Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

Краткое содержание

Мы описываем высокопроизводительный анализ чувствительности к лекарствам для клеток первичной множественной миеломы. Он состоит из реконструкции микроокружения костного мозга (включая внеклеточный матрикс и строму) в многолуночных планшетах и неинвазивного метода продольной количественной оценки жизнеспособности клеток.

Аннотация

В этой работе мы описываем новый подход, который сочетает в себе Экс Vivo анализов чувствительности препарат и цифровой анализ изображения для оценки химиочувствительность и неоднородность множественной миеломы (ММ) клеток пациента, полученных. Этот подход состоит в посеве первичных клеток ММ недавно извлеченные из аспирации костного мозга в микрофлюидных камер, реализованных в нескольких луночных планшетах, каждый из которых состоит из реконструкции микросреды костного мозга, в том числе внеклеточного матрикса (коллаген или базальную мембрану матрицы) и стромы (на пациента мезенхимальных стволовых клеток) или эндотелиальные клетки человека, полученные (HUVECs). Камеры накачивают различных агентов и концентрациях и загружаются последовательно в течение 96 ч с помощью светлой микроскопии, в моторизованной микроскопа, снабженного цифровой камерой. Цифровой программного обеспечения для анализа изображений обнаруживает живых и мертвых клеток из наличия или отсутствия движения мембраны, и генерирует кривые изменений в жизнеспособности как функции ое концентрация препарата и время экспозиции. Мы используем вычислительную модель для определения параметров химиочувствительность населения опухоли на каждого препарата, а также количество групп населения, присутствующих в качестве меры опухоли неоднородности. Эти модели пациентом с учетом затем могут быть использованы для моделирования терапевтические режимы и оценить клинический ответ.

Введение

Цель этого метода заключается в характеристике чувствительности к лекарству множественной миеломы (ММ) первичные ячейки в панели агентов экс естественных условиях, как можно ближе к физиологическим условиям, и с достаточной точностью, что эти результаты могут быть использованы для идентификации химиорезистентных югу популяции в пределах опухолевой и, в конечном счете, параметризации вычислительные модели, предназначенные для оценки клинической реакции.

Вычислительные модели являются мощными инструментами для анализа сложных систем, таких как рак хост-терапии взаимодействий. Тем не менее, модели только так хорошо, как данные, испо....

Протокол

Использование человеческих клеток, полученных при биопсии, как описано ниже, утвержденных Экспертный совет Moffitt и проводимых под клиническом испытании МСС # 14745, проведенного в Ли Moffitt онкологического центра Х. и научно-исследовательского института.

1. Сортировка ММ клетки костного мозга аспирации,

1. Сбор аспираты костного мозга (20 мл) у пациентов в гепарина натрия шприца.
2. Изолировать мононуклеарных клеток центрифугированием разбавленный мозга (1: 1 со стерильным PBS) в течение стерильной водной среде центрифугирования градиента при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Соберите интерфей....

Результаты

Поток эксперимента кратко описан на фиг.1 Если все шаги выполнены успешно, изображения, полученные с помощью микроскопа, должны быть эквивалентны Рисунок 2:. Живые клетки ММ должны быть четко видно, как светлые диски и BMSCs или HUVECs должны быть едва заметны и хорошо распределены в фоновом режиме. Как видно на фиг.2А, клетки ММ в диапазоне размеров от одного пациента к другому, но в целом они меньше, чем клеточные линии. Поскольку они практически не повторить экс .......

Обсуждение

В целом, это мощный и высокий метод пропускная количественно химиочувствительность первичных клеток ММ и бывших естественных условиях фармакодинамики лекарственных средств в реконструкцию костного мозга. Критические шаги в рамках этого протокола собственно посев из скважин и адекватной фокусировки (рисунок 2 для ожидаемых результатов): убедитесь, что MM и стромальных клеток равномерно распределяется, что стромальные клетки приверженцем нижней части хорошо, что все ММ клетки находятся в одной фо.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
EVOS FL AUTO	AMG	+ AMC1000	Цифровой микроскоп, оснащенный моторизованным столиком и настольным инкубатором.
384-луночная пластина CellBind	CORNING CLS3683	SIGMA	Corning CellBIND 384-луночная пластина 384-луночная пластина, полистирол, поверхность CellBIND, стерильная, прозрачное плоское дно, черная, с крышкой
1,536-луночная пластина	CellBind CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536-луночная пластина, низкое основание, обработка поверхности CellBIND, стерильная
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	Для in vitro выделение лимфоцитов из периферической крови человека.
CD138 магнитные бусины	Miltenyi	130-051-301	Магнитные шарики, сопряженные антителами, для отбора CD138+ клеток.
Колонны LS	Miltenyi	130-042-401	Колонна для разделения ячеек.
Сепаратор MidiMACS	Miltenyi	130-042-302	Магнит для сепарационной колонны.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm Мышиная саркома
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-глютамин + фенол красный
FBS Термоинактивированная	GIBCO	10082-147	Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, термоинактивированная, происхождение США
3,1 мг/мл бычий коллаген тип I	Advanced Biomatrix	5005-B	Раствор бычьего коллагена, тип I, 3 мг/мл, 100 мл
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	роботизированная система пипеток

AMAFD1000