Исследования развития нёба мотивированы заболеваемости нёба, врожденным дефектом, что накладывает огромное бремя для здоровья и может оставить прочный увечья. Мы демонстрируем здесь технику к культуре небных полки, которые могут быть использованы для изучения различных сигнальных путей, участвующих в развитии небной и слияния.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод исследования небных Fusion использует статический органной культуре
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Заячья губа и Вкус являются одними из наиболее распространенным из всех врожденных дефектов. Вторичные нёба формы из мезенхимальных полках, покрытые эпителием, что придерживается формирования срединной линии эпителия шов (МЭС). Теории предполагают, что ЭСК следовать эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT), апоптоза и миграции, делая слитый небо 1. Полный распад МЧС является окончательным важным этапом небного слияния с окружающей мезенхимальные клетки. Мы предлагаем способ неба органной культуре. Разработанная в протоколе экстракорпорального позволяет изучение биологических и молекулярных процессов во время слияния. Приложения этой техники являются многочисленными, в том числе оценке реакции на экзогенные химические вещества, воздействию нормативных и факторов роста и специфических белков. Небных культура орган имеет ряд преимуществ, включая манипуляции на разных стадиях развития, что не возможно при использовании в естественных исследований.
Введение
Орофациальные щели являются наиболее преобладающие черепно-лицевые врожденные дефекты. Кроме того, принимая во внимание все возможные дефекты черепно-лицевых, это второй наиболее распространенной аномалией рождении у новорожденных 2. Расщелиной неба возникают примерно в 1 из каждых 700 рождений в Соединенных Штатах Америки (США) каждый год заболеваемость нёба равна 475 детей, рожденных с расщелиной неба в месяц или 15 детей с расщелинами в день 3. Примерно 1% детей рождается во всем мире каждый год, обнаруживают некоторую форму черепно дисморфологии.
Трещины на небе и губы нужно очень дорогое и сложное процедуру с пожизненными последствиями для пациентов, которые имеют эту аномалию. Ориентировочная стоимость для каждого пациента с устным щели примерно $ 100,000 4. Лечение пациента с расщелиной губы и неба требует команда врачей, включая черепно-лицевых хирургов, оториноларингологов, генетиков, анестезиологов,Речь языке патологи, диетологи, ортодонты, prosthodontists, психологи, нейрохирурги, офтальмологи и.
В palatogenesis, то вторичное нёбо возникает парных выростов, которые изначально растут вертикально и проходят небной повышение годности выше спинки языка. После возвышения, парные небные в полки расти к средней линии (в E14.5 -E15 у мышей и неделю 9 в человека). Медиальный край эпителий (МЭА), которое охватывает наконечник годности придерживается формирования срединной линии эпителия шов.
Это сопровождается эпителиальных к мезенхимальных перехода и / или апоптоза, чтобы мезенхимальных слияния. Адгезия противной МЕЕ является важным событием которого изменение вызывает нёба. Тем не менее, лишь немногие исследования исследовали начальную адгезию небных полках 5. Твердое небо формы по дифференциации мезенхимальных клеток в остеобласты. Аномальная развитие неба может производить Клефт неб с или без участия губ.
Методы Вкус органов культуры были широко используется на протяжении многих лабораториях в течение последних 30 лет 6,7.
В этом протоколе мы опишем в деталях метод рассечения небной и статического органной культуры. Преимущество неподвижной органной культуры является то, что она позволяет небные полки на предохранитель. Этот метод был успешно использован в нашей лаборатории в течение многих термоядерных и сигнализации экспериментов 8,9. Однако объем техники обширна и может быть использован, когда система статического органной культуре требуется, включая оценку реакций на экзогенные химические агенты, эффекты регуляторных факторов роста в различных путей и специфических белков.
Рисунок 1. Мышь Palatogenesis. Стадии развития мышей неба. (БФ) Сканирование элеctron микрофотографии (SEM) вторичного нёба в представительных раз в развитии. Красные стрелки показывают: первоначальную часть небной адгезии и слияния. Желтые стрелки: Точка в пространстве между первичными и вторичными гурманов, которые исчезают после слияния (перепечатано из Kaufman 11 с разрешения PLoS One).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения местного Комитета Уходу за животными и использование.
1. Подготовка рассекает инструменты и культуры Медиа
- Предварительной стирки все инструменты, которые будут использоваться в диссекции с 3% перекиси водорода, а затем автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Фильтр BGJb СМИ с антибиотиками и противогрибкового раствора с использованием размера пор фильтра с вакуумным всасыванием в капюшоне 0,22 мкм.
2. Подготовка культуры оборудование
- Вырезать из поликарбоната мембранные фильтры, которые будут поддерживать небные органы в небольших треугольников, спрей с 70% -ным спиртом и дайте им высохнуть. Подготовка Центр-Ну органной культуре блюдо (60x15 мм) путем размещения чистую и стерилизованную равносторонний треугольный проволочной сетки (20 мм) над органной культуры пластины. Затем заполните колодец с 1 мл ВGJB медиакультуры СМИ. ПРИМЕЧАНИЕ: СМИ должны быть достаточными для достижения уровня сетки, не погружая вкусы. Поместите мембранные фильтры, блестящей стороной вниз, на верхней части сетки (3-4 мембраны в сетке) .Depending на эксперимента, лечение (белки, антитела или ингибиторы) могут быть добавлены в средствах массовой информации
3. эмбриона мыши Сбор и подготовка по культуре
- Чтобы получить диких эмбрионов мыши типа, использование приурочен 13,5 беременную компакт-1 мыши генетический фон штамма. Очистите рассечение зона с 70% этанола.
Примечание: Другие штаммы мышей могут быть использованы. Мы предпочитаем CD-1 мышей из-за большего количества мусора. - Эвтаназии беременных мышей на E13.5 DPC (дней после полового акта) с 5% Isoflurane последующим смещением шейных позвонков, чтобы застраховать смерть с использованием утвержденных протоколов.
- Спрей 70% этанола на брюшной брюшной поверхности, чтобы избежать брюшной волос палку к инструментам. Затем откройте брюшной полости вентральноИспользуя острый тупой-эксплуатационные ножницы и микро-рассечение пинцет, чтобы найти матку. Используя пинцет, поднимите весь матку и отделить его от тела за счет сокращения на теле матки и на кончиках рогов матки с легкой эксплуатации ножниц.
- Поместите матку на чистую бумажным полотенцем со льдом (По словам гида протокола для ухода и использования лабораторных животных). Обложка матку с другом чистым бумажным полотенцем, чтобы предотвратить загрязнение. Стерилизовать инструменты, используя 70% этанола спрей перед дальнейшим использованием. Матка и эмбрионы могут быть доставлены в лабораторию на льду.
- В открытом капоте ламинарного потока, тщательно сделать небольшое отверстие в желточного мешка с использованием острыми тупым операционные ножницы и микро-рассечение пинцет. Сделать открытие шире и затем слегка прижмите его к экстериоризоваться эмбрион от желтка.
- Передача эмбрионы сразу в чашку Петри с холодной фосфатно-солевом буфере 1X (PBS), рН 7,4. Для обеспечения надлежащего этап, эксамин эмбрион под микроскопом рассекает на тела, размер головы и конечностей морфологии.
Примечание: Эмбрионы, которые не в нужное стадии развития не использовали для эксперимента.
Рисунок 2. конечностей Бад Морфология. Передняя и задние конечности проверяются на соискание ученой степени лямки отступа между цифрами. В E13.5, все цифры сгущения заметным, с лямки и дистальных углубления между цифрами появляются очень различны. Задние цифры позади полдня 12 Верхний ряд:. Передней конечности, нижний ряд: задних конечностей.
4. Вкус Рассечение
- Поместите один зародыш одновременно в чашке Петри с PBS при вскрытии микроскопом. Использование маленькие ножницы и пинцет Препаровальный отделить голову от тела эмбрионов.
- Осторожно держа череп мыши над уровнем глаз с щипцами (избегаяверхнечелюстной процесса) сделать два разреза на обеих сторонах линии губ. Затем снимите нижнюю челюсть и язык. Изолировать верхнечелюстной области процесса, сделав разрез на уровне глаз и удалить мозг, глаза, носовую перегородку и прилегающей ткани.
Рисунок 3. Вкус ткани собраны с 13,5 эмбрионов, когда нёбо полки были повышены, но не вступили в контакт. Небной полки были помещены в органной культуре на фильтре на границе воздушной среде в течение 72 ч в статической модели. (А) Уровень рассечение на E13.5 эмбриона. (Б) Голубой Звезды разграничить области провести ткани с щипцами во время вскрытия. (C) Вид расчлененных небных полках, расположенных на трапеции мембраны фильтра. (D) Боковой вид культуры блюдо после размещения расчлененный вкусы и добавление питательных сред.
- Поместите небной устное стороной вверх и снимите носовой перегородки и ткани вокруг нее, сохраняя основной вкус придает помочь ориентировать его от задней к передней. Используйте ложку шпателем и тщательно передать небные полки (носовые стороной вниз) на подготовленные фильтров на сетках в культуре блюда. ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка громкости СМИ для обеспечения надлежащего интерфейса воздушных средств массовой информации.
- Под стереомикроскопа, рассекают основной вкус и использовать пинцет, чтобы разместить небной полки близко друг к другу. Небной полки не расплавится, если они не находятся в контакте. Вырезать треугольную мембранный фильтр, где передняя часть неба находится. Форма трапеции поможет в локализации переднюю часть нёба.
- Культура небные полки по отдельности или с двумя или тремя в той же органной культуры блюдо использованием BGJb культуральной среды.
5. Культивирование мыши небных Полки
- Выдержите TissuES при 37 ° С в увлажненной газовой смеси (5% СО 2 и 95% воздуха) в течение 72 ч, а также изменить среду каждые 24 ч.
6. Вкус обработки для гистологического анализа
- Исправление вкусы после 72 ч в культуре с 4% формальдегида / фосфатно-солевом буфере O / N при 4 ° С. Затем осторожно пипетки мыть ткани в культуральной чашке с PBS. Оберните гурманов в кусок лабораторных салфеток и место в встраивания кассеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Упаковка вкусы в лабораторных салфеток предотвратить их потерю в процессе дегидратации. - Дегидрировать ткани после 70%, 80% и до 100% этанола моет в течение 1 часа, после чего в обычном порядке в парафин. Для встраивания, устанавливайте переднюю часть нёба, обращенной лоток.
- Вырезать последовательных 6 мкм разделы в корональной ориентации от передних к задним. Полный раздел небо даст 350-450 sectiДополнения. Пятно секции гематоксилином и эозином (Н & Е). 10 баллов каждый 20-й секции с использованием ранее описанной Среднее Fusion результат (МФС) Шкала (Таблица 1). 8
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Техника может быть применена к различным видам experiments.The следующего исследования была разработана, чтобы проверить тератогенным эффектом никотина в пробирке на небной слияния. Два штамма мышей были использованы для этого эксперимента, CD1 и C57.Palatal ткани обрабатывали 0,06 и 6 мМ концентраци х никотина полусульфата. Было отмечено, что небные шаблоны слияния и сроки были различны в двух разных штаммов. У мышей CD1, небные полки из контрольной группы продолжили сплав по времени зависимым образом...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол в этой статье предоставляет метод рассечения небные полки из эмбрионов на эмбриональной день 13,5. Небной полки из мышиных эмбрионов культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O 2 5% CO 2 при 37 ° С. Успешное небных рассечение критически зависит от нескольких факторов, на каждом шагу во время процедуры от эмбрионального время эвтаназии мышей до завершения культуры. Один из самых важных факторов, влияющих на небной слияние это время, необходимое для запуска органной культуры;...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
У авторов нет никаких благодарностей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| чашки Петри | VWR | 25384-088 | 100 x 15 мм |
| Центрально-луночная чашка для культуры органов | Falcon | #353037 | 60 x15 мм |
| Проволочная треугольная сетка | Изготовлена на заказ из проволочной сетки из нержавеющей стали, чтобы хорошо подогнать чашку для культивирования органов. | ||
| Поликарбонатный фильтр | GE& Водные и технологические технологии | K04BP04700 | черный 0,4 мкм, 47 мм |
| Стереомикроскоп | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| микрорассекающие щипцы | Dumont Medical | #5 | |
| Ножницы для микрорассечения | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Ножницы Vannas, прямые, длина 8 см, наконечники 0,1 мм, лезвия 5 мм, |
| микроножницы | Kent Scientific Corporation | INS500086 | ножницы Vannas, прямые, длина 8,5 см, наконечники 0,025 мм x 0,015 мм, лезвия 7 мм Ножницы |
| для микродиссекции | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Пружинные ножницы изогнутые изогнутые, длина 10,5 см, лезвия 8 мм, немецкое производство |
| Хирургический куррет (ложка шпатель) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector лабораторный капюшон | Labconco | ||
| Инкубатор | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 водяная куртка | |||
| CO2 инкубатор | |||
| ПБС | GIBCO | 10010-023 | В 1 раз |
| Волоконно-оптический источник света | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Встраиваемая кассета | Салфетки Statlab | EC301 | |
| Kim | VWR | 470173-504 |
Ссылки
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
