Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сократимость Измерения на изолированных папиллярных мышц по расследованию сердечной инотропию у мышей

14.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53076

⸱

17 сентября 2015 г.

 ,  , 
1Pharmakologisches Institut, Universität Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

Мышиные левого желудочка папиллярных мышц может быть использован для исследования сократительной способности сердца в пробирке. Эта статья подробно описывает выделение и экспериментальные протоколы для изучения сердечных характеристики сократительных.

Аннотация

Папиллярной мышцы изолированы от взрослых сердца мыши могут быть использованы для изучения сократительной способности сердечной мышцы во различных физиологических условиях / патологических. Сократительные характеристики могут быть оценены независимо от внешних воздействий, таких как сосудистого тонуса или нейрогуморальной статуса. Она изображает научного подхода между измерениями отдельных клеток с изолированными кардиомиоцитов и в естественных условиях исследования, как ЭхоКГ. Таким образом, препараты папиллярных мышц служить отличной моделью для изучения физиологии сердца / патофизиологии и может быть использован для исследований, таких как модуляции фармакологических агентов или разведки трансгенных животных моделях. Здесь мы опишем способ выделения мышиный левой передней папиллярной мышцы, чтобы исследовать сердечную сократимость в установке орган ванны. В отличие от препарата мышц полосы, выделенной из стенки желудочков, сосочковый мышц может быть получен в целом, не повреждая мышечную Tissuе строго. Установка орган ванна состоит из нескольких контролируемой температурой, газом и электродов, оборудованный орган ванны камер. Выделенный папиллярный мышц фиксируется в орган ванны камере и электрически стимулируется. Вызванных силы сокращений регистрируется с помощью датчика и параметры давления, например дергаться амплитуды силы и дергаться кинетика анализируются. Различные экспериментальные протоколы могут быть выполнены, чтобы исследовать кальциевые и частотно-зависимого сократимость, а также кривых доза-ответ сократительных агентов, таких как катехоламинов или других лекарственных препаратов. Кроме того, патологические состояния, такие как острой ишемии могут быть смоделированы.

Введение

Исследование белков ионных каналов, таких как относящихся свою роль в сократительной способности сердечной мышцы необходимо открыть различные pathomechanisms и установить новые терапевтические стратегии для сердечных заболеваний, таких как ишемия и сердечной недостаточности.

Сократительной функции кардиомиоцитов млекопитающих, как известно, можно модулировать с помощью различных ионных каналов, транспортеров и других белков. Действие потенциал вызвал активацию вольтзависимых сарколеммы L-типа Са 2+ каналов приводит к притоку Ca 2+ из внеклеточного пространства и впоследствии Ca 2+ -индуцированных Ca 2+ релиз (CICR) 1, который вызывает клеточный сокращение 2. Са 2+ -signaling играет центральную роль в сократительной способности сердечной мышцы и адаптации к физиологическим или патологическим стрессом. Катехоламины, включите сердечные бета-адренорецепторов, стимулируя тем самым аденилатциклазы (АЦ), который синтезирует цАМФ. Будучи активирован, PROTEIп киназы А (PKA) фосфорилирует различные внутриклеточные и мембранные белки, связанные как L-типа Ca 2+ каналов, phospholamban и рианодиновых рецепторов, в результате модификации Са 2+ и сердечной сократимости 1,3,4. цАМФ разрушается фосфодиэстеразы (ФДЭ). Активация GS-связанных, кроме бета-адренорецепторов рецепторов также приводит к накоплению цАМФ.

Методика измерений сократительной в изолированных полос желудочка мышц хорошо известна для крупных видов млекопитающих 5-8. Основываясь на возможность гена ориентации у мышей важно установить методы для анализа мышиного сердца физиологию. Тем не менее, имеющиеся данные о физиологических свойств изолированных мышечных препаратов в мышей различаются в зависимости от условий эксперимента 9-12.

Описанный метод используется для анализа сердечной сократимости левого желудочка папиллярных мышц предварительноparations в пробирке. Исследование сократительной способности сердечной мышцы осуществляется в отсутствие воздействий, модифицирующих сердечную сократимость в живом организме, как артериальное давление, нейрогуморальной стимуляции и физического или метаболического стресса. Скорость избиение подготовке контрактов мышц может быть строго определено и изменяться произвольно. Силы сокращений могут быть проанализированы в контексте конкретных стимулов, таких как кальций, концентрации бьется частоты или температуры. Кроме того, этот метод может быть использован для исследования различных компонентов сигнального пути и сравнить работу сердца генетически модифицированных мышах, управляя экспериментальные условия, упомянутые выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Основные этапы процедуры выделения показаны на рисунке 1 Все этапы подробно описаны в следующей методике.. Папиллярный изоляции мышц, монтаж в ванной органов камеры, сбор и анализ выполняется в последовательном и обязательного сроки.

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных и были одобрены этики обзору Совета университета Гейдельберга в.

1. Подготовка приборостроения

  1. Для измерения сократительной использовать многокамерного установки орган ванна. Компоненты экс естественных сократимости установки органной бани показаны на рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму количество времени между подготовкой папиллярной мышцы и начале экспериментального протокола, настроить оборудование и подготовить буферы до сбора экспериментальных tissue.This PROVIDES наибольшее количество времени, что ткань остается жизнеспособной проводить эксперименты.
  2. Запуск компьютера и сбора данных оборудования. Включите орган ванны тепла (предварительно до 32 ° C) и позволяют единиц в заданной температуры.
  3. Подготовка приобретение оборудования. Начало записи данных, как указано в руководстве по программному обеспечению.
  4. Проверка и проводить калибровку (при необходимости) на каждом канале и нулю для всех каналов с целью стандартизации электрического сигнала, подаваемого из соответствующего датчика силы (связанный с этим каналом) в 2-г силы, подаваемой в сертифицированной вес.
  5. Включите газоснабжения (95% O 2/5% CO 2) в орган, ванны камер. Постоянно газ все камеры в течение всего измерений протокола.

2. Подготовка буферов и физиологических растворах

  1. Приготовьте буферный раствор Кребса-достичь конечной концентрации 119 мм NaCl; 25 мМ NaHCO 3; 4.6 мМ КСl; 11mm глюкозы; 1 мМ Na-рyruvate; 1,5 мМ CaCl 2; 1.64 мМ MgSO 4; 1.18 мМ KH 2 PO 4 и отрегулируйте рН до 7,4 (табл 1 физиологический раствор).
  2. Подготовьте отдельный Кребса-буферный раствор для использования в процессе выделения, как описано в шаге 2.1 с дополнительным 30 мМ 2,3-бутандион моноксима (БДМ) и 50 Е. гепарин / мл. Прохладный решение 4 ° С (см таблицу 1 раствор препарата). Для моделирования ишемии, ишемии подготовить-решение, как описано в таблице 1.
  3. Для протокола Ca 2+ - зависимой сократимости, добавить Ca 2+ в буферном растворе Кребса-к запрашиваемой конечной концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: подготовить эти решения непосредственно перед его использованием и Гасс с карбогена, чтобы избежать осаждения карбонат кальция. Prewarm решение 32 ° C перед использованием.

3. Подготовка газообразования метро и расслоения Блюдо, используемой во время процедуры папиллярных иссечение

  1. Подключите мягкий газпеть трубу (внешний диаметр 2-4 мм) с соединением газа (100% кислорода, карбогена альтернативно) с экспертом работает.
  2. Создать замкнутый кольцо газообразования трубки фитинга внутри рассечение блюдо. Прокол газации трубку несколько раз, что непрерывное образование пузырьков уверен. Это газом трубка может быть использована несколько раз.
  3. Подготовка рассечение блюдо с кремниевой эластомера на дне (толщиной 0,5 см), так что выводы могут быть застрял в нем. Это блюдо можно использовать несколько раз.

4. Выделение левую переднюю папиллярной мышцы мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом изоляции папиллярной мышцы, убедитесь, что газовые линии четкие завалов.

  1. Подготовка органов настройки ванна, как указано в разделе протокола 1-3 перед началом подготовки папиллярных мышц. Подготовьте все решения в день эксперимента.
  2. Жертвоприношение мышь (примерно 8-12 недель) шейки дислокации Accordiнг экспертной работы и организационных принципов.
  3. Fix животное в положении лежа на спине, фиксируя передние лапы и задние лапы на рассечение борту, откройте грудной клетки отвода с обеих сторон резки через ребра с острыми ножницами кости, а затем вырезать диафрагму с поперечным разрезом. Удалить перикарда. Теперь сердце и аорта доступны.
  4. Закрепите сердце с тупыми щипцами на сосудистую ствол близко к сердцу и отделить сердце быстро с ножницами из легких и окружающих тканей.
  5. Передача бьющееся сердце в чашку Петри с охлажденной газированной приготовления раствора с кислородом (шаг 2.2). Разрешить сердце биться и стимулировать сердечные сокращения мягко касаясь помощью верхушки сердца щипцами.
  6. Как только сердце полностью exsanguinous, перенести его на вскрытии блюдо, наполненный охлажденный раствор препарата (шаг 2.2) и загазованности с O 2. От этого шага по использованию стереомикроскопом.
  7. Fix НЕАк.т. с помощью булавки через правый желудочек, так, что сердце видно из спинного (правый желудочек расположен на правой стороне от точки зрения оператора).
  8. Использование микрохирургические ножницы отделить обе предсердий на атриовентрикулярного уровне, вырезать соединительной ткани из желудочков и выбросить. Выполните разрез через стенки желудочка с AV-клапана уровня до верхушки сердца, избегая любой механическое давление.
  9. Откройте желудочек и исправить левосторонний бесплатно стену щипцами, таким образом, имея взгляд на обоих левого желудочка папиллярных мышц.
  10. Слегка срезаем желудочка ткани отвода с обеих сторон передней левой папиллярной мышцы, сохраняющих часть клапанной парус на папиллярных мышц подготовки и избежать прикосновения или растяжения мышцы папиллярный как можно больше. Рассеките оставшиеся стенки желудочка ткань от папиллярной мышцы.
  11. Присоединить шелковые (7/0, метрическая 0.5) на обеих сторонах папиллярного мышцы прептовка, один на клапанной паруса и один на мышечную часть. Закрепите подготовку в орган ванны камере, наполненной раствором орган ванной и загазованности с карбогена, а температура 32 ° С рекомендуется.

5. Сбалансированность и Стимулирование папиллярной мышцы

  1. Стимулируют папиллярный подготовку мышц с прямоугольных импульсов (длительностью 2 мс и током 100 мА) при стимуляции частотой 1 Гц сразу после фиксации в ванночку.
  2. Убедитесь, частая смена раствора орган ванны, либо путем непрерывного изменения или частого ручного изменения (каждые 5 мин) в соответствии с настройками типа орган ванны используется.
  3. Постепенно увеличивайте претензии до максимальной силы сокращений в достигнута. Максимальный силы сокращений достигается, когда увеличение претензии не последовало дальнейшее увеличение в силы сокращений.
  4. После 45-60 мин уравновешивания начать экспериментальный протокол.

6. Похожие экспериментальных протоколов для измерения сократимость

ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментальный протокол изложены ниже содержит стандартные маневры, чтобы охарактеризовать сердечную сократимость в физиологических и патофизиологических условиях. В репрезентативной секции мы опишем эти протоколы подробно показывающий также репрезентативные результаты (см также таблицу 2).

  1. Запись и анализ экспериментальных протоколов
    1. Для записи, используйте соответствующее программное обеспечение с адекватной временным разрешением (скорость приема ≥ 1 кГц).
    2. Анализ параметров, включая амплитуды силы сокращений (высота), время пиковой напряженности (ТТП) и половины максимального времени релаксации (R 50 / TFall, соответственно), как упоминалось в программе (в качестве примера график 5.5 ADInstruments, рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол этой рукописи для измерения сократимость изолированных мышиных папиллярных мышц препаратов настроен на оптимальных условиях, чтобы получить воспроизводимые результаты экспериментов в физиологических условиях. Чтобы определить оптимальные условия эксперимента мы провели пилотные эксперименты различные температуры ванны и орган внеклеточной концентрации кальция (см также 12). Протокол, описанный здесь, был выполнен с внеклеточным концентрации кальция 1,5 мм и температуре 32 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой рукописи мы опишем метод, чтобы расследовать сократимость мышиного папиллярной мышцы в пробирке, которые могут быть использованы, чтобы ответить на несколько научных вопросов, связанных с сердечной физиологии и патологии у мышей, а также для поддержки анализа трансгенных линий и открытие новых фармацевтических подходов для лечения сердечных дисфункций. Проиллюстрируем использование этого метода для оценки физиологических, патологических и фармакологических свойств сократимость сердечной мышцы (см...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Немецкого исследовательского (KFO 196 "Signaltransduktion бай adaptativen унд maladaptiven kardialen Перепланировка-Prozessen", FR 1638 / 1-2) и в DZHK (немецкий Центра сердечно-сосудистых исследований, часть немецких центров исследований в области здравоохранения , который является БМБФ (Федеральное министерство образования и научных исследований) инициатива).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияSigma-AldrichS7653
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761 
Хлорид калияSigma-AldrichP9333
глюкозаSigma-AldrichD9434 
Пируват натрияSigma-AldrichP5280 
Кальция хлорида дигидратSigma-Aldrich223506
Магния сульфат гептагидратSigma-Aldrich230391
Калия фосфат моноосновнойSigma-AldrichP 5655
2,3-бутандион моноксимSigma-AldrichB0753
3-изобутил-1-метилксантинSigma-AldrichI5879Предупреждение об опасности H 302, растворение в
диметилсульфоксиде ДМСО (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
Изопреналина гидрохлоридSigma-AldrichI5627Обозначение опасности H 315-H319-H335
Гепарин натрия 250.000 IE/10 млратиофармPZN 3874685
Гистамина дигидрохлоридSigma-AldrichH7250Описание опасности H 315-H 317-H319- Х334-Н335

Ссылки

  1. Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
  2. Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
  3. Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
  4. Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
  5. Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
  6. Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
  7. Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
  8. Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
  9. Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
  10. Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
  11. Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
  12. Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
  13. Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
  14. Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
  15. Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
  16. Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
  17. Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
  18. Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
  19. Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
  20. Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
  21. Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
  22. Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
  23. Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сократимость Измерения на изолированных папиллярных мышц по расследованию сердечной инотропию у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.