Ферментативные микроэлектродные биосенсоры позволяют измерять в режиме реального времени внеклеточную клеточную сигнализацию в биологически значимых концентрациях. Следующие протоколы расширяют возможности применения биосенсоров для обнаружения АТФ и Н2О2 в почках ex vivo и in vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование ферментативного биосенсоров для Количественно эндогенного АТФ или H
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ферментные биосенсоры микроэлектродные широко используются для измерения внеклеточных сигнальных в режиме реального времени. Большинство их использование было ограничено срезах мозга и культурах клеток нейронов. В последнее время эта технология была применена в целых органов. Достижения в конструкции датчика сделали возможным измерение клеточной сигнализации в крови-перфузии в естественных почек. Список Настоящие протоколы шаги, необходимые для измерения АТФ и H 2 O 2 сигнализации в интерстиции почек крыс. Два отдельных конструкций датчиков используются для экс виво и ин виво протоколов. Оба типа датчика покрыта тонким ферментативной бислоя на вершине селективной проницаемости слоя, чтобы дать малым временем отклика, чувствительный и селективные биосенсоры. Селективна проницаемость слой защищает сигнал от мешающих в биологической ткани, а также ферментативное слой использует последовательный каталитическую реакцию глицерина киназы и глицерол-3-фосФейт оксидазы в присутствии АТФ, чтобы произвести H 2 O 2. Набор датчиков, используемых для экс естественных условиях исследования дальше обнаружено анализируемого окислением H 2 O 2 на платиновом / иридий (Ir Pt-) провода электрода. Датчики для исследований в естественных условиях, а не на основе являются по сокращению H 2 O 2 на посредника покрытием золотого электрода, предназначенного для крови-перфузии тканей. Окончательные изменения концентрации обнаруживаются в реальном времени амперометрии последующим калибровки от известных концентраций анализируемого вещества. Кроме того, специфичность амперометрического сигнала может быть подтверждена путем добавления ферментов, таких как каталаза и апиразы которые расщепляют Н 2 О 2 и АТФ, соответственно. Эти датчики также в значительной степени полагаться на точных калибровок до и после каждого эксперимента. Следующие два протокола установления изучение режиме реального времени обнаружения АТФ и H 2О 2 в тканях почек, и может быть дополнительно модифицированы, чтобы расширить описанного способа для использования в других биологических препаратов или целых органов.
Введение
Ферментативный микроэлектродные биосенсоры (также ссылается в качестве датчиков в настоящем рукописи) были ценным инструментом для изучения динамических процессов сигнализации в живых клеток и тканей. Датчики обеспечивают повышенную временную и пространственную разрешающую способность сигнальных молекул клеточных биологически значимых концентрациях. Вместо отбора проб и анализа внеклеточной жидкости, принимаемые с интервалами в течение длительных периодов времени, эти датчики реагируют так быстро, как их ферменты реагируют с анализируемым, тем самым производя измерения в реальном времени 1,2. Быстрое обнаружение интерстициальных концентраций аутокринных и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Следующие процедуры животных придерживались Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных. До утверждения была получена из уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор инструкциями изготовителя датчика должно быть сделано во время проектирования эксперимента и до их использования. Следуя этим инструкциям будет производить оптимальные результаты при использовании датчиков.
1. Калибровка датчика
- Готовят свежие растворы перед началом эксперимента.
- Создание буфера А, содержащего 10 мМ буфера Näpi, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 и 2 мМ глицерина. Доводят ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дизайн ферментативной микроэлектродов биосенсора позволяет обнаруживать в реальном времени анализируемых веществ в целых почек. Общий дизайн эксперимент либо экс естественных условиях или в естественных условиях исследования показано на рис 1 .the датчиков, используемых и хирургические процедуры различаются в зависимости от того, в исследовании является экс естественных условиях или в естественных условиях.
Для получения воспроизв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Настоящие протоколы были разработаны для обеспечения повышенной временное и пространственное разрешение АТФ и Н 2 О 2 сигнализации для экс естественных изолированных, перфузии и в естественных условиях кровь перфузии почек. Различия между протоколами и датчиков, используемых здесь обеспечивают оптимальную сбора данных либо для фармакологических агентов или физиологических исследований. Протоколы состоят из 1) калибровки датчика, 2) хирургическая процедура, 3) Настройка сбора данны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Датчики для записи видео этой рукописи были предоставлены Sarissa биомедицинской Limited (Ковентри, Великобритания).
Благодарности
Мы ценим Sarissa Biomedical для их работы в разработке датчиков, используемых в настоящем рукописи. Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL108880 (А. Staruschenko), HL 116264 (А. Коули) и HL 122662 (А. А. Staruschenko и Коули), проект финансируется в Медицинском колледже Комитет ГУ МВД Висконсин # 9306830 (О. Palygin) и Продвижение программу исследований и образования здоровой Висконсин # 9520217, и молодых исследователей Грант Национального фонда почек (О. Palygin).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект датчиков | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | В комплект входит бутылка для хранения, камера для регидратации, электродные провода и электроды сравнения. Также в комплект входит выбор датчиков по выбору пользователя. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | хранить в 2-8 oC перед использованием |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | хранить при 2-8 oC перед использованием |
| Sarissaprobe null sensor 125 μ m | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | хранить при 2-8 oC перед использованием |
| Sarissagold null sensor 50 μ m | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | хранить в 2-8 oC перед использованием |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Двухканальный потенциостат | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Клетка Фарадея Программа |
| сбора данных | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Перфузионный насос | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Волоконно-оптический осветитель | Schott | ACE 1 | |
| микроманипулятор | Narishige | MM-3 | |
| микроманипулятор магнитная стойка | Narishige | GJ-8 | |
| воздушный стол | TMC | 63-500 | |
| изофлуран аппарат искусственной вентиляции легких | LEI Medical | M2000 | |
| 3 мл чашка Петри | Fisher Scientific | S3358OA | |
| игла | Santa Cruz | 26-30 G | |
| штифты | Стандартные штифты для вскрытия | ||
| катетер | Полиэтиленовая трубка (PE50) | ||
| катетер тканевый клей | Vetbond | 1469SB | |
| шовный материал | Look | SP117 | |
| резинки | любые шириной 2-4 мм | ||
| резинки силикон | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| для препарирования | В комплект должны входить скальпель и диссекционные сиссоры | ||
| Чашка | собственной разработки | ||
| стандартные химикаты | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 мМ раствор АТФ |
| перекись водорода | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| глицерин | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Апираза | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Каталаза | Sigma-Aldrich | C40 | |
| изофлуран | Clipper | 10250 | |
| инактин | Sigma-Aldrich | T133 | |
| кетаминовый | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
Ссылки
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for con....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
