Методическая статья

Двуствольное и Концентрические Микроэлектроды для измерения внеклеточной Ion сигналов в ткани головного мозга

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53058

⸱

5 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Departments of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Мы демонстрируем изготовление, калибровку и свойства двух типов ионоселективных микроэлектродов (двухцилиндровых и концентрических) для измерения концентраций ионов в тканях мозга. Затем они используются при приготовлении среза гиппокампа мыши, чтобы показать, что возбуждающая активность изменяет концентрацию как внеклеточного калия, так и натрия.

Аннотация

Электрическая активность в мозге сопровождается значительными потоками ионов через мембраны, что приводит к сложным изменениям внеклеточной концентрации всех основных ионов. Поскольку эти ионные сдвиги имеют значительные функциональные последствия, их количественное определение часто требуется для понимания функции и дисфункции нейронных сетей в физиологических и патофизиологических условиях. В настоящем исследовании мы демонстрируем изготовление и калибровку двухцилиндровых ионоселективных микроэлектродов, которые оказались отличными инструментами для таких измерений в тканях мозга. Кроме того, описаны так называемые «концентрические» ионоселективные микроэлектроды, которые, благодаря своей различной конструкции, обеспечивают гораздо лучшее временное разрешение быстрых изменений ионов. Затем мы покажем, как эти электроды могут быть использованы для подготовки острого среза мозга гиппокампа мыши. С помощью двуствольных калий-селективных микроэлектродов продемонстрировано изменение внеклеточной концентрации калия ([K+]o) в ответ на экзогенное применение агонистов глутаматных рецепторов или во время эпилептиформной активности. Кроме того, мы иллюстрируем характеристики отклика чувствительных к натрию, двухцилиндровых и концентрических электродов и сравниваем обнаружение ими изменений внеклеточной концентрации натрия ([Na+]o), вызванных ванной или давлением лекарств. Эти измерения показывают, что, несмотря на схожие амплитуды отклика, концентрические натриевые микроэлектроды демонстрируют превосходное соотношение сигнал/шум и время отклика по сравнению с двуствольной конструкцией. Как правило, продемонстрированные методики могут быть легко перенесены на измерение других видов ионов, включая pH или кальций, а также будут применимы к другим препаратам.

Введение

Электрическая сигнализация в мозге основана на потоке ионов через плазматические мембраны. Основные движения ионов во внеклеточное пространство и из него опосредованы не только прохождением через потенциал-зависимые ионные каналы, но и постсинаптическими ионотропными рецепторами, а также транспортерами ионов. Таким образом, активность нейронов сопровождается сложными изменениями внеклеточной концентрации всех основных ионов 1. Например, было показано, что приток натрия в нейроны во время возбуждающей активности приводит к снижению внеклеточной концентрации натрия ([Na+]o) 2. То же самое верно и для внеклеточной концентрации кальция, поскольку ионы кальция быстро проникают как в пре-, так и в постсинаптические структуры. В то же время калий движется в обратном направлении, что опосредует увеличение внеклеточной концентрации калия ([K+]o) в низком диапазоне мМ 4,5. Синаптическая активность также вызывает изменения внеклеточного pH, которые частично смягчаются сопутствующими потоками глиальных мембран, изменяющими внутриглиальный pH 6,7. Эти изменения концентраций внеклеточных ионов, связанные с активностью, имеют значительные функциональные последствия. Например, даже небольшое увеличение [K+]o деполяризует нейроны, а также глиальные клетки, тем самым изменяя возбудимость нейронов, и существует несколько механизмов для удаления избытка калия8. Их сбой может привести к эпилептиформной активности нейронов или таким явлениям, как распространяющаяся депрессия 1.

Из-за их критической важности, количественное определение концентраций внеклеточных ионов часто необходимо для понимания функции и дисфункции нейронных сетей в физиологических и патофизиологических условиях. На протяжении десятилетий двухцилиндровые ионоселективные микроэлектроды зарекомендовали себя как отличные инструменты для таких измерений в тканях мозга 9. Для многих ионов доступны высокоспецифичные сенсоры с низкой перекрестной реактивностью для других ионов. В дополнение к классическим двуствольным электродам в последнее время были введены так называемые концентрические электроды. Последние обеспечивают превосходное временное разрешение, но требуют немного больше времени и усилий для построения 10.

Далее мы опишем подготовку и калибровку этих двух типов ионоселективных микроэлектродов. Затем мы показываем, как эти электроды могут быть использованы в подготовке срезов мозга для измерения изменений [K+]o или [Na+]o, вызванных возбуждающей активностью в соответствии с различными парадигмами стимуляции, включая ванну и применение лекарств под давлением.

Протокол

Это исследование было проведено в строгом соответствии с институциональными руководящих принципов Генриха Гейне университета Дюссельдорфа, Германия, а также директивы Европейского сообщества Совета (86/609 / EEC). Все эксперименты были сообщены и одобрены на Бюро обеспечения животных на уходу и использованию животных фонда Генриха Гейне университета Дюссельдорфа, Германия (институциональной числа акт: O52 / 05). В соответствии с Законом Германии защиты животных (Tierschutzgesetz, статьи 4 и 7), никакого формального дополнительное утверждение для удаления посмертного мозговой ткани не было необходимости.

1. Подготовка двуствольное ион-селективные микроэлектродов

  1. Приготовьте два боросиликатного стекла капилляров с нитью: один длиной 7,5 см и наружным диаметром 1,5 мм, которые будут использоваться для ионно-чувствительный баррель, и один длиной 6,5 см и наружным диаметром 1,0 мм для последующей ссылка баррель.
  2. Очистите capil лари в ацетоне в течение 12 ч и затем промыть несколько раз с абс. этанол и дайте им высохнуть. Электроды могут теперь быть сохранены в эксикаторе.
  3. Используйте двухкомпонентный клей или небольшой полосой из алюминиевой фольги, чтобы исправить длинный и короткий капилляр вместе на обоих концах. Нагреть двойной капилляр в печи при 60 ° С в течение 1 часа. Это ускоряет процесс отверждения. Храните электроды в настоящее время в эксикаторе.
  4. Сосредоточьте двойной капилляр в вертикальной съемника с вращения в патроне. Нагрейте катушку аккуратно, пока стекло не достаточно мягким, чтобы позволить горизонтальное вращение вращения в патроне на 180 °. На этом этапе, предотвратить удлинение капилляра с подушкой под патрон.
  5. После охлаждения, удалить механическим перерыв и нанесите второй протокол отопления вытащить капилляр, в результате чего два острых, двуствольными капилляров (Рисунок 1). Диаметр наконечника из одного двойного капилляра должна быть близка к 1 мкм.
ve_content "> figure-protocol-1
Рисунок 1. Архитектура ионоселективных микроэлектродов. (А) Фотография из двуствольного микроэлектродом. Для наглядности и лучшей видимости, жидкость внутри опорного баррель подкрашивали. (В) Фотография концентрической микроэлектрода и соответствующего электрода сравнения. Кончик микроэлектрода концентрической показан в увеличенном на его влево. В (А) и (В), пространство, занимаемое датчика ионов в кончиках пипеток пост-цвета. В нижней части, расположение кончик обоих типов электродов схематично показан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Если вертикальная съемник с вращения в патроне не доступна, подготовить двуствольное ионного SELECный микроэлектрод в горизонтальном съемника с использованием тета стекло.
    1. С этой целью вытянуть тета стекла (наружный диаметр 1,5 мм, длина 7,5 см), чтобы привести в двух электродов с двух стволов каждый. Отметить один из них в качестве будущего эталонного баррель. Силанизированы другой аналогична процедуре, описанной ниже в качестве будущего ион-селективного баррель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как подготовка двуствольными тета-стеклянных электродов гораздо проще, чем подготовка скрученных двуствольными электродов, они более склонны к кросс-действия между обеими баррелей тонкий разделительный стеклянная стена между ними, как правило, быть пористой их возможное наконечник.
      Примечание: Поскольку коктейль датчика (смотри ниже) является гидрофобным, внутренняя поверхность поздней ионно-чувствительный баррель должна быть гидрофобным, а в процессе, называемом силанизация. Для этого, гексаметилдисилазаном (ГМДС) используется (рисунок 2), как описано в следующем шаге.

Рисунок 2
Рисунок 2. силанизация пипеток. (А) гексаметилдисилазан (HMDS) реагирует с группами Si-OH внутренней поверхности стекла и обеспечивает его гидрофобным. (Б) Левая фотография показывает весь блок силанизация. Широкий рот флакон, содержащий HMDS помещают поверх нагревательной пластины, установленной на 40 ° С. На верхней части бутылки, держатель (РН) проведение капилляры (CAP) установлен. Правильная фотография показывает расширение держатель пипетки (PH) балансовой капилляры (CAP). (С) схематический вид сбоку заказных держателей пипетки (PH) для двуствольного (слева) или концентрических (справа) капилляров (CAP) в виде установленных на бутылку широким горлом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этот показатель.

  1. Перед пузаполнение электроды, заполните ок. 20 мл ГМДС в бутылку широким горлом. Внимание: ГМДС для использования только в вытяжном шкафу, пары опасны для здоровья! Закройте бутылку и поставить его на нагревательной пластины, предустановки 40 ° C. Разогреть печь, помещенных под капотом, а также, до 200 ° C.
  2. Заполните опорный ствол до его кончика дистиллированной водой, чтобы предотвратить его силанизации течение следующей процедурой.
  3. Положите двуствольное капилляр с наконечником вверх на специальную, заказ держателя (рис 2B, 2C). Тупой конец должен открыта свободно достигают через нижней части держателя (фиг.2с, слева). Впоследствии, поместите этот держатель на широкий рот бутылку, содержащую предварительно нагревают HMDS в течение 70 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ГМДС пар может течь через капилляры свободно. Во время одного процесса силанизация, что 20 мл HMDS не испаряются полностью, и бутылка, таким образом, может быть использована несколько раз.
  4. ПослевоенныеDS, передачи капилляры металлической подставке и в предварительно нагретую печь в течение двух часов. Это будет сухой обоих стволов.
  5. После силанизации, держать капилляры сухой до применения. Если первые процедура требует около 3,5 ч, в общей сложности, электроды могут теперь быть сохранены в эксикаторе в течение нескольких недель.
  6. В день их экспериментального использования, подготовить ионоселективных электродов, заполнив кончик силанизированного баррель с 1-2 мкл ионоселективной датчика (рис 1А). Для микроэлектродов калия чувствительны, используйте валиномицин носителя; и микроэлектродов натрия чувствительны, используйте ETH 157 в качестве носителя.
  7. Заметим, что ионно-селективный датчик достаточно вязким, что делает его трудным для верхушка правильно заполнить.
  8. Заполните опорный цилиндр с HEPES-буферным раствором (смотри ниже).
    Примечание: В то время как другие, более простой изо-осмотического солевой раствор может быть использован в качестве хорошо, мы предпочитаем использовать солевой раствор, состав которого, по существу, аналогичнаперфузии раствором (ACSF см 3.6.), потому что это может просочиться и проникают в ткани в ходе экспериментов. Таким образом, важно также, что этот физиологический раствор не содержит более высокую концентрацию иона, которые будут определены, чем ACSF используется.
  9. Засыпка датчик с физиологическим раствором, который содержит высокую концентрацию иона, которые будут обнаружены. Таким образом, обратная засыпка датчик с 100 мМ NaCl (физиологического раствора для микроэлектродов натрия чувствительных) или 100 мМ KCl (для микроэлектродов калия чувствительны). Будьте уверены, чтобы не вставить дополнительные пузырьки воздуха во время этой процедуры.
  10. Если силанизация был успешным, и датчик заполнены должным образом, наблюдать поверхность датчика образуют четко видимый вогнутую поверхность против засыпки (рис 1А). В противном случае, датчик может быть втянут из капиллярной стенки и верхушка не будет заполнена. Такие электроды не будет работать.
  11. Вставьте хлорированные серебряные провода в обоих стволов (будьте осторожны, не прикасайтесь к сенуСор) и запечатать каждую бочку с зубной воска (рис 1А).

2. Подготовка концентрических Ионоселективные Микроэлектроды

  1. Для наружного цилиндра, использовать тонкостенные стеклянные капилляры с нити (внешний диаметр 2,0 мм) и длиной 7,5 см. Для внутреннего баррель, принять тонкостенные капилляры нити, наружный диаметр 1,2 мм и длину 10 см.
  2. Очистите капилляры в ацетоне в течение 12 часов. а затем промыть несколько раз с абс. этанол и дайте им высохнуть. Электроды могут теперь быть сохранены в эксикаторе.
  3. Заполните ок. 20 мл ГМДС в бутылку широким горлом. ВНИМАНИЕ! ГМДС для использования только в вытяжном шкафу, пары опасны для здоровья. Закройте бутылку и поставить его на нагревательной пластины, предустановки 40 ° C. Разогреть печь, помещенных под капотом, а также, до 200 ° C.
  4. Вставьте 2.0 мм капилляра в горизонтальной съемника и вытащить его привести в капиллярах с короткими свечей и наконечника Diameтер ~ 4 мкм (Фиг.1В).
  5. Положите выдвинутом 2.0 мм капилляр с наконечником вверх на заказных, специальный держатель (Рис 2B, 2C Рис), так что его тупой конец открывается в полость бутылки (рис 2С, справа). Впоследствии разместить этот держатель на широкий рот бутылку, содержащую предварительно нагревают HMDS в течение 70 мин. Убедитесь, что ГМДС пар может течь через все капилляры.
  6. После передачи капилляры к металлической подставке и в предварительно нагретую печь в течение двух часов.
  7. После силанизации, держать капилляры сухой до применения. В то время как бывший процедура требует около 3,5 часов в общей сложности, в настоящее время хранить электроды в эксикаторе в течение нескольких недель.
  8. Непосредственно перед использованием, заполнить небольшое количество датчиков (0,2 мкл) в капилляре силанизированного (Фиг.1В).
  9. Чтобы подготовить внутренний капилляр, вставьте малого диаметра капилляра в съемника и вынуть привести в двухкапилляры с длинными свечами и острыми наконечниками (рис. 1В) Залейте 100 мМ NaCl (микроэлектродов натрия чувствительных) или 100 мМ KCl (микроэлектродов калия чувствительных) солевым раствором.
  10. Поместите датчик заполненные и солевой заполненные капилляр непосредственно в соответствие друг с другом на пользовательской сборки пробка изготовлена ​​из покровные. Вставьте меньший капиллярных короткий путь в большую капилляра.
  11. Fix капилляры на другой, используя покровное пластилина, трансфер в стадии микроскоп и визуализировать с помощью 100-кратном увеличении. С помощью стеклянной палочки, который установлен на микроманипулятора и поворотом мелкий привод стадии микроскопа, медленно продвигать внешнюю капиллярную трубку по внутренней капилляра, пока расстояние между их кончиков не примерно 5 мкм (Фигура 1В).
  12. Исправление открытый конец внешней капилляра на внутреннюю капилляра с помощью зубной воск. В качестве альтернативы, нанесите небольшое падение цианоакрилату (Crazy Glue) модулиtead воска.
    Примечание: добавление небольшого капли воды будут полимеризовать клей и закрепить электроды на месте. Вставьте хлорированного серебряной проволоки во внутренний баррель и запечатать его с зубной воск (рис 1B).
  13. Для приготовления электрода, занимает много 7,5 см капилляр нити и внешний диаметр 1,5 мм и вытащить с вертикальной съемника. Убедитесь, что советы относительно долго, но не слишком острым (наконечник диаметром ~ 1 мкм).
  14. Отменить верхний пипетку, откройте нижнюю патрона и поднимать нижнюю пипетку с помощью 5 мм. Закройте патрон и не поднимать его до кончика нижней электрод расположен около 5 мм выше нагревательной спирали. Нагрейте катушку и использовать пинцет, чтобы согнуть кончик примерно на 45 ° в сторону. Нижняя пипетки около 1-2 мм. Изгиб снова около -45 °, чтобы направить наконечник обратно параллельно основному валу (Фиг.1В). Эта процедура необходима для того, чтобы близкого расположения кончика refereсть электрода к концентрической электрода.
  15. Заполните справочную ствол с HEPES-буферным раствором (см ниже), вставьте хлорированного серебряной проволоки и запечатать ствол с зубной воск (рис 1B).

3. соленые

  1. Подготовьте физиологический раствор для обратной засыпки электродов калия чувствительны (см 1.15.), Состоящий из 100 мМ KCl. Соленая для засыпки натрий-чувствительных электродов состоит из 100 мМ NaCl.
  2. Приготовьте солевой раствор для засыпки опорных баррелей (. HEPES-буферным раствором, см 1.16) состоит из (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgSO 4, 1,25 NaH 2 PO 4 и 25 HEPES, титруют с NaOH, чтобы привести рН 7,4.
  3. Подготовьте физиологический раствор для калибровки электродов калия чувствительных состоящих из 25 мМ HEPES и в общей сложности 150 мМ NaCl и KCl, рН доводили до 7,4 с NMDG-OH (N-метил-D-глюкамин). Здесь калибровки проводили с солевые растворы, содержащие 1, 2, 4 или 10 ммKCl; ACSF содержала 2,5 мМ KCl (рис 5).
  4. Подготовьте физиологический раствор для калибровки натрия чувствительных электродов следующим образом (в мм), 25 HEPES, 3 KCl, в общей сложности 160 NaCl и NMDG-Cl, рН доводили до 7,4 с NMDG-ОН. Выполнение калибровки физиологическим раствором, содержащим (в мМ) 70, 100, 130 или 160 NaCl; ACSF содержится 152 NaCl (рисунок 6).
  5. Для определения перекрестной реакции датчика с другими ионами, например., РН, подготовить дополнительные калибровочные Salines с концентрациями неподвижных ионных, но различную рН.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как эта процедура не показано в настоящем исследовании, пожалуйста, следует обратиться к более ранней работе, посвященной этой проблеме (например, 11,12).
  6. Приготовьте острые кусочки ткани мозга в физиологическом растворе, состоящей из (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 и 20 глюкоза, продувают 95% O 2 и 5 % СО 2, в результате чего рН7.4.
  7. Выполнение экспериментов в срезах мозга в искусственном цереброспинальной жидкости (ACSF), состоящей из (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 и 20 глюкоза, продувают 95 % O 2 и 5% CO 2, в результате чего рН 7,4.
  8. Для стимуляции нейроны и глиальные клетки, содержащие готовить растворы 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5 мМ глутамата или 10 мМ L-аспартата, растворенного в ACSF. Для применения давления, растворяются 10 мМ глутамата в HEPES-буферным раствором.
  9. Подготовка приложений пипетки для применения давления. Вставьте тонкостенные стеклянные капилляры с нити (наружный диаметр 2,0 мм) и длиной 7,5 см в горизонтальной съемника и вытащить, чтобы привести в диаметре наконечника ~ 1 мкм.
  10. Для индукции тройничного деятельности, подготовить магния без ACSF, содержащий 10 мкМ бикукуллин метиодид.
  11. Для подавления генерации потенциалов действия, подготовить 10 мМ маточного Solutион тетродотоксин (ТТХ) в дистиллированной воде. В ходе экспериментов, ТТХ непосредственно добавляют к ACSF привести к конечной концентрации 0,5 мкМ.
  12. Чтобы предотвратить активацию рецепторов АМРА-, подготовить 50 мМ исходного раствора циано-нитрохиноксалин-диона (CNQX) в диметилсульфоксиде (ДМСО). В ходе экспериментов, это непосредственно добавляют к ACSF привести к конечной концентрации 100 мкМ.
  13. Чтобы заблокировать активацию NMDA-рецепторов, подготовить 50 мм маточного раствора амино-phosphonopentanoate (APV) в 70 мМ NaHCO 3. В ходе экспериментов, это непосредственно добавляют к ACSF привести к конечной концентрации 100 мкМ.

4. Калибровка ион-селективные микроэлектродов

  1. Калибровка ионоселективный микроэлектрода непосредственно до и после каждого эксперимента.
  2. Прикрепите электроды к микроманипуляторами и вставьте их в ACSF-перфузии экспериментальной камере, помещенной под стерео микроскоп (рис 3 г>, 4). Поместите электрод в форкамере (фиг.4А, В). Включение ванны перфузии, гарантировать, что поток составляет около 2 мл / мин.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Экспериментальная работа пространство. Запись установка состоит из вибраций затухают таблице несущей X / Y-поступательное сцену с экспериментальной ванны, микроманипуляторами и стереомикроскопом с высококачественной оптикой. Стерео микроскоп также оснащен ПЗС-камеры для целей документирования. Кроме того, устройство приложения давления для фокальной применения препарата используется. Регистрирующие электроды соединены с помощью стадии голова к дифференциальному усилителю. Оцифрованные данные (A / D конвертер) записывается с компьютером. Ванну перфузии осуществляется с помощью шлангового насоса микро (не показан).> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Включите А / D конвертер, дифференциального усилителя, и компьютер, и запустите программное обеспечение для записи (Рисунок 3, 4). Потому что сопротивление ионно-чувствительный баррелей очень высока (10-20 ГОм; см ниже), использовать специальную усилитель электрометр с высоким входным импедансом (R = 10 в ТОм) и ток небольшой уклон (я смещения = 50 фА - 1 Па).

figure-protocol-4
Рисунок 4. Электронная и пространственная конструкция экспериментальной установки. (А) Схематическое изображение расположения записи. Кончики в двуствольного микроэлектродом (синий) и концентрической микроэлектродом (красный) расположены в экспериментальной ванну, наполненную раствором. Ссылка ванна электрод схематически показано. POTEN TiAl детектируется ионоселективных баррелей (V 1) состоит из электрического поля потенциал (V REF) и ионный потенциал V (иона), в то время как справочные баррелей (V 2) только обнаружить V REF. Чтобы изолировать V ион, V REF вычитается из V 1 с помощью дифференциального усилителя (DA). (Б) Топография экспериментальной стадии с концентрической микроэлектродом на месте. Центр экспериментальной стадии состоит из экспериментальной ванне, содержащей препарат среза. Для заземления ванны, ссылка ванна электрод погружен в предварительной камере, которая также размещена на входе перфузии. Сама сцена основана на отдельный разъем заземления. Концентрическое микроэлектрод и его электрод осуществляется отдельными владельцами пипетки управляемых микроманипуляторами. Микроэлектродные и электрод сравнения, электронно соединенный дл головной каскада усилителя.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Подключите хлорированные серебряные провода к соответствующим входам головного стадии дифференциального усилителя (рисунок 4). Определить электродов сопротивлений. Убедитесь, что сопротивление эталонного баррель между 30-100 МОм и сопротивления ионно-чувствительный ствол 10-20 ГОм.
  2. Отрегулируйте сигналы напряжения до нуля и начать запись.
  3. Следует отметить, что потенциал детектируется ионоселективных баррелей (V 1) состоит из электрического поля потенциала (V REF) и ионный потенциал V (ион), в то время как справочные баррелей (V 2) только обнаружить V REF. Чтобы изолировать V ион, V REF вычитается из V 1 с помощью дифференциального усилителя (DA) (фиг.4А).
  4. После получения стабильный базовый уровень,переключатель калибровки солями, содержащими определенные концентрации иона должна быть измерена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5А показывает калибровку микроэлектродом двуствольного калия-чувствительным. На рисунке 6A, калибровки и двуствольное а также концентрические Na +,, чувствительными микроэлектрод показано. В то время как мы не описываем процедуру здесь, обратите внимание, что возможные помехи с другими ионами должны быть проверены перед использованием конкретного ионофор (см также 3.4.).

figure-protocol-5
Рисунок 5. Калибровка двуствольными микроэлектродов калия селективный. (А) Изменение напряжения ссылки ствола (V REF) и К + -потенциалом (V) К + в ответ на изменения в ванне концентрации К + ( [К +] б), как указано. (Б) Половина-logarithmic участок [K +] б сравнению V K +. Линейный участок данных показывает наклон около 56 мВ. Для наглядности, следы были сглажены с помощью фильтра Sawitzky-Голея (ширина 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Определить отклик напряжения в ион-селективного баррель в ответ на изменения в известной концентрации ионов. Участок данных в одной логарифмическом (фиг.5В, 6В) и определить наклон. Идеальный датчик следует отношения описывается уравнением Нернста (см, например, 13):

figure-protocol-6
В: измеряется электродный потенциал;
В 0: стандартный электродный потенциал, например для AgCl проволоки при температуре 298,15 К и парциальном давлении 101,325 кПа (абсолютное)
R: газовая постоянная (8,314 Дж / градус Кельвина / моль)
Т: абсолютная температура (в градусах Кельвина)
г: заряд на ионе (+1 для калия и натрия)
F: постоянная Фарадея (96.500 кулоны)
с ': внеклеточный концентрация ионов
C '': внутриклеточной концентрации ионов

Для практических целей, и натуральный логарифм преобразуются в Нернста наклона с, который затем действует в течение данного иона и температуры:

figure-protocol-7
Примечание: для электродов калия и натрия, идеальным ответом напряжение датчика, таким образом, имеет линейный наклон около -58 мВ при комнатной температуре. Некоторые отклонения, это может быть принято (5В, 6В). Важно, однако, что характеристики отклика данного электрода существенно не изменяется (более чем на 10%, смотри ниже) до и после эксперимента.

figure-protocol-8
Рисунок 6. Калибровка микроэлектродов натрия-селективный и сравнения двуствольное с концентрическими электродами (А) Топ следы:. Изменение напряжения эталонных баррелей (V REF) от двуствольного электрода (черный пунктир след) и концентрические электрод (серый след) в ответ на изменения в бане Na + концентрации ([Na +] б), как указано. Следует отметить, что ответы напряжения обоих электродов практически идентичны. Нижние следы: Изменения в напряжении НС + -потенциалом (V Na +) из двуствольного электрода (черный след) и концентрической электрода (серый след) в ответ на изменения в [Na +] б. (B), Half-логарифмические земельные участки [Na +] б по сравнению с V Na + обоих электродов. Линейные участки данных выявить наклон около 48 мВ для обоих электродов.(С) Реакция V Na + двойной стволом (черный след) и концентрические электрод (серый след) на быстрой смены в [Na +] б от 152 мм до 70 мм. Обратите внимание, что время отклика концентрической электрода значительно быстрее. Для наглядности, следы были сглажены с помощью фильтра Sawitzky-Голея (ширина 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Определить время отклика электродов, которая зависит от диаметра наконечника, форму кончика, а также от толщины фазы датчика в конце электрода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой экспериментальной установки и использования быстрое изменение между различными солями перфузии (обмена завершенных на конце электрода в 500 мс), двуствольное микроэлектродов натрия чувствительных достигла стабильного потенциала в рамках 9,7 ± 4,5 с припереключение с 152 мм до 70 мм [Na +] (N = 6). В то же значение, концентрические натрия, чувствительные к микроэлектродов достигнуто стабильное потенциал в течение всего лишь 0,8 ± 0,3 сек (N = 6) (6С). Это подчеркивает превосходное разрешение времени концентрических по сравнению с двуствольными микроэлектродов.

5. Препарирование тканей

  1. Для генерации острых кусочков, обезболивания мышей послеродовых дней 16-20 СО 2 и быстро обезглавил (в соответствии с рекомендацией Европейской комиссии опубликовано в: Эвтаназия экспериментальных животных, Люксембург: Бюро официальных публикаций Европейских Сообществ, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
  2. Подготовка срезах гиппокампа ткани (толщина 250 мкм), после стандартной процедуры (см, например, 14).

6. Экспериментальные методы

  1. Перевести кусочек в экспериментальной камере и зафиксируйте его сСетка.
  2. Опустить калиброванный ионоселективный микроэлектрода на поверхность среза и сажать рогового radiatum региона CA1 на глубину около 50 мкм с электродом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прикосновение к поверхности среза с микроэлектродом приводит к характерным колебаниям в ионно-чувствительный баррель. Кроме того, повреждение клеток в процессе сажание на кол ткани вызывает колебания, а также. Подождите, пока базовая линия не стабилизируется.
  3. Для применения давления агонистов передатчика, заполнить заявление пипетки с соединением (например 0,5 мм глутамата). Прикрепите пипетки микроманипулятора и пару его к устройству приложения давления.
  4. Нижняя пипетки применение в ткани и тщательно поместите его в непосредственной близости от наконечника ион-селективного микроэлектрода (~ 20-40 мкм). Запуск приложения давления (например, 10 сек, 40 мбар) и записи изменений напряжения, как контролируемые ионоселективной микроэлектродом.
  5. Для применения ванны наркотиков, SWзуд между различными солями перфузии для определенной продолжительности.
  6. Для завершения эксперимента, тщательно снять ионоселективной микроэлектрода из ткани и записывать любой дрейф в потенциалах от первоначального нулевого значения, которые могут быть получены в ходе длительных периодов записи.
  7. Удалить подготовку ломтик из ванны и выполнить второй калибровки ионоселективных микроэлектродом.
    Примечание: Это необходимо потому, что кончик электрода может засориться при его движении через ткань. Таким образом, важно обеспечить, чтобы электрод все еще отвечает правильно на изменения в концентрации ионов. Эксперименты должны быть отклонены, если ответ электрода к изменению десятикратном в концентрации ионов снизилась более чем на 10%. Хорошо рабочих электродов может быть в принципе использованы повторно в нескольких экспериментах. Это особенно верно для концентрических электродов, которые могут длиться даже в течение нескольких дней. Важно, однако, что процедуры калибровки повторнополняется до и после каждого отдельного эксперимента, чтобы обеспечить надлежащее функционирование электродов.

Анализ данных 7.

  1. Чтобы преобразовать отклик напряжения ионно-селективного электрода к изменениям в внеклеточной концентрации ионов, сначала преобразовать уравнение 2, чтобы определить изменение потенциальной Dgr; v иона (мВ) следующим образом (здесь продемонстрировали K +, чувствительными электродами, аналоговый процедура применяется для Na +, чувствительными электродами):

figure-protocol-9

В K +: изменения в потенциале валиномицина баррель (мВ)

с: Нернста наклон

К +] В: Базовый концентрация калия (в нашем случае 2,5 мМ К +)

К +] O: изменения в [K +] О ходе эксперимента

  1. Рассчитайте среднее арифметическое склонах, полученных из отдельных участков логарифмических ое калибровки до и после эксперимента (см 5В, 6В, см пункт 4.8) для получения «S».
  2. Для расчета изменения кнопку [K +] O (Δ [К +] о, в мм), изменить уравнение 3 для:

figure-protocol-10

Результаты

Для контроля [К +] O и изменения их в ответ на нервной активности, двуствольное микроэлектрода калий-селективный вводили в роговом radiatum области СА1. Через несколько минут после того, как сажание на кол, ион-селективные ствола электрода достигла стабильный базовый уровень (7А), что соответствует [K +] вывода около 2,8 мм, значения, близкого к [K +] на ACSF используемого ( 2,5 мМ). Ванна применение 0,5 мМ глутамата в течение 10 сек вызывало обратимое повышение [K +] O примерно 4 мм, с последующим недолет ниже базовой линии на сумму ~ 0,7 мм (7А). Снижение концентрации глутамата 0.4, 0.3, и 0.2 мМ вызывало соответствующее уменьшение амплитуды как кратковременное повышение и недолет в [К +] O (7А).

OAD / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
Рисунок 7. внеклеточных переходные калия в ответ на нервной деятельности. (А) [К +] O переходные, состоящий из увеличения, за которым следует недолет ниже базовой линии, вызванного применением ванны различных концентраций глутамата в течение 10 сек, как показано. (В) Влияние перфузии с блокаторами глутаматных рецепторов (CNQX, 100 мкМ; APV, 100 мкМ) и тетродотоксин (ТТХ; 0,5 мкМ) на [К +] O переходные индуцированный применением ванны 0,5 мМ глутамата в течение 10 сек. (С) Спонтанное [К +] O переходные в присутствии 0 мг / BIC 2+. Эксперименты, приведенные в AC проводили с использованием двойным стволом электродов. Для наглядности, следы были сглажены с помощью фильтра Sawitzky-Голея (ширина 20). Пожалуйста, клИк здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ранее эксперименты показали, что такие глутамата индуцированных [К +] выходных сигналов, существенно не изменяется при применении ТТХ, и, таким образом, в значительной степени независимы от открытия напряжения закрытого натриевых каналов и нейронов потенциал действия поколения 15,16. Для изучения механизмов, лежащих в основе наблюдаемых [K +] уплотнительные изменения в ответ на глутамат, мы применили блокаторы рецепторов глутамата, а именно CNQX (100 мкМ; блокатор рецепторов АМРА) и APV (100 мкМ; блокатор рецепторов NMDA) в присутствии ТТХ (0,5 мкМ). По ванны перфузии с этим блокаторы, глутамат-индуцированного [К +] о изменениях были практически отменены, подтверждающие их зависимость от открытия каналов ионотропных глутаматных рецепторов Как сообщалось ранее (например, 17; рис 7В).

Для дальнейшей демонстрации тОн актуальность возбуждения глутаматергическом для генерации внеклеточной [K +] сигналы, срезы перфузию номинально Mg 2+ -бесплатный солевого раствора, содержащего 10 мкМ бикукуллина метиодид (0 мг 2+ / BIC). Это снимает напряжение зависит от Mg 2+ -блок рецепторов NMDA и гасит торможение, блокируя рецепторы ГАМК A, в результате чего спонтанного рецидива эпилептиформная деятельность в сети (например, 18,19). Как и ожидалось 20, спонтанное, рецидивирующий [К +] О переходные, составив около 1,5 мм были обнаружены в 0mg 2+ / BIC физиологического раствора (рис 7С). В промежутке между этими ответами, меньшим [K +] о переходных со средним амплитудой около 0,2 мМ произошло (7С).

Во втором наборе экспериментов мы использовали [Na +], чувствительными микроэлектродов для определения [Na +] Уплотнительное изменения навеянные примененияагонисты глутамата. Здесь мы также сравнили характеристики отклика двуствольное и концентрических микроэлектродов, использующих два различных парадигм приложений. [Na +], чувствительными микроэлектродов были расположены в роговом radiatum на глубине около 50 мкм. После стабильный базовый уровень был достигнут, агонист глутамата L-аспартат был применен в ванне перфузии (10 мм, 120 сек, ванна перфузии 2,5 мл / мин). Как отмечалось ранее 21, применение аспартата вызвала медленное уменьшение в [Na +] о примерно на 15 мм, которая длилась около 5 минут, а затем начал восстанавливаться обратно к исходному (рис 8а). Следует отметить, что в то время как пиковые амплитуды и кинетика [Na +] O сигналов, определенных обоими электродами были практически идентичны в этих условиях, концентрические электроды демонстрировали более стабильный базовый уровень и нижний уровень шума (фиг.8А).

Чтобы проверить г esponse характеристики различных электродов при более быстром парадигмы приложений, мы под давлением применяется глутамат через мелкое стеклянной пипетки, расположенной в роговом radiatum на расстоянии 20-40 мкм от кончика ион-селективного микроэлектрода. Как и ожидалось 21, применение глутамата (10 мМ) в течение 200 мс вызвало падение [Na +] O (8В). Пиковые амплитуды [Na +] Ø снижения были в том же диапазоне для обоих типов электродов (двухпросветный: 4.5 - 13.5 мм, п = 14; концентрических: 2.0 - 19.1 мМ, п = 15). Однако, в отличие от результатов, полученных при медленном ванны перфузии (смотри выше), не только отношением сигнал-шум, но также и временной ход [Na +] O сигналов, обнаруженных двух типов электродов значительно отличались. Среднее время до пика составляет 3,5 сек для двуствольного и лишь 1,3 сек для концентрических микроэлектродов.

ve_content "> Таким образом, эти результаты показывают, и подтверждают более быструю кинетику отклика концентрических против двуствольными Na + селективные микроэлектродов, (ср 6С и 8В), а Также было отмечено, для Ca 2+ и рН-селективные аналоги 10 . В отличие от бывшего исследования, в котором короткий всплеск синаптической стимуляции был выполнен, чтобы вызвать быстрый синаптически индуцированные ионные переходные, было лишь тенденция, но никакого существенного различия в средних амплитуд пиков между концентрическими и двуствольными электродов с нашего приложения Парадигма. Это, вероятно, связано с тем, что расстояние пипетки приложения от кончика ион-селективного микроэлектрода менялась в двух (20-40 мкм) и, следовательно, о том, что концентрация глутамата максимальное в целевой области не то же самое в различных экспериментах, препятствуя любой существующий разницу в пиковых амплитуд.

(А) Топ следы: Изменение ВольтаGE из опорных баррелей (V REF) от двуствольного электрода (черный пунктир) и трассировки концентрической электрода (серого трассировки) в ответ на изменения в бане Na + концентрации ([Na +] б), как указано. Следует отметить, что ответы напряжения обоих электродов практически идентичны. Нижние следы: Изменения в напряжении НС + -потенциалом (V Na +) из двуствольного электрода (черный след) и концентрической электрода (серый след) в ответ на изменения в [Na +] б. (B), Half-логарифмические земельные участки [Na +] б по сравнению с V Na + обоих электродов. Линейные участки данных выявить наклон около 48 мВ для обоих электродов. (С) Реакция V Na + двойной стволом (черный след) и концентрические электрод (серый след) на быстрой смены в [Na +] б от 152 мм до 70 мм. Обратите внимание, что время отклика концентрической электрода значительно ФАСтер. Для наглядности, следы были сглажены с помощью фильтра Sawitzky-Голея (ширина 20).

figure-results-1
Рисунок 8: Внеклеточные переходные натрия, как обнаруженные двуствольное и концентрических электродов.
(А) временные изменения в V REF и [Na +] O, индуцированное ванны перфузии 10 мМ аспартата в течение 120 сек, как показано в строке. Верхние следы показывают записи выполняется с двуствольного электрода, нижние следы были записаны с помощью концентрической электрод. (Б) временные изменения в V REF и [Na +] O, вызванные применением местного давления 10 мМ глутамата 0,2 сек, как показано стрелкой на. Верхние следы показывают записи выполняется с двуствольного электрода, нижние следы были записаны с помощью концентрической электрод.Пунктирные красные линии представляют собой линейные приступы период между началом сигнала к его максимуму. Обратите внимание, что время отклика концентрической электрода значительно быстрее, при этом условии. Для наглядности, следы были сглажены с помощью фильтра Sawitzky-Голея (ширина 20). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Жидкость-носитель на основе ион-селективные электроды были успешно использованы в течение многих десятилетий, и для многих ионов, весьма специфические датчики доступны 22-26. При использовании в межклеточное пространство (ECS) позвоночных препаратов головного мозга, нужно иметь в виду, однако, что это довольно агрессивная техника: в то время как ширина ECS только вокруг 20-50 нм, диаметр ионселективного микроэлектродов составляет около 1 мкм (двуствольное электроды) или больше (концентрические электроды). Кончики ионоселективных микроэлектродов, таким образом, не только повредить ткани во время их сажание на кол ткани, но также увеличить ECS, в пользу недооценка ионных переходных процессов. Несмотря на эти подводные камни, внеклеточные ионные переходные процессы в ответ на активность нейронов удивительно согласуется между различными лабораториями 7,8, что свидетельствует о надежности этого метода.

Производительность и пригодность ионоселективных электродовзависит от их чувствительности и селективности, который определен в коктейль датчика ("жидкая мембрана ионофором ') используется. Датчик коктейли содержат специальный молекулу-носитель, например валиномицин для K + селективные микроэлектродов, который проявляет высокую селективность для калия 27. Тем не менее, перекрестная реактивность с другими ионами может происходить и должны быть проверены. Валиномицина проявляет значительную перекрестную реактивность на аммоний, который должен быть рассмотрен при интерпретации результатов (например, 11,12). Кроме того, так как напряжение-ответ из ионофоров следует Нернста поведение (ср уравнение 1), отношение сигнал-шум и порог обнаружения зависит от концентрации иона должна быть измерена. Таким образом, в то время как маленький [К +] о переходных вызывают большие изменения напряжения против низкого исходного уровня [К +] о, мала [Na +,] о переходные являются гораздо более трудно обнаружить против приветGH базовый [Na +] O (ср фиг.5 и 6).

Производительность ионоселективных электродов также определяется временным разрешением, которое в значительной степени определяется его электрической постоянной времени. Последнее в основном определяется осевой сопротивление датчика, а также распределенной емкостью по длине пипетки, между своими внутренними решений и внешней среды. В конфигурации двуствольного, сопротивление высоко, из-за большого колонке засыпаны датчика ионов. Для данного изолирующего диэлектрика (в данном случае боросиликатного стекла), емкость регулируется толщины диэлектрика. В двуствольными электродов, диэлектрическая ширина составляет стеклянной стенкой пипетки. Как стекло разжижает близко к кончику, диэлектрическая ширина падает, и увеличивается емкость. Эти факторы в совокупности производят электроды с временем отклика, которые варьируются от нескольких сотен миллисекунд до несколькихсекунд, так как эти факторы различны.

Основным преимуществом концентрической конструкции является то, что как сопротивление осевым и емкость в ванну значительно уменьшилась. Концентрические пипеток шунты большинство сопротивления, засыпанной ионообменника, оставляя лишь остаток в последние несколько микрометров до кончика. Кроме того, заполнение решение в концентрической пипетки физически удалена от ванны, разделенные толщиной две стеклянные стены, что значительно снижает емкость. Как было показано ранее 10, комбинированный эффект снижения сопротивления и емкости является улучшение временного разрешения двух порядков. В случае концентрических Са2 + и рН микроэлектродов, 90% время отклика были минимальны 10-20 мс 10. Соответствующий преимущество концентрической конструкции является низкий уровень шума (ср рисунок 8). Благодаря значительно пониженным сопротивлением, переходные напряжения от любого Ambienт шум сведены к минимуму. Кроме того, выход из таких переходных происходит быстро, вследствие быстрого постоянной времени. Такие артефакты поэтому маленький и быстрый, и имеют менее разрушительное воздействие на физиологические записей (см рисунок 8).

Есть также недостатки концентрической техники. Во-первых, их сборка является более сложным, и отнимает много времени. Вторым недостатком является необходимость поместить отдельную опорную микроэлектрода с наконечником, влекущие за собой использование либо отдельного микроманипулятором или специализированной двойной манипулятора. Наконец, двуствольное микроэлектродов может быть продлен до тройной стволом дизайна, что позволяет обнаруживать двух разных видов ионных одновременно 28, который не возможно концентрических электродов.

Наиболее распространенные ловушки

Неэффективное силанизация.

Самый важный шаг, и главным препятствием в изготовлении каких-либо жидких-Sensили на основе ионселективный микроэлектрода процедура силанизация. Когда электроды не реагируют на изменения в определенной концентрации ионов, или ответить суб-Нернста ответ (то есть, хорошо менее 58 мВ на разнице десятикратном концентрации), плохое эффективность силанизации, как правило, причина. По нашему опыту, это может произойти, если влажность воздуха слишком высокая или слишком низкая, типичный условий в разгар лета, или зимой, соответственно. Если это возможно, чтобы некоторый контроль над влажностью комнатной, эти проблемы могут быть преодолены.

Сопротивление электродов слишком высока.

При необходимости сопротивление ионно-чувствительный баррель может быть уменьшено путем обработки кромок. Для этого, не подвергайте его наконечник к сильной струей абразива, взвешенных в воде в течение нескольких секунд. Это может привести к его крайнее положение наконечника сломать и снизить сопротивление на нужное значение.

Солевые мостики.

Сольмосты между ионом и справочных баррелей привести к плохо или никак-отвечая электродов и, таким образом, также в значительной степени путать их производительность в калибровке. Как уже упоминалось выше (см пункт 1.6.), Это в основном вопрос, когда двуствольное тета стекло выбрали, но это редкий случай, когда с помощью смещения, технику витой ствол, описанной здесь.

С легкостью изготовления в виду, оригинальный двуствольное дизайн Lux 29 часто могут быть использованы с выгодой. Этот метод использует предварительное заполнение ионных и справочных бочки с солевыми растворами, быстро воздействия силана раствора его всасывания и изгнания из кончика, после введением ионита, а также с помощью кончика (см 30,31) , Эти электроды могут быть изготовлены в примерно 10 мин, но их размер чаевых обычно 4 мкм или более, и они более склонны к сбою во время эксперимента. В отличие от этого, методы силанизация что подвержен воздействию силана пара и теплаING может производить электроды с меньшими советов, которые в последние дни, а иногда и недель.

Взятые вместе, есть несколько протоколов и подходов о том, как подготовить ионоселективных микроэлектродов. Здесь мы описали две основные процедуры для изготовления витых двуствольными а также концентрических микроэлектродов, которые хорошо и надежно работать в наших лабораториях, с общей скоростью успеха близка к 100%. Важно отметить, что эти методы могут быть перечислены в измерении других видов ионов, в том числе рН или кальция, а также будет применим к другим препаратам, чем мозг, в том числе заполненных жидкостью полостей или жидкостей в целом. Последнее, но не менее, ион-селективные микроэлектродов позволяют определить концентрации ионов внутри клетки. Из-за их относительно большого размера наконечника (~ 1 мкм), это, однако, возможно только в клетках с большим теле клетки, например такие, как найти в беспозвоночных препаратов 28,32.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить С. Родриго для экспертного технической помощи. Мы благодарим С. Кёлера (центр Advanced Imaging, Генрих Гейне университета Дюссельдорф) за помощь в производстве видео. Исследования в лаборатории автора финансируется Ассоциацией Немецкого научно-исследовательского (DFG: Ro 2327 / 8-1 на CRR), Генриха Гейне университета Дюссельдорфа (до NH) и Национальных Институтов Здоровья предоставить R01NS032123 (для МК).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абразив   MicroPolish Buehler GmbHРастворенные в
капиллярах из боросиликатного стеклаA.dest 1405059HilgenbergApplication; 75 мм x 2 мм, толщина стенки 0,3 мм
Капилляры из боросиликатного стекла с нитью GC150 F-15 Clark Electromedical Instruments, Harvard ApparatusДля датчика двухствольных микроэлектродов 
Капилляры из боросиликатного стекла с нитью накалаGC100-F-15Clark Electromedical Instruments, Harvard ApparatusДля сравнения двухствольные микроэлектроды 
Капилляры из боросиликатного стекла с нитьюGB-200TF-15 Продукты научногоконцентрические, наружный канал. Наружный диаметр 2,0 мм   
Капилляры из боросиликатного стекла с нитью накалаGB-120TF-10Science ProductsConcentric, внутренний канал. Внешний диаметр 1,2 мм
Digidata1322AAxon Instruments
Электрометрический усилитель с головной сценойCustom-made Rin= 10 TΩ и Ibias=50 fA-1pA (коммерчески доступны  альтернативы: e.g. Dagan IX2-700, с головной сценой (10 Гигабайтный резистор обратной связи) или EPMS-07, NPI, Тамм, Германия)
Экспериментальная камерана заказКоммерчески доступна в e.g.   Warner Instruments, США;   Scientifica, Великобритания
ПечьHeraeusДолжна оставаться постоянной при температуре 200 градусов; C
Твердый липкий воск / стоматологический воск Deiberit 502 Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Конфоркапо индивидуальному заказуДолжна оставаться постоянной при 40 °°; C
Держатель микроэлектродов из оргстеклаИзготовленный на заказДвухствольный: O.D.   капилляры 1,5 мм, концентрические: O.D.  капилляры 2 мм
МикроманипуляторLeitz
МикроманипуляторMD4RLeica
СтереомикроскопM205CLeica
ObjectivePlan 0,8xLWDLeica
ПипеткаМодель PP-830НаришигэКонцентрические микроэлектроды 
Съемник для дозаторовМодель P-97Sutter Instruments Датчик концентрических микроэлектродов
Пневматическая система выброса лекарствPicospritzter Type IIGeneral Valve TM Corporation
Travel dovetail stageDT 25/MThorlabs
Двухкомпонентный клей  AralditeHuntsman advanced materials GmbH Такжеможно использовать небольшую полоску алюминиевой фольги для склеивания капилляров.
Серебряная проволока99,9% Wieland Edelmetalle
Слайсер / VibratomeMicrom HM 650 VThermo Scientific
программное обеспечениеAxoScope 8.1 Axon Instruments
Вертикальный съемник Тип PE-2Narishige Scientific InstrumentsС вращающимся патроном для  двухствольные микроэлектроды
x/y трансляционный столикИзготовленные
1(S),9(R)-(−)-Бикукуллин метиодидSigma aldrich14343Конкурентный антагонист рецепторов ГАМК (светочувствительный); ВНИМАНИЕ: токсичный
антагонист рецепторов CNQXSigma aldrichC-127AMPA/каината; ВНИМАНИЕ: токсичный
диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma aldrichD5879
DL-AP5Alfa AesarJ64210антагонист NMDA-рецепторов; ОСТОРОЖНО токсичный
гексаметилдисилазан (HMDS)Sigma aldrich440191ВНИМАНИЕ: Легковоспламеняющийся, острый токсичный (пероральный, кожный, ингаляционный) и коррозионный для металлов и кожи
L-аспарагиновая кислотаSigma aldrichA9256Активирует NMDA и не-NMDA и EAAT
L-глутаминовую кислоту Гидрат соли натрияSigma aldrichG1626Активирует NMDA-R, AMPA-R, QA-R и KA-R),  mGluRs и EAATs
Ионофор калия I - коктейль ВФлюка 60403На основе валиномицина; ОСТОРОЖНО токсичный
ионофор натрия II - коктейль АФлюка   71178На основе ETH 157
TTXAscent ScientificAsc-055Ингибитор потенциал-зависимых Na+ каналов; ОСТОРОЖНО токсичная
вода, ультра чистаяSigma aldrichW3500 
пипетке назначения на заказ

Ссылки

  1. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  2. Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space. Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).
  3. Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex. J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).
  4. Rice, M. E., Nicholson, C. Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum. Neuroscience. 38, 295-310 (1990).
  5. Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex. Brain Res. 50, 489-495 (1973).
  6. Deitmer, J. W., Rose, C. R. pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).
  7. Chesler, M. Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).
  8. Kofuji, P., Newman, E. Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , Springer. (2009).
  9. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).
  10. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).
  11. Stephan, J., et al. Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ. Glia. 60, 965-978 (2012).
  12. Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. Microelectrodes. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).
  13. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).
  14. Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  15. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain. J Neurosci Res. , (2014).
  16. Pumain, R., Heinemann, U. Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex. J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).
  17. Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord. J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).
  18. Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices. J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).
  19. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322, 1551-1555 (2008).
  20. Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity. Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).
  21. Zanotto, L., Heinemann, U. Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats. Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).
  22. Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells. J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).
  23. Ammann, D., Anker, P. Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies. Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).
  24. Deitmer, J. W., Schlue, W. R. Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump. Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).
  25. Schwiening, C. J., Thomas, R. C. Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones. J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).
  26. Chesler, M., Kraig, R. P. Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).
  27. Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).
  28. Deitmer, J. W. Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells. Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).
  29. Lux, H. D. Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS. Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).
  30. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  31. Chesler, M., Chan, C. Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum. Neuroscience. 27, 941-948 (1988).
  32. Thomas, R. C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones. J Physiol. 220, 55-71 (1972).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление


Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 5/10/2016. Citeable Link.

An author's middle initial was omitted from the publication, Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. The author's name has been updated to:

Christine R. Rose

from:

Christine Rose

Теги

Похожие статьи