Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование ферментативного биосенсоров для Количественно эндогенного АТФ или H

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53059

⸱

12 октября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

Ферментативные микроэлектродные биосенсоры позволяют измерять в режиме реального времени внеклеточную клеточную сигнализацию в биологически значимых концентрациях. Следующие протоколы расширяют возможности применения биосенсоров для обнаружения АТФ и Н2О2 в почках ex vivo и in vivo.

Аннотация

Ферментные биосенсоры микроэлектродные широко используются для измерения внеклеточных сигнальных в режиме реального времени. Большинство их использование было ограничено срезах мозга и культурах клеток нейронов. В последнее время эта технология была применена в целых органов. Достижения в конструкции датчика сделали возможным измерение клеточной сигнализации в крови-перфузии в естественных почек. Список Настоящие протоколы шаги, необходимые для измерения АТФ и H 2 O 2 сигнализации в интерстиции почек крыс. Два отдельных конструкций датчиков используются для экс виво и ин виво протоколов. Оба типа датчика покрыта тонким ферментативной бислоя на вершине селективной проницаемости слоя, чтобы дать малым временем отклика, чувствительный и селективные биосенсоры. Селективна проницаемость слой защищает сигнал от мешающих в биологической ткани, а также ферментативное слой использует последовательный каталитическую реакцию глицерина киназы и глицерол-3-фосФейт оксидазы в присутствии АТФ, чтобы произвести H 2 O 2. Набор датчиков, используемых для экс естественных условиях исследования дальше обнаружено анализируемого окислением H 2 O 2 на платиновом / иридий (Ir Pt-) провода электрода. Датчики для исследований в естественных условиях, а не на основе являются по сокращению H 2 O 2 на посредника покрытием золотого электрода, предназначенного для крови-перфузии тканей. Окончательные изменения концентрации обнаруживаются в реальном времени амперометрии последующим калибровки от известных концентраций анализируемого вещества. Кроме того, специфичность амперометрического сигнала может быть подтверждена путем добавления ферментов, таких как каталаза и апиразы которые расщепляют Н 2 О 2 и АТФ, соответственно. Эти датчики также в значительной степени полагаться на точных калибровок до и после каждого эксперимента. Следующие два протокола установления изучение режиме реального времени обнаружения АТФ и H 2О 2 в тканях почек, и может быть дополнительно модифицированы, чтобы расширить описанного способа для использования в других биологических препаратов или целых органов.

Введение

Ферментативный микроэлектродные биосенсоры (также ссылается в качестве датчиков в настоящем рукописи) были ценным инструментом для изучения динамических процессов сигнализации в живых клеток и тканей. Датчики обеспечивают повышенную временную и пространственную разрешающую способность сигнальных молекул клеточных биологически значимых концентрациях. Вместо отбора проб и анализа внеклеточной жидкости, принимаемые с интервалами в течение длительных периодов времени, эти датчики реагируют так быстро, как их ферменты реагируют с анализируемым, тем самым производя измерения в реальном времени 1,2. Быстрое обнаружение интерстициальных концентраций аутокринных и паракринных факторов, как пуринов или перекиси водорода, и динамика их выпуска могут быть использованы для создания профиля для эффектов лекарственных средств в нормальных и патологических условиях 3. В настоящее время большинство приложений, использующих датчики были в мозговых срезах тканей и клеточных культур 4-10. Протоколы, описанные в этой рукописи цельюсоздавать средства для точного измерения в реальном времени концентрации анализируемых веществ в целых почек.

Следующие протоколы были разработаны для изучения интерстициальный АТФ и Н 2 О 2 сигнализации в почках. В родной среде почки, внеклеточный АТФ быстро катаболизируется эндогенными ectonucleotidases в его производных (АДФ, АМФ и аденозина). Датчики, используемые здесь, обладают высокой селективностью к АТФ по сравнению с другими пуринов или АТФ продуктов разложения 11. Это дает большое преимущество, так как позволяет точный мониторинг постоянных и динамических концентраций выпуска АТФ и ее функции сигнализации. Интерстициальный АТФ концентрация измеряется с использованием сочетания двух микроэлектродов, датчик АТФ и Null датчик. Нулевой датчик в сочетании с приложениями каталазы в состоянии обнаружить интерстициальный H 2 O 2 концентрации 12. Следующие протоколы используют два различных конструкций SensoRS, которые имеют характеристики оптимальных для экс либо естественных или в естественных условиях применения.

Обе конструкции на основе последовательного каталитической реакции глицерина киназы и глицерол-3-фосфат-оксидазы, содержащейся в датчик ферментативного слоя и приводится в присутствии АТФ. В наборе датчиков, используемых в Экс Vivo исследований, H 2 O 2, окончательный ферментативного продукта реакции, обнаружено окислением на платиновом / иридий (Ir Pt-) провода электрода. Датчики для исследований в естественных условиях, а не на основе являются на H 2 O 2 на снижение посредника покрытием золотого электрода, предназначенного для крови-перфузии тканей. Показанный на рисунке 1 представлена ​​схема обоих протоколов, описанных в этой рукописи. Нулевой датчик идентичен соответствующей датчика АТФ за исключением того, не хватает связанные ферменты. Таким образом, в дополнение к обнаружению H 2 O 2 с ферментом каталаза, Нулевой MEA датчикаSures неспецифические помехи. Концентрации АТФ рассчитывается путем вычитания Нулевой обнаружены неспецифические помехи и фоновый H 2 O 2 по сигналу датчика АТФ. Несколько датчиков также коммерчески доступны для обнаружения других аналитов в том числе аденозина, ionosine, гипоксантин, ацетилхолина, холин, глутамат, глюкозы, лактата, D-серин для бывших естественных условиях применения или аденозина, ionosine и гипоксантин для в естественных условиях, когда в паре с соответствующим Null Датчик.

Способность датчика для точного обнаружения аналитов зависит от правильного до и после калибровки 13. Это гарантирует, что анализ учитывает дрейфа чувствительности датчика, которое происходит во время использования в биологических тканях. Датчик имеет депо глицерина, который используется в качестве реагента в датчике ферментативных реакций. Если датчик не используется в ванной растворов, содержащих глицерин, он смоет течением времени. Короче гecording пояс, то необходимо минимизировать дрейф датчика. Кроме того датчик загрязнения эндогенными протеазами и белковых фрагментов может значительно уменьшить чувствительность датчиков 14.

Настоящее рукопись устанавливает использование ферментных биосенсоров для микроэлектродов экс естественных условиях и в естественных условиях подготовки в почках. В режиме реального времени анализируемого количественного обеспечивает беспрецедентную деталь клеточной сигнализации, которые могут выявить новые для понимания механизмов заболеваний почек и фармакологических агентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующие процедуры животных придерживались Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных. До утверждения была получена из уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор инструкциями изготовителя датчика должно быть сделано во время проектирования эксперимента и до их использования. Следуя этим инструкциям будет производить оптимальные результаты при использовании датчиков.

1. Калибровка датчика

  1. Готовят свежие растворы перед началом эксперимента.
  2. Создание буфера А, содержащего 10 мМ буфера Näpi, 100 мМ NaCl, 1 мМ MgCl 2 и 2 мМ глицерина. Доводят рН до 7,4 с помощью NaOH. Хранить при температуре 2-8 ° С.
  3. Использование концентрации АТФ акций (100 мм) хранили при -20 ° С, создать новый 10 мМ АТФ калибровочный раствор добавлением 10 мкл запаса до 90 мкл буфера А.
  4. Увлажняет датчик АТФ путем размещения его наконечник (рисунок 2) в тон регидратации камеру, содержащую буфер А, по крайней мере 10 мин при температуре 2-8 ° С.
    Примечание: После регидратации, датчики не должны подвергаться воздействию воздуха в течение более 20 секунд, или чувствительность датчика может быть уменьшено. Если длительные выдержки в воздухе, как ожидается, погрузить датчик кратко в растворе глицерина. Датчики могут быть использованы для различных экспериментов, но они должны произойти в тот же день в качестве датчика регидратации. Датчики могут быть сохранены в камере регидратации буфером А до 24 ч.
  5. Включите двойной потенциостата канала (рис 3) и начать системную запись программного обеспечения.
  6. Подготовка калибровочной камеры с 3 мл буфера А. Место электрода сравнения в калибровочной камеры. Возьмите каждый датчик от регидратации камеры, затем приложите его к манипулятору и вставьте его в калибровке камеры решения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартный силиконовым покрытием Петри в калибровочной камеры. Выполняйте все калибровки и улudies в клетке Фарадея на высокопроизводительной лабораторном столе воздуха для снижения шума сигнала во время записи амперометрии (рисунок 4). Калибровка лучше сделать как можно ближе к началу сбора данных, как это возможно. Для применения в естественных условиях оптимальное время для калибровки в течение периода восстановления животных после операции.
  7. Экс естественных калибровки
    1. Выполнение циклической вольтамперометрии в калибровочной камеры на велосипеде датчиков от -500 мВ до +500 мВ при скорости 100 мВ / с в течение 10 циклов. Это значительно повышает чувствительность датчиков. На рисунке 5 следов, наблюдаемых от 10 циклов.
    2. Поляризовать сенсоры +600 мВ после последнего цикла. Датчик тока будет распадаться на асимптоты. Устойчивый чтение достигается после минимум 5 мин. Запишите нулевой чтение.
  8. В естественных условиях калибровки датчика
    1. Не выполняйте циклической вольтамперометрии на естественных Senso вRS. Вместо этого, поляризовать датчик в калибровочной камеры в течение 30 сек до +500 мВ. Затем установите потенциостата 0 мВ и дайте датчик тока подняться на асимптоты. Датчик тока займет по меньшей мере 2 мин, чтобы асимптоты. Запишите нулевой чтение.
  9. Последовательно добавьте комплект количество раствора АТФ в камеру для получения калибровочной линии, охватывающей желаемый диапазон обнаружения. Раствор АТФ производит острый пик в сигнале датчика первоначально, после чего распада как АТФ, диффундирует равномерно по всей камере. Значения сигналов Запись только уровень сигнала стабилизировалась после каждого АТФ того. 6А и 7 показывают следы и предложил концентрации АТФ для обоих экс естественных условиях и в естественных условиях исследования, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы подтвердить селективность электродов с помощью мусорщиков из веществ. Настоящее протокол, используемый апираза для проверки специфичности датчика АТФ и каталазы для H <суб> 2 О 2 сигнала (рис 6В). Если препараты для введения, измерения их реакционной датчиками должно быть определено до начала исследования.
  10. Добавить 3 мкл апиразы из запаса 2 мг / мл (89 ООН / мг), чтобы проверить специфичность датчика АТФ (ток, произведенный путем применения АТФ должны свести к нулевому уровню (рисунок 7).
  11. Добавить 3 мкл каталазы из запаса 2 мг / мл (100 ООН / мг), чтобы проверить специфику нулевой датчика (ток, создаваемый H 2 O 2 приложение должно свести к нулевой чтения).

2. Животное хирургии для датчика исследований

  1. Хирургия для экс естественных условиях
    1. Обезболить экспериментального животного изофлураном (5% индукции, от 1,5 до 2,5% техническое обслуживание) / медицинского класса O 2 или другого утвержденного метода. 15 '12 Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Улицасостоянии дыхательной скорость реакции и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
      Примечание: Эвтаназии животное в соответствии с утвержденными протоколами IACUC. По завершении всех процедур, не выживания эвтаназии глубоко анестезировали животных торакотомии вызывая пневмоторакс, чтобы обеспечить гуманное кончину животного 12.
    2. Поместите крысу на контролируемой температурой операционном столе в положении лежа на спине. Сохраняя правильную глубину анестезирующего, сделать срединный разрез приблизительно 5 см в соответствии с левой почки и выставить дистального брюшной аорты.
    3. Оберните лигатуры вокруг целиакией и брыжеечных артерий превосходными, и брюшной аорты выше этих артерий, но не перевязывать. Обертка два лигатуры вокруг брюшной аорты ниже почечных артерий.
    4. Зажмите брюшной аорты выше лигатуры. Свяжите нижнюю лигатуры. Катетер брюшной аорты с полиэтиленовой трубкой (PE50). Закрепите катетер со второй аорты лигатуры,
    5. Снимите зажим и перевязывать брыжейки и целиакией артерии. Заливать почку на 6 мл / мин с Hanks Balanced Salt Solution при комнатной температуре в течение 2-3 мин, пока почки не полностью побледнел.
    6. Акцизный почку и катетер, соединенный часть аорты. Поместите почку в 3 мл чашке Петри заполнены раствором ванны.
      Примечание: Протокол эксперимента могут быть выполнены при комнатной температуре. Решение ванна содержит в мм: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl 2 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, рН 7,35 регулируется NaOH.
  2. Хирургия для в естественных условиях
    1. Обезболить крысу, используя утвержденные протоколы IACUC. Для анализа в естественных анестезию крыс с кетамином (20 мг / кг внутримышечно) и Инактин (50 мг / кг внутрибрюшинно). Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Стабильная скорость реакции дыхательной и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
    2. После надлежащего глубина анестезии получитьред поместите крысу в лежачем положении на регулируемой температурой заземленной поверхности, расположенной на столе воздуха. Поверхность должна быть предварительно нагревали и поддерживали при 36 ° С.
    3. В то время как поддержание надлежащего глубину анестезирующего, сделать срединный разрез приблизительно 5 см в соответствии с почками.
    4. Используйте шов, чтобы отвлечь и якорь кожный и подкожные ткани, так что весь почки видна. Поместите почку в чашке почек, чтобы минимизировать любые артефакты движения.
    5. Использование внутривенной инфузии 2% BSA: 0,9% NaCl в 1 мл / 100 г / ч через яремную вену для поддержания объема крови. Иглу как мочеточники для сбора мочи. Место галстуки вокруг верхней брыжеечной артерии и целиакией и дистальной аорты для манипуляции почек давления перфузии (рис. 10А)
    6. Если применение фармакологических агентов требуется в ходе экспериментов в естественных условиях, вставка из интерстициального катетера рекомендуется (цифры 10B ).

Настройка 3. Сбор данных

  1. Откройте программу сбора данных и установить его полярность для обоих экс естественных условиях и в естественных экспериментов в анодной Позитивный. Установите программу для сохранения данных в качестве кода ASCII.
  2. Расположите микроманипуляторами для быстрой вставки из датчиков в почки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте фиктивный зонд, прикрепленный к микроманипулятора, чтобы помочь достичь желаемого размещение датчиков.
  3. Экс естественных сбора данных
    1. Заливать почку раствором ванны (с 2.1.6) через канюлированную аорты с постоянной скоростью 650 мкл / мин. Использование хирургические ножницы, аккуратно снимите капсулу почки, которая необходима для установки сенсора.
    2. Безопасный почку с резинками, привязанными за почки и подключенных к силиконовым покрытием блюдо с булавками.
    3. Поместите электрод близко к почке в чашке Петри с его кончик погружен вбуферный раствор.
  4. В естественных условиях приобретения данных
    1. Поместите почку в чашке почек. В зависимости от штамма и возраста животного использовать размер чашки, который содержит почки слабо. Рисунок 8 показывает два размера чашки почек. Похожие чашки используются для различных физиологических подходов, ориентированных на анализ функции почек, таких как micropuncture т.д. 16.
      Примечание: Положение чашку почек имеет решающее значение для удаления механических шумов, производимых животных дыхания, но не должен мешать или блокировать перфузии почек или поток мочи.
    2. Разрешить 45 мин времени восстановления перед выполнением сбора данных.
    3. С помощью иглы 26-30G, сделать отверстие прокола в нужном месте и глубине датчика в почках. Промокните поверхность отверстие для удаления выделяющихся кровь. Добавить растворе глицерина на поверхности почки. Это позволит предотвратить поверхность почки от высыхания во время эксперимента.
    4. Удалить первый датчик от регидратации камеры и прикрепить ее к микроманипулятора. Быстро, в течение 20 сек, вставить электрод в только что созданном отверстие в почках. Повторите шаги 3,5-3,9 для нулевого датчика.
    5. Вставьте электрод в почках, около 1 см от от датчиков.
  5. Включите потенциостата и активировать программу записи на компьютере. Рисунок 9 показывает конечный настройку экс естественных условиях приобретения данных почек. Рисунок 10 показывает конечный настройку в естественных условиях приобретения данных с почечной вставленной катетера.

Анализ данных 4.

  1. Импорт файла данных ASCII в происхождения или любого другого аналогичного программного обеспечения.
  2. Концентрация тока отношение
    1. Используйте линейную функцию подходят / экстраполировать построить линейную концентрацию (ось х) для тока (ось Y) отношения в АТФ или H 2 калибровки O 2 точки (6 и 7).
      линейная подгонка линия: у = х + Ь
  3. Приравнять ток концентрации
  4. Вычитание измеренных следы датчика нулевой от датчика АТФ, чтобы получить фактический ток, создаваемый внутриклеточного АТФ.
  5. Преобразование значения АТФ в Па полученные амперометрии в нМ при помощи уравнения калибровки, описанную в 4.2.1. Определить концентрацию вычитается следа данных датчика АТФ путем импорта каждого доводитс тока в значение "х" и решения для у (концентрации анализируемого вещества).
  6. Аналогичным образом, вычислить H 2 O 2 концентрации от ее уравнение калибровки, если это необходимо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Дизайн ферментативной микроэлектродов биосенсора позволяет обнаруживать в реальном времени анализируемых веществ в целых почек. Общий дизайн эксперимент либо экс естественных условиях или в естественных условиях исследования показано на рис 1 .the датчиков, используемых и хирургические процедуры различаются в зависимости от того, в исследовании является экс естественных условиях или в естественных условиях.

Для получения воспроизв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящие протоколы были разработаны для обеспечения повышенной временное и пространственное разрешение АТФ и Н 2 О 2 сигнализации для экс естественных изолированных, перфузии и в естественных условиях кровь перфузии почек. Различия между протоколами и датчиков, используемых здесь обеспечивают оптимальную сбора данных либо для фармакологических агентов или физиологических исследований. Протоколы состоят из 1) калибровки датчика, 2) хирургическая процедура, 3) Настройка сбора данны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Датчики для записи видео этой рукописи были предоставлены Sarissa биомедицинской Limited (Ковентри, Великобритания).

Благодарности

Мы ценим Sarissa Biomedical для их работы в разработке датчиков, используемых в настоящем рукописи. Это исследование было поддержано Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL108880 (А. Staruschenko), HL 116264 (А. Коули) и HL 122662 (А. А. Staruschenko и Коули), проект финансируется в Медицинском колледже Комитет ГУ МВД Висконсин # 9306830 (О. Palygin) и Продвижение программу исследований и образования здоровой Висконсин # 9520217, и молодых исследователей Грант Национального фонда почек (О. Palygin).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Комплект датчиковSarissa BiomedicalSBK-ATP-05-125В комплект входит бутылка для хранения, камера для регидратации, электродные провода и электроды сравнения. Также в комплект входит выбор датчиков по выбору пользователя.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-ATP-05-125хранить в 2-8 oC перед использованием
Sarissagold ATP Biosensor 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-ATP-10-50хранить при 2-8 oC перед использованием
Sarissaprobe null sensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-NUL-20-125хранить при 2-8 oC перед использованием
Sarissagold null sensor 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-NUL-10-50хранить в 2-8 oC перед использованием
Sarissaprobe ATP ManualSarissa Biomedicalhttp://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage TMC
Двухканальный потенциостатDigi-IvyDY2021Type II Клетка Фарадея Программа
сбора данныхDigi-IvyDY2000
Перфузионный насосRazel Scientific InstrumentsModel R99E
Волоконно-оптический осветительSchottACE 1
микроманипуляторNarishigeMM-3
микроманипулятор магнитная стойкаNarishigeGJ-8
воздушный столTMC63-500
изофлуран аппарат искусственной вентиляции легкихLEI MedicalM2000
3 мл чашка ПетриFisher ScientificS3358OA
иглаSanta Cruz26-30 G
штифтыСтандартные штифты для вскрытия
катетерПолиэтиленовая трубка (PE50)
катетер тканевый клейVetbond1469SB
шовный материалLookSP117
резинкилюбые шириной 2-4 мм
резинки силиконMomentiveRTV-615 Clear 1#
clampFine Science Tools18052-03
для препарированияВ комплект должны входить скальпель и диссекционные сиссоры 
Чашкасобственной разработки
стандартные химикатыSigma-Aldrich
ATPSigma-AldrichA6559-25UMO100 мМ раствор АТФ
перекись водородаSigma-Aldrich216763
глицеринSigma-AldrichG9012
АпиразаSigma-AldrichA7646
КаталазаSigma-AldrichC40
изофлуранClipper10250
инактинSigma-AldrichT133
кетаминовыйClipper2010012
Hanks Balanced Salt Solution Gibco14025092
стандартный набор для почек

Ссылки

  1. Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
  2. Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
  3. Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
  4. Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
  5. Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
  6. Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
  7. Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
  8. Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747(2014).
  9. Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
  10. Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
  11. Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
  12. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
  13. Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
  14. Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
  15. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  16. Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
  17. Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).
  18. Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
  19. Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
  20. Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
  21. Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
  22. Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
  23. Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
  24. Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
  25. Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
  26. Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
  27. Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
  28. Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

H2O2ex vivoin vivo
Использование ферментативного биосенсоров для Количественно эндогенного АТФ или H
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.