьезокерамики на микрожидкостных канала приведет к жесткой фокусировки при высоких скоростях потока (> 1 мл / мин) и низких напряжениях (12-15 В _п.п.), в то время как те, с плохой передачи энергии не будет уделять еще при низких скоростях потока (<100 мкл / мин) и высоких напряжений (> 20 В _п.п.). Мы обнаружили, что тесный контакт между микрожидкостных чипом и пьезокерамики является критическим для эффективной передачи энергии в жидкость. Дальнейшее исследование оптимального метода склеивания микрожидкостных чип и пьезокерамических позволит надежное производство устройств высокопроизводительных.

Наконец, полнаякартина эксплуатацию acoustophoretic устройства могут быть получены путем комбинирования изображения на основе измерений частоты развертки на шаге 4 (фиг.3) с числом частиц, собранных из ПОФ и ПОЛ как функции соответствующих рабочих параметров, от экспериментов по выделению, проведенных с микросферами , как описано в шаге 5. Как показано на фиг.6, такой ряд автоматизированных экспериментов может быстро характеризуют производительность отдельного устройства и перестройки частоты, информирующее пользователя оптимального пространства параметров для управления устройством для отделения частиц.

III. Автоматизированная обработка мелких образец для разделения частиц

Для успешного и точной микрожидкостных чип на основе обработки образца, важно, чтобы надежно и точно метр, нагрузка, доставить, и собирать объемы жидкости, как они проходят через. Эта точность особенно важно, когда объем выборки мал(~ 0,1-1 мл), который является общим в клинических или исследовательских лабораторных условиях. ³⁰ Точная обработка образца является сложной задачей в традиционных микрофлюидных экспериментов, которые используют ручной вывод образца в шприц и вливания в устройстве с без обратной связи, когда образец была отделена и когда он должен быть собран. Представленный протокол нанимает автоматизированная образец катушки нагрузки и дозировке в сочетании с обратной связью в режиме реального времени от датчиков расхода для того, чтобы воспроизводимые разделения малых объемов проб.

Рисунок 5 показывает профили потока, измеренные на SPO и ПОЛ от типичного эксперимента разделения. Во-первых, что приводит буфер, по крайней мере 35 мкл загружен, чтобы обеспечить стабильный поток, прежде чем образец достигает акустического чип. Примеры объемы меньше, чем 100 мкл не рекомендуется для данной конфигурации системы, потому что разведение образца в связи с ведущим буфера становится чрезмерным. Вилка воздуха используется в начале гое инъекции перед ведущим буфера для разделения образца вилку из жидкости, который следует, предотвращая смешивание и разбавление образца и выступающей в качестве индикатора к датчикам потока. После начального переходного качестве жидкости начинает движение через систему, острые сигналы шипованные у обоих выходов указывают прохождение первого воздушного пузыря. Эти переходные следуют длительного периода стабильного потока в образец протекает через систему, а затем еще шип, когда второй воздушный пузырь проходит, и, наконец, в конечном итоге снижение расхода до нуля после остановки шприцевой насос.

Прохождение пробки воздуха через расходомерами используется в качестве триггерных точек для переключения клапанов для запуска и остановки сбора проб, тем самым минимизируя потерянного образца и разбавление образца без объемов жидкости. Замкнутый контур дозирующего обработанных объемов образцов исключает необходимость перепрограммировать эти значения до начала эксперимента каждый раз, когда входная выборка изменяется. Эта функцияособенно важно, когда объем образца ограничен, например, в случае многих клинических образцов. Контроль потока в реальном времени также помогает в устранении неполадок; плохой запуск (например, забивают формирования в одной из торговых точек) сразу видно, из полученных профилей потока, как показано на рисунке 5б.

Чтобы продемонстрировать гибкость и эффективность acoustofluidic разделения, используя представленную архитектуру системы, очищенный DenV и вирусных запасы GGV вносили в акции клеток и разделены обработки через микрожидкостных чипа. 7а показывает, что Raji клетки хорошо отделяется от вирусов, а 97 % от Raji клеток, выходящих чип оказались в ЛПО, тем самым оставляя обогащенного образца DENV в SPO. Для сравнения, эффективность разделения DENV была ниже, с 70% DENV выхода чипа, найденный в SPO. Это может быть связано с небольшим конвективного перемешивания, вызванного витками separatiна канале, но, скорее всего, некоторые частицы DenV мигрирующих вместе с клетками Raji в ПОЛ. Клетки, мигрирующие поперек тока перетащите немного жидкости с ними, даже при низкой числа Рейнольдса. По этому механизму, а также неспецифической адсорбции на поверхности, вирусные частицы передачи в ПОЛ. Тем не менее, обогащенного образец DENV в SPO является существенным преимуществом, например, если заново последовательности используется для обнаружения и идентификации вирусов.

7, б показывает, что в одной экспериментальной перспективе, только около 70% от Boa клеток, выходящих из чипа были найдены в LPO, по сравнению с почти 100% эффективности сепарации для Raji клеток. Разница в производительности разделения между двумя типами клеток может быть связано с меньшим средним размером или меньшей плотностью Boa клеток по сравнению с клетками Raji, поэтому в результате меньших акустических сил. Чтобы подтвердить или опровергнуть эти предположения, размер, плотность и морфологию Boaклетки в суспензии (которые обычно растут приверженцем) Боа клеток должны быть точно измерена, усилия для дальнейшего расследования. В тех же экспериментах, аналогично экспериментах с DENV, основная часть извлеченного GGV выходе из SPO, что указывает на обогащение вирусной фракции.

Представленные данные подчеркивают присущие проблемы инженерных широко применяемых платформ-за обработки различных биологических образцов. Важно отметить, что биологические взаимодействия могут начать играть такой роли, как физических и механических воздействий. Тем не менее, эти предварительные эксперименты также продемонстрировать силу и перспективы использования этой архитектуры системы для обработки образцов в клинических и научно-исследовательских приложений. В прочном, хорошо характеризуется инженерно-технической системы, эта платформа обеспечивает возможность искать ответы на новые научные вопросы.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Материалы, необходимые для этапов 1-3: Проектирование, изготовление и сборка устройства
Двусторонняя полированная силиконовая пластина	Silicon Quest International, Inc. Сан-Хосе, Калифорния, США	100 мм < 100>  прайм-1-20	Ом-см, 495 ± 25  &микро; m Двухсторонняя полированная
стеклянная пластина	Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, США	100 ммx0,5 мм Boro
Photoresist, AZ 1518	MicroChemicals GmbH, Ульм, Германия	AZ 1518	Фоторезист, используемый для приклеивания пластины к заготовке пластины для травления DRIE
Фоторезист, AZ 4620	MicroChemicals GmbH, Ульм, Германия	AZ 4620	Фоторезист для определения жидкостных и сквозных шаблонов
маски DRIE плазменный травитель DRIE	STPS, Ньюпорт, Северная Каролина, Великобритания	Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP
system Wafer Bonder	Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Австрия	EVG 501
Пила для нарезки кубиками	Kulicke & Soffa Industries, Сингапур	K& S 982
Эпоксидный комплект	Эпоксидная технология, Биллерика, Массачусетс, США	EPO-TEK 301	используется для сопряжения пьезо- и микрофлюидного чипа
PZT пьезокерамический	Piezo Systems, Вобурн, Массачусетс, США	PSI-5A4E	37,5 × & 10 × 0,5 мм
28 AWG Однотонный провод с изоляцией из кинара	Squires Electronics, Cornelius, OR, США	UL1422
2-х компонентный серебряный эпоксидный	MG Chemicals, Суррей, Британская Колумбия, Канада	8331	Проводящий клей для крепления проводов к PZT
L-edit	Tanner EDA, Монровия, Калифорния, США	Ledit v15.1 64-битное	программное обеспечение САПР для компоновки
Материалы, необходимые для шага 4: Характеристика характеристик акустической фокусировки
Dual Pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, США	PHD ULTRA Series, 703007
5  ml шприцы	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США	309646
Luer to Резьбовой адаптер	IDEX, Oak Harbor, WA, США	P-659	Соединяет шприц с трубкой
Union	IDEX, Oak Harbor, WA, США	P-623	Соединяет мир с соединениями чипов с фторполимерными трубками. Также можно использовать webbed
Наконечник 1/4-28 плоскодонный	IDEX, Оук-Харбор, Вашингтон, США	P-200	Используется с гайкой для соединения между трубкой и шприцем, датчиками расхода и миром к чиповому оборудованию
Гайка   1/4-28 плоское дно	IDEX, Оук-Харбор, Вашингтон, США	P-202	Используется с наконечником для соединения между трубкой и шприцем, расходными сессорами и мировыми чипами оборудования
1/16" OD Фторполимерная трубка	IDEX, Оук-Харбор, Вашингтон, США	1912L	Трубка для подключения шприцевых насосов к миру к соединениям чипов.  Размер трубки не имеет решающего значения на этапах классификации (обычно используется внутренний диаметр .01-.03", другие подходящие номера деталей: 1907L, 1902L).
Фторполимерная трубка с малым внутренним диаметром	IDEX, Оук-Харбор, Вашингтон, США	1476-20	Используется для ограничителей потока: 0,006 дюйма ID, 1/16 дюйма OD FEP
Трубка			Соединяется от стружки к трубке из фторполимера.
Вентилятор охлаждения	Multicomp, Лидс, Англия	MC19663
Функциональный генератор	Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США	33220A Радиочастотный
усилитель	ENI, Рочестер, Нью-Йорк	325 LA	Должен иметь возможность усиления сигналов от < 1  V в диапазоне 1-2  МГц до 25  Vpp в пьезо.
ПЗС-камера	Фотометрия, Тукон, Аризона, США	CoolSnap HQ
Инвертированный микроскоп	Zeiss, Оберкохен, Германия	Axiovert S100
FITC Набор фильтров	Chroma Tech, VT, США	SP101
Objective, 10X	Zeiss, Оберкохен,	Германия ACHROPLAN
Осциллограф	Tektronix, Бивертон, Орегон, США	TDS3014B	Для мониторинга выходного напряжения радиочастотным усилителем
	MatLab Mathworks, Natick, MA, США	R2014a
Driver interface software для интеграции фотометрической камеры с	программным обеспечением LabVIEW R Cubed, Lawrenceville, NJ, США	SITK
Tween 20	Sigma Aldrich, Сент-Луси, Миссури, США	P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 или 7.32  &микро; m Beads	Bangs Laboratory, IN, США	FS06F
Дополнительные материалы, необходимые для шага 5: Автоматизированные сепарационные
многопортовые клапаны	VICI, Хьюстон, Техас, США	C25Z-3180EUHA	В текущей конфигурации необходимы 4 клапана
Датчики потока	Sensirion, Westlake Village, CA, США	SLI-1000
, .01 и .03" ID	IDEX, Дуб Харбор, Вашингтон, США	1902L и 1912L	Предпочтительная
гайка	, Хьюстон, Техас, США	ZN1PK-10	Используется с наконечником для соединения между трубками и клапанами. Альтернативные номера деталей: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule	VICI, Хьюстон, Техас, США	ZGF1PK-10	Используется с гайкой для выполнения соединений между трубками и клапанами.
LabVIEW	National Instruments, Остин, Техас, США	Система профессионального развития LabVIEW	Программное обеспечение для автоматизации лабораторий
PBS	Teknova, Hollister, CA, США	P0200
Raji Cells	ATTC, Манассас, Вирджиния, США	CCL86
Boa Cells			любезно предоставлено лабораторией DeRisi в UCSF
GGV			Любезно предоставлено лабораторией DeRisi в UCSF
DENV			Любезно предоставлено Хосе Пенья в LLNL
Coulter Counter Z2	Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США	Z2
	Fisher Scientific, Уолтман, Массачусетс, США	0267151B