Скринируемый В Vivo Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ Caenorhabditis Элеганс

Краткое содержание

Описан протокол для обнаружения in vivo эффектов митохондриальных ингибиторов в модельном организме Caenorhabditis elegans и для идентификации потенциально усиливающих соединений. Этот протокол может быть использован для скрининга библиотек лекарств на наличие соединений, модулирующих функцию митохондрий.

Аннотация

Многоклеточный модельный организм Caenorhabditis elegans - это маленькая нематода размером примерно 1 мм во взрослом возрасте, которая генетически и экспериментально поддается лечению. Он экономичен и прост в культивировании и дозировании в жидкой среде, что делает его хорошо подходящим для грохочения со средней пропускной способностью. Ранее мы валидировали использование трансгенной люциферазы, экспрессирующей штаммы C. elegans, для быстрой оценки in vivo уровней АТФ у нематоды. ^1-3 Здесь мы представляем необходимые материалы и методику для проведения биотестов с биолюминесцентными штаммами C. elegans PE254 или PE255 (или любыми их производными штаммами). Протокол позволяет in vivo обнаруживать сублетальные эффекты препаратов, которые могут идентифицировать митохондриальную токсичность, а также обнаруживать in vivo потенциальные полезные эффекты лекарств. Представлены репрезентативные результаты для химических веществ параквата, ротенона, оксалоацетата и четырех ингибиторных соединений люциферазы светлячков. Методология может быть масштабирована, чтобы обеспечить платформу для скрининга библиотек лекарств на наличие соединений, способных модулировать функцию митохондрий. Доклиническая оценка токсичности лекарственного препарата часто проводится на иммортализированных раковых клеточных линиях человека, которые получают АТФ в основном из гликолиза и часто толерантны к митохондриальным токсикантам. ^4,5 Напротив, C. elegans зависит от окислительного фосфорилирования для поддержания развития во взрослом возрасте, проводя параллель с человеком и предоставляя уникальную возможность для оценки соединений в физиологическом контексте всего живого многоклеточного организма.

Введение

Общая цель этой процедуры является быстрое количественное определение энергетического состояния С. Элеганс в естественных условиях с целью использования этого в качестве конечной точки в соединении скрининга. Обоснованием основан на трансгенной экспрессии гена люциферазы светлячка в нематоды C. Элеганс ^1-3 с помощью плазмиды pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862~~HEAD=pobj). Люциферазы фермент, слитый с зеленым флуоресцентным белком GFP и выражается конститутивно и повсеместно в цитоплазме (The люциферазы пероксисом ориентации сигнал был удален). Это приводит к эмиссии света, когда подложка люциферин обеспечивается экзогенно. Как червь является прозрачным, свет может быть измерена с помощью люминометра в виде относительных световых единиц (RLU). Сотовые ATP топлива реакция биолюминесценции и ее доступность определяет уровень освещенности, произведенные. Следовательно, luminometry предлагает convenienт средства оценки уровней относительных АТФ и расширение функции митохондрий, так как производство АТФ происходит главным образом в митохондриях. Связь между митохондриальных функциональных уровней и биолюминесценции было продемонстрировано ранее через глушителей митохондриальных генов цепи переноса электронов и сопутствующей снижению светоотдачи. ¹

Штаммы биолюминесценции, полученные были обозначены PE254 (feIs4) и PE255 (feIs5) ¹ (список материалов) и может быть использован как взаимозаменяемые. ³ Ряд исследований использовали эти штаммы датчика сообщить о сотовых АТФ уровней в естественных условиях после воздействия различных ксенобиотиков химических веществ, таких, как азид натрия ^1, кадмия ^2, канализации Экстракт осадка ^3, 5'-фтор-2-дезоксиуридин ⁶ и табак-специфичных нитрозаминов ^7. Штаммы были также полезны для мониторинга последствий воздействия ультрафиолетового излучения C 8 и эффекты нарушая функции митохондрий дыхательной цепи. ^1,9 Ранняя версия датчика люминесценции, выражающей ген люциферазы без GFP слияния (PE39) также были использованы в исследовании воздействия тяжелых металлов и респираторных . разобщающий ¹⁰ Штаммы PE254 и PE255 нести люциферазы: GFP слияние и GFP флуоресценции показано, что увеличение пропорционально нематод массы, предлагая удобные средства для нормализации значений люминесценции ^6,9 Последствия дифференциального количества червей на лунку может быть. учтены в том числе несколько технических повторов в анализе (минимум 5 скважин в состоянии). ³

Протокол предоставляет возможность мониторинга в естественных условиях энергетических уровней (в отличие от более технически трудоемким в пробирке определения АТФ), что позволяет соединение скрининг и изменение в физиологическом контексте целого муlticellular организм. Эта процедура может быть расширена до различных генетических фоны, пересекая хромосомно интегрированный трансген в доступных мутантных штаммов и / или по глушителей генов от РНК-интерференции; Таким образом, в полной мере воспользоваться С. Элеганс в качестве модельного организма. Метод должен помочь уменьшить поздней стадии недостаточности наркотиков кандидатов в связи с митохондриальной токсичности и внести свой вклад в сокращение высшего испытаний на животных.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все действия в стерильных условиях (кабинет ламинарного потока) и с предварительно стерилизованные материалов (в автоклаве 126 ° C, 11 мин). LB пластины с прожилками из E. палочка OP50 хранили при 4 ° С требуется, Штриховатост выходят свежие LB пластины и restreak каждый месяц.

1. Бактериальный еды (кишечная палочка OP50) Подготовка

1. День 1. Инокулировать 2 х 5 мл LB в двух универсальных бутылки с одной колонии E. палочка OP50 и место в инкубатор встряхивания при 37 ° С (220 оборотов в минуту) в течение 8 ч.
2. После 8 часов инкубации, используйте 2 мл E. палочка OP50 LB культура для инокуляции каждого из 3 х 200 мл LB. Место колбы в инкубатор встряхивания (220 оборотов в минуту) O / N (17 ч) при 37 ° С.
3. Взвешивание 20 х 50 мл центрифужные пробирки и писать вес на трубе.
4. День 2. Использование серологического пипетки аликвоту 30 мл O / N Е. палочка OP50 культуры в предварительно взвешенный центрифужные пробирки. Центрифуга на 7,741 хг, 10 ° С, 8 мин.
5. Тщательно сцедить супернатант, держите трубку перевернутой крышкой, и оставьте на несколько минут. С помощью пипетки удалить лишнюю супернатант, которые могут присутствовать в крышке. Взвесить трубку и вычислить вес таблетки.
6. Рассчитать объем, необходимый для обеспечения суспензии 30 г / л и отметить этот объем на трубе. Встречи, этикетка и место трубки при -20 ° C для использования в течение 1-3 месяцев или на - 80 ° С, если хранить дольше, чем 3 месяца.
7. Подготовка бактериальной суспензии для выращивания нематод; позволяют бактериальных гранул оттаивать и добавить необходимый объем S полной среде ^11,12 в каждую пробирку, вихревые осторожно ресуспендируют осадок, бассейн содержимое различных трубок, чтобы получить объем, требуемый. Работа в стерильных условиях.

2. Подготовка стандартов наркотиков в 96-луночного формата плиты

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании библиотеки наркотиков, тарелки наркотиков предоставляются на одинКонцентрация соединения в ДМСО. Первичный скрининг тест-соединений в одной концентрации. Следуйте инструкциям для подготовки наркотиков пластины для соединения подтверждающего тестирования в диапазоне концентраций между 0-160 мкМ, выбран после статистической значимости на 10 мкм. Приведенные ниже шаги могут быть адаптированы, чтобы проверить другие концентрации.

ВНИМАНИЕ! Следуйте необходимые меры предосторожности при обращении лекарственных средств (как правило, маску, защитные очки, перчатки обязательно).

1. Подготовка наркотиков пластину с рабочим стандарты подтверждающего скрининга: взвешивают необходимое количество соединения в стерильном 1,7 мл микроцентрифужных трубки и подготовить 16 мм соединение в ДМСО (т.е. 100x сконцентрированы относительно желаемой концентрации для верхней экспозиции).
2. Серийно разбавить 16 мм складе 1: 2 в ДМСО, чтобы получить 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 мм (стандарты стерильные условия). Эти 100x концентрируют и будут разбавлены до конечной концентрации 0 (только автомобиль),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160 мкм (в 1% ДМСО) в течение воздействием наркотиков.
3. В кабинете потока ламинарного, разместить 20-50 мкл на лунку стандартов составных пределах колонке 96-луночный планшет, например положение пластины A1: 16 мм, В1: 8 мм, С1: 4 мМ, D1: 2 мм, E1: 1 мМ, F1: 0,5 мМ, G1: 0,25 мМ наркотиков и H1: ДМСО. Используйте различные колонки для разбавления ряда различных препаратов.
4. Аликвоты транспортного средства в лунки колонки 12 в пластине наркотиков.
   Примечание: Это будет способствовать тестирование контроля вниз столбцов в дополнение к тестированию по ряду H транспортного средства, гарантируя, что транспортное средство испытывается в положениях представителем всей пластине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый препарат пластина для подтверждающего скрининга держит разбавления серии для более 11 различных лекарственных средств, испытанных плюс контроль транспортного средства.
5. Этикетка и уплотнение пластины, накрыть фольгой и месте -20 ° С до не требуется.

3. Эксперименты нематод

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все действия üNDER стерильных условиях асептически и с предварительно стерилизуют материалов и реагентов. Поддерживать С Элеганс штаммы обычно на NGM пластин с Е. палочка OP50. ¹² Вопросы, предлагаемые для тайминги различных этапов протокола приведены в таблице 1.

1. День 1 задача: создать жидкую культуру штамма биосенсора для последующей синхронизации.
   1. Возьмите нематод из одного 6 см NGM пластины (с большим количеством молодых личинок, где еда только закончились) в 2 мл S полная и передачи в колбу с 30 г / л Е. палочка OP50 в S полного (общего объема 30 мл в 250 мл емкость конической стеклянной колбе). Инкубируйте 3 дня при 20 ° С, 160 оборотов в минуту.
2. День 4 Задача (позволяют приблизительно 30-35 мин): отбеливатель культура урожай яйца и синхронизировать червь населения. Выполняйте все действия центрифугирования в течение 1 мин, 600 х г.
   1. Подготовьте раствор отбеливателя непосредственно перед использованием: для каждого 16 мл 0,156 М КОН / NaOH добавить 4 мл отбеливателя.
   2. Залить 2 х 14 млчервь культуры в 15 мл коническую центрифужные пробирки. Разрешить червей урегулировать под действием силы тяжести (3 мин). Снимите и выбросьте жидкие выше поселились нематод. Добавьте 5 мл раствора хлорной извести в каждую пробирку и начать таймер. Комбинат объемов в одну трубу.
   3. Обратить трубки мягко в течение 2 мин, проверить под стереоскоп для взлома червей и выпуска яиц в суспензии. Когда большинство яиц выпущены или максимального времени 2 мин в раствор отбеливателя, центрифуги.
   4. Тщательно Удалить супернатант. Вымойте гранул 1x 14 мл S полный и центрифуги.
   5. Удалите супернатант, добавить 10 мл раствора отбеливателя и начать таймер (это второй шаг отбеливатель гарантирует, что большинство червей туш не распадаются и больше не рассматриваются в соответствии с стереоскоп). После максимального времени в раствор отбеливателя 2 мин, центрифугируют.
   6. Вымойте гранул 3x в S полной, мягко переливать супернатант и ресуспендируют осадок в 14 мл S полный после каждого центрифугирования. После последней промывки, ресуспендируют осадок яйцо в 14 мл S Complete.
   7. Передача объема в коническую стеклянную колбу. Инкубируйте 18-24 ч при 20 ° С, 160 оборотов в минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные яйца вылупится O / N и арестовать развития на первом личиночного возраста (L1) из-за отсутствия пищи, следовательно, все они будут на той же стадии роста.
3. День 5 Задача: настроить синхронизацию червь культур для анализов наркотиков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: черви, взвешенные в среде, как правило, голодания придерживаться гидрофобных пластиковых поверхностей, таких как пипетки советы и труб. 0,01% Tween-20 является сурфактант, используемый здесь, чтобы сделать пластиковые поверхности более гидрофильными и обеспечить большую точность в подсчете (0,01% Triton-X100 также могут быть использованы). Когда нематоды в бактериальной среде, дополненные, они не склонны придерживаться пластика.
   1. Определить число вылупившихся L1-х в колбу, колбу держать при встряхивании платформы (160 оборотов в минуту).
      1. Возьмите 3x 100 мкл образцов из колбы (используйте чистую наконечник каждый раз) в отдельных 1,7 мл микропробирок с 900 мкл жидкого мedium 0,01% Твин-20.
         Примечание: Aspire 100 мкл образца в чистом наконечника только один раз. Тогда при выдаче, пипетки вверх и вниз несколько раз в подростковом дополнить среде, чтобы выпустить любые червей, прилипшие к кончику.
      2. Граф нематод в 4x 10 капель мкл из каждого разведения трех экземплярах трубки. Рассчитать среднее значение и оценить количество личинок, присутствующих в конической стеклянную колбу.
   2. Рассчитайте объем вылупившихся нематод подвески, необходимой для создания мл культуры 2 х 20 с 10 нематод на 10 мкл. Увеличьте расчетный объем на 10% для учета некоторых последующей потерей нематод во время шагов центрифугирования.
   3. Декантировать требуемый объем в 2 × 15 мл центрифужные пробирки (предварительно взвешенный). Взвесьте трубы, чтобы получить фактический объем дозируемого вихревые мягко и настроить целевой объем путем удаления избытка объема с 5 мл пипетки (только стерильный наконечник должен ввести трубку).
   4. Макияж объем до 14 мл со свежими S полных, былч нематоды. Центрифуга (1 мин, 600 г). Снимите и выбросьте супернатант с осторожностью, чтобы не нарушить нематоды осадок.
   5. Добавляют 5 мл S в комплекте с 30 г / л Е. палочка для OP50 гранулированных нематод. Передача 5 мл в каждую пробирку к конической стеклянной колбе, содержащей 15 мл S в комплекте с 30 г / л Е. палочка OP50. Запишите время нематоды были впервые обеспечены питанием.
   6. Встряхнуть флакон нежно (160 оборотов в минуту), принять 9 х 10 капель мкл на микроскопические слайды (используйте свежие подсказки каждый раз), чтобы рассчитывать нематод и подтвердить среднем около 10 (± 2) в 10 мкл.
   7. Поместите нематод колбы в инкубатор встряхивания при 20 ° С, 160 оборотов в минуту в течение 42-44 часов.
4. День 7 Задача: нематоды передачи в 96-луночных планшетах и ​​инициировать воздействием наркотиков.
   1. Комбинат нематод культур в единый колбу, держать колбу закрученной мягко и разместить 3 х 4 мл нематод культуры в 60 мл стерильной корыта. Поместите желоб на дрожащей платформы (160 оборотов в минуту).
   2. Использование 8 чаннель пипетки аликвоту 25 мкл взвешенных нематод на лунку 96 и черных микротитрационных планшетах с плоским дном (прозрачное для принятия как люминесцентные и флуоресцентные показания, или белые тарелки для люминесценции только). Накрыть крышкой плиты и отложите в сторону.
      1. После установки каждых 2 пластин, разместить еще 2 х 2,5 мл нематод в корыто, чтобы заменить потерянный объем (держать "мертвого объема" в корыте около 7 мл).
      2. Настройте 13/14 пластин с нематодами. 11 нематод пластины должны будут проверить две пластины наркотиков 96-а. ^12-я нематод пластины будут загружены исключительно с транспортного средства в качестве контроля. ^13-я пластинка будет использоваться для установления фоновой флуоресценции на 8-й день (см. Ниже) Дополнительный пластины могут быть подготовлены для использования, должны происходить ошибки во время установки.
   3. Алиготе 74 мкл S полные в каждую лунку и место пластины в влажной камере (см список материалов) в дрожащей инкубатора (20 ° C, 160 оборотов в минуту) ЕНТИра готова испытаний аликвоту соединений на заранее заданного времени развития (например, 45 ч 30 мин после еды, предоставленной). [Громкость на лунку сейчас 99 мкл].
   4. Оттаять наркотиков пластину (ы) для теста.
   5. Используйте многоканальную пипетку, чтобы настроить нематод пластины с наркотиками, изменение подсказки каждый раз. Разрешить 5 мин на 96-луночный планшет для аликвоты препарата.
      1. Принимать по 1 мкл из ^1-го столбца наркотиков пластины и добавить к столбцам 1-5 пластины, содержащей нематод; повторять от 2 колонки ^й в пластине наркотиков в колонках 8-12 пластины, содержащей нематод. Добавить 1 мкл автомобиля на столбцы 6 и 7 нематод пластины.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем на лунку в нематод пластины будет 100 мкл в результате 1: 100 разбавления соединения / транспортного средства.
      2. Повторите процесс, добавив 1 мкл ^3-й / ^4-й колонке наркотиков пластины к колонкам 1-5 / 8-12 второго нематод пластины; Добавить транспорт столбцам 6 и 7 нематод пластины.
      3. Продолжить, чтобы проверить оставшиеся столбцы препарат пластины. Настройка как минимум один нематод пластины с транспортного средства во всех лунках путем отбора проб из колонны 12 наркотиков пластины. Место пластины обратно в сырых камерах в пожимая инкубатор (20 ° C, 160 оборотов в минуту) на 20-22 часов (смотрите примечание для 8-й день).
   6. Часть-подготовить буфер люминесценции на следующий день: добавить ДМСО и 10% Triton-X-100 до требуемого объема S полного получения 1% ДМСО и 0,15% Triton X-100. Разрешить 5 мл на пластины чтения для люминесценции, плюс 1 мл для грунтования люминометра инжектор.
5. День 8 Задача: Читать экспериментальных конечных точек - флуоресценции и биолюминесценции. (Показания флуоресценции GFP рекомендуется в качестве средства для нормализации данных биолюминесценции.)
   Примечание: Цель для чтения с помощью конечных точек 66-67 ч после еды при условии, чтобы нематод, чтобы предотвратить значительное производство потомства в условиях эксперимента, описанных.
   1. Установите пластину использовать в качестве фона для контроля показаний GFP. Сombine также содержимое из ^13-й пластины в 15 мл трубки. Разрешить нематоды урегулировать (2-3 мин). Используйте супернатант загрузить планшет (черный с прозрачным дном) с 100 мкл бактериальной суспензии на лунку.
      1. Соблюдайте фона управления пластину под микроскопом, записывая скважинах, где нематоды можно увидеть. Исключить их из фона, используемого в оценке последующего анализа данных.
   2. Read флуоресценцию каждого 96-луночного планшета, в том числе фонового контроля. (Настройки: оптика от нижней пластины; фильтры 485/20 возбуждения; 528/20 выбросов.)
   3. Подготовка буфера для чтения люминесценции: добавить люциферин (20 мм), чтобы расстаться подготовленный буфер (с предыдущего дня), чтобы получить люминесценции буфер с 1% ДМСО (1x), 0,15% Тритон-Х100 (3x) и 0,3 мм люциферин (3x ). Председатель люминометра инжектора 6x 150 мкл буфера люминесценции.
      1. Предыдущая шаг предполагает 1% ДМСО в качестве транспортного средства во время воздействия препарата. Когда транспортное средство находится вода, регулировать сотрудничествоncentration ДМСО в буфере люминесценции до 3% (то есть, 3x).
   4. Работа с одной пластиной за один раз. Разлить 50 мкл буфера люминесценции на лунку. (150 мкл конечного объема в скважины; 3x разведения люминесценции буфера: 1% ДМСО, 0,05% Тритон-X100 и 0,1 мМ Люциферин конечные концентрации.) Сразу же при встряхивании платформы и начать таймер.
      1. Через 3 мин при встряхивании платформы (160 оборотов в минуту), прочтите свечение (1 сек за измерения).

Анализ данных 4.

1. Вычтите среднее фон GFP чтения из результатов флуоресценции. Разделите биолюминесценции по соответствующей чтения GFP.
   1. Когда высокое значение GFP обнаружен на нематод, подвергшихся воздействию соединения, измерения флуоресценции соединения по себе для объяснения любого соединения флуоресценции. Если выше, чем в среднем, использовать это в качестве фона вместо.
2. Экспресс биолюминесценции, GFP нормализуется биолюминесценциий флуоресценции GFP данные в процентах от среднего значения для управления транспортным средством в каждую тарелку.
3. Участок средние значения и погрешности для каждой концентрации.
4. Тест на статистическую значимость с использованием 2-дисперсионный анализ (ANOVA) с эффектами «концентрации», «Эксперимент» и их взаимодействия (каждая точка данных относится к одной скважины), а также использовать тест Даннет как тест после специальной (против . управления транспортным средством).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если «эксперимент» или «взаимодействие» термины имеют значение, дальнейшие эксперименты могут потребоваться для подтверждения ответа. Где нет изменчивость между экспериментами не видно из наблюдений участков данных, односторонний ANOVA может быть выполнена на объединенных данных из независимых экспериментов.
   1. Для статистического анализа пластины (ы) только с автомобиля, выберите все ячейки в столбцах 6 -7 и все скважины в строке H как контрольной группы (это положение обычно назначенные транспортного средства во время соединения тестирования).

Результаты

Представитель результаты, иллюстрирующие метод были получены для ротенона (рис 1), паракват (Рисунок 2), оксалоацетат (Рисунок 3), и 4 соединений, которые были выбраны в качестве люциферазы светляков ингибиторы во скрининга библиотеки наркотиков ¹³ (рисунок 4). Экспозиция препарат начал на стадии L4 во всех случаях, но Паракват экспериментов по воздействию были начаты в 41 ч после еды в первую очередь предоставляется нематод по сравнению с 45-46 ч для других соединений. Протокол допускает определенную степень гибкости в выборе времени для инициирования воздействия лекарственного и длиной экспозиции. Тем не менее, для целей скрининга, установленные раз следует придерживаться однажды выбранного для воспроизводимости между экспериментами. Конечные точки должны быть измерены 66-67 ч время развития для того, чтобы предотвратить обширный укладки яиц и вылупления потомства в скважинах. Руководящие принципы для таймингов предоставляются в Тсостоянии 1.

Ротенон, митохондриальный комплекс я ингибитора, снижение биолюминесценции после того, как относительно коротких (2 ч) и более длительных экспозиций (24 ч) в диапазоне концентраций (рис 1). В этом случае, никаких измерений GFP не были приняты, но количество технических повторах используется (N = 6), достаточно, чтобы выровнять любые различия в числах червячных между скважинами ^3. Экспозиция 24 ч это окно времени, в течение которых нематоды расти, и медленнее развитие в результате комплексного I торможения, как ожидается, внести свой вклад в снижение биолюминесценции. Это было подтверждено путем визуального наблюдения под стереоскопе с замедленным развитием видно, в частности, в концентрации 20 мкМ и выше; Кроме того, некоторые летальность была замечена от 40 мкм (качественные наблюдения не количественно). Нет летальность не наблюдалось после воздействия 2 ч, но влияние на движение червя были замечены. Резкое снижение биолюминесценции отношению к контрольным occurred при самой низкой концентрации ротенона испытания 2,5 мкм, для которых эффекты не легко обнаружены быстрого визуального наблюдения в 2 ч экспозиции. Это снижение в биолюминесценции согласуется с пониженным сотовой АТФ. Максимальное ингибирование было достигнуто при наименьшей концентрацией, используемого ротеноном (2,5 мкМ), указывающее, что любые последующие эксперименты, направленные конкретно ротенон следует проводить от 0 до 5 мкм [диапазоне концентраций 0-160 мкМ был выбран в качестве части по сравнению с другими препаратами первоначально определены как имеющие значительное влияние в 10 мкМ (будет опубликован в другом месте)].

Гербицид паракват поражает функции митохондрий за счет увеличения активных форм кислорода. Здесь мы демонстрируем свою силу биолюминесценции С. Элеганс штамм PE254 после воздействия в диапазоне концентраций в течение 24 часов (рис 2). Как штамм несет Люк :: GFP слияние, флуоресценция GFP был ALSO измеряется как средство нормализации. ^6,9 паракват уменьшилось биолюминесценции, флуоресценции GFP и нормализованное биолюминесценции значительно. Тест после специальной Даннет указано, что концентрации параквата с существенными различиями в отношении управления транспортным средством были 4 и 8 мм для биолюминесценции и нормированной биолюминесценции, а также 2 мм для нормированной биолюминесценции. Только концентрация значительно снижая флуоресценцию GFP был 8 мм, концентрация, при которой эффекты роста и иногда мертвых червь видели (качественные наблюдения). Снижение биолюминесценции (и нормированной биолюминесценции) было больше, чем у флуоресценции, в соответствии со снижением функции митохондрий и воздействие на АТФ.

Цикл лимонной кислоты промежуточное оксалоацетат протестирован на C. Элеганс штамм PE254 в одной концентрации 8 мм, привело к увеличению в биолюминесценции (рис 3). Нет GFP флуоресцируетИзмерения NCE были получены или дополнительное визуальное наблюдение осуществляется; Однако такой ответ для одной концентрации заслуживает дальнейшего подтверждающего воздействия в диапазоне концентраций, и более детальные наблюдения эффектов. Улучшенный вариант биолюминесценции этим соединением не удивительно, так как это может быть постулируется, приводит к большей активности цикла лимонной кислоты, с в конечном счете, увеличению производства АТФ (тем не менее, было бы целесообразно, чтобы контролировать любые воздействия на люциферазных уровнях оценки флуоресценции GFP В последующих экспериментах). Наборы данных оксалоацетат показано выявить степень изменчивости в ответ видели в экспериментах, основанных люциферазных. По нашему опыту эта изменчивость является особенностью тест-системы, особенно для менее вредных условий эксплуатации.

Светлячок люциферазы ингибирующие DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 и DDD00023047 были испытаны как в пробирке, глядя на воздействие на пуrified фермент и в естественных условиях с использованием C. Элеганс Люк: GFP выражения напряжения. Там не было никаких доказательств, что какой-либо из тестируемых соединений вызвало смерть нематод в условиях воздействия. Все 4 соединения влияет на активность люциферазы в пробирке в концентрациях 2 проверены 25 и 100 мкм (рис 4а). DDD00001434 убил активность очищенного люциферазы почти полностью, что предоставил достоверную оправдание для большого спада в естественных условиях биолюминесценции в (рис 4В). Хотя, в пробирке и в естественных условиях анализов непосредственно не сопоставимы, ответ на DDD00023047 была одинаковой в обеих анализах. DDD0001477 и DDD00000635 вызвало большую снижение в естественных условиях, чем в в пробирке. Эти соединения были предоставлены живых червей 22 ч до начала люциферин подложки, и результаты могут отражать, что они не были легко перемещены из люциферазы активном сайте, когда люциферина стал зонах общественногоэтикетку. В качестве альтернативы, DDD0001477 и DDD00000635 может иметь дополнительный эффект на клеточные уровни АТФ. Это должны быть оценены с помощью, которые не связаны светлячка люциферазы. Особое внимание было сильное повышение GFP сигнала в живых червей, подверженных соединение DDD00000635. Это будет описано ниже.

Рисунок 1. митохондриальной комплекса я ингибитора ротенон уменьшилось энергетический статус C. Элеганс, как измеряется биолюминесценции штамма PE254. Синхронное L4 стадии червей (45-46 ч после еды, предоставленной L1 личинок) подвергается 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 и 160 мкМ ротенона в 1% ДМСО для 2 ч (короткий) или 24 ч (долго воздействия) предыдущие показания биолюминесценции, соответственно, на 48 и 69 ч после развития червя Продукты предоставляются. Было высказано биолюминесценции (блок относительные световые единицы, RLU) в процентах от транспортного средства (1% DMSO) значения. Столбики ошибок показывают SEM технических повторов при каждой концентрации ротеноном (N = 6). Все проверенные концентрации привело к статистически значимой разницы в отношении к контролю транспортного средства (р <0,001).

Рисунок 2. окислительного стрессора параквату уменьшилось энергетический статус C. Элеганс штамм PE254 в зависимости от концентрации (измерено биолюминесценции). Синхронное L4 стадии червей (для удобства в данном случае на 41 ч после еды, предоставленной L1 личинок) подвергались 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 или 8 паракват мМ в течение 24 часов. GFP флуоресценции (блок Относительные флуоресценции Единицы, РФС) был использован для нормализации данных биолюминесценции (блок РОС), обе конечные точки, полученные при 65 ч развития. Данные выражены в процентах от контрольной (1% ДМСО). Усы изобразить SEM технических повторов(N = 5 для различных концентраций; п = 18 для управления). Односторонний ANOVA: *** р <0,001 по сравнению с контролем транспортного средства.

Рисунок 3. Цикл лимонной кислоты промежуточное оксалоацетат (8 мм) повысило биолюминесценции С Элеганс штамм PE254. Синхронное L4 стадии червей (45-46 ч после еды, предоставленной L1 личинок) подвергались свежеприготовленный 8 мм оксалоацетат в течение 18 ч ± 30 мин. Биолюминесценция (блок RLU) был прочитан в то время, с развитием в 63,5 ч ± 1 ч и выражали в процентах от контроля транспортного средства (DDH ₂ O). Различные столбцы представляют различные наборы данных по 8 повторов технических выделенных различным 96-луночных в одном эксперименте. Столбики ошибок показывают SEM технических повторов (N = 8). 2 способ-дисперсионный с «набор» и «концентрации» в качестве факторов: ̵6; Установите 'р> 0,05, "концентрация" р <0,001 и член взаимодействия р> 0,05.

В

Рисунок 4. Тестирование ответов на 4 соединений из Данди обнаружения наркотиков соединения библиотеки ^{13 (С1:} DDD00001434, C2: DDD0001477, С3: С4 DDD00000635 и: DDD00023047) с известной ингибиторной активности на светлячка люциферазы люминесценции. (А) Эффект соединений на активность очищенного люциферазы светлячка (измерена как световых единиц, RLU), выраженная в процентах от управления транспортным средством. АТФ биолюминесценции CLSII комплект (Roche, Manheim, Германия) в соответствии с инструкциями с таким же количеством фермента люциферазы аликвоты в лунки (белый 96-WELL микротитровальные планшеты). АТФ при условии, при конечной концентрации 10 мкМ и 1 мкл соединения (конечная концентрация указано) или ДМСО (1%) был добавлен. Люминесценция сигнала была интегрирована в течение 10 сек. Столбики ошибок показывают SEM технических повторностях (N = 4). Анализ: В одну сторону ANOVA; * р <0,05 или *** р <0,001 по сравнению с контролем транспортного средства. Различия между 25 и 100 мкМ высоко значимых для C1 (DDD00001434; р <0,001), и значимым для С2 и С3 (соответственно DDD0001477 и DDD00000635; р <0,05). (Б) в естественных условиях измерения биолюминесценции, биолюминесценции нормализуется флуоресценции GFP и GFP флуоресценции С. Элеганс штамм PE254 в 67 ч время развития после воздействия тестируемых соединений в течение 22 ч. Столбики ошибок показывают SEM технических повторов (N = 8). Статистический анализ (Один из способов, ANOVA) проводили на объединенных данных от 3 наборов данных (3 Xn = 8). * р <0,05 или *** р <0,001 по сравнению с соответствующим контролем транспортного средства. ДиффереCES между 25 и 100 мкМ только статистически значимым (р <0,05) нормированной биолюминесценции следующие воздействия C4 (DDD00023047).

Время дня	1 день	День 2	День 3	День 4	День 5	День 6	День 7	День 8
9-10								Шаг 5
10-11								Шаг 5
11-12							Шаг 4	Шаг 5
12-13							Шаг 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Шаг 1				Шаг 3
17-18
18-19				Шаг 2

Таблица 1. Обзор шагов протокола будет осуществляться на каждый день нематод экспериментов (раздел 3), и предложил тайминги.

Обсуждение

Модель организм С. Элеганс предоставляет мощную экспериментальную систему. Легко культуры и производит обильное потомство генетически идентичный с 3,5 дня жизненного цикла от яйца до взрослого воспроизведения (через несовершеннолетних личиночной стадии L1 до L4). Из-за его малого размера, что может быть удобно выращивают в 96-луночных планшетах, облегчая соединение скрининг. Мы представляем протокол фенотипическая скрининга, основанный на штаммов C. Элеганс, которые действуют как естественных условиях датчиков в энергетических уровней. ¹⁴ Протокол применим к любой лаборатории, хотя 96-луночный люминометра плита и стерильной камере требуется. Важно, чтобы предотвратить загрязнение в анализах с использованием хорошей техники лаборатории. При работе вручную, максимальное количество нематод пластин достижим 13 на эксперимент, позволяющий тестирование 2x пластин наркотиков 96-луночных и в том числе две пластины транспортного средства. Представитель результаты представлены на митохондриальной комплекса я ингибитора rotenonе, генератор паракват супероксид, цикл лимонной кислоты промежуточное оксалоацетат и четыре соединения с известной люциферазы светляков ингибирующей активности. Первые два соединения привело к снижению биолюминесценции, как предсказано, тогда как оксалоацетат привело к усилению, вероятно, приведет к большей от поколения АТФ. Наборы данных оксалоацетат также демонстрируют внутреннюю изменчивость в экспериментах на основе люциферазы светляков в качестве репортера. Минимум три независимых экспериментов желательно, чтобы установить надежность ответов на неизвестных соединений.

Ингибирование светлячка активности люциферазы идентифицировать с количественным анализом в пробирке с использованием коммерческого набора. ^3, одно из соединений привело к существенному увеличению флуоресценции GFP в соответствии с ингибитором увеличения уровня GFP-меченый люциферазы светлячка путем связывания с люциферазы фермента активные Сайт, и делает его более стабильным. ¹⁵ В некоторых случаях(не в данном конкретном случае), это может привести к повышению уровня биолюминесценции, когда ингибитор вытесняется избытком субстрата. ¹⁵ Он, следовательно, важно, чтобы не интерпретировать результаты ошибочно из соединений, которые взаимодействуют с светлячка фермента, как уменьшается или увеличивается уровень АТФ / функции митохондрий. Изменения в люминесценции сигнала нередко коррелирует с дополнительными измерениями здоровья, таких как движение, развития и роста. В качестве примера, соединение является ингибитором подозреваемый люциферазы, если резкое снижение биолюминесценции сигнала обнаружено, но черви неотличимы от контрольных микроскопическим наблюдением. Увеличение флуоресценции GFP, не объясняется роста или соединение флуоресценции, может также указывать на ингибитора. Ряд люциферазных ингибиторов ^15, как известно, и были введены в PubChem. Поэтому в первую очередь, это хорошая практика, чтобы проконсультироваться информацию о люциферазных ингибиторов проводимых PubChem; с последующим ттересно эффектов соединения в анализах пробирке с в очищенного фермента ^{3 и /} или подтверждения воздействия на функции митохондрий дополнительными средствами. ^16,17

Измерения флуоресценции GFP позволяют обнаруживать светлячков уровнях люциферазных (и потенциального обнаружения некоторых люциферазных ингибиторы ферментов, как описано выше), что делает сильный случай для измерения конечной точки наряду эту биолюминесценции, где это возможно. Нормализация показаний биолюминесценции в GFP также является средством учета различий в числах червячных между скважинами (хотя это также может быть достигнуто путем включения нескольких технических повторностей). Для большей чувствительности, важно, чтобы вычесть фоновой флуоресценции от показаний. Протокол оценивает вклад бактериальной суспензии в фоновой флуоресценции, однако нематоды аутофлюоресценция не приходилось (ограничение текущего анализа, особенно важно для любого возраста СТЮУчитывая, что умирает нематода автофлуоресцентной увеличивается с возрастом). Автофлуоресцентной тестируемых соединений следует также оценивать параллельно. GFP нормализации представляется, непременно где исследователи хотите приспособить протокол сравнить бассейны клеточные АТФ в различных генетических мутантов или после глушителей различных генов, чтобы контролировать все различия деформации на уровне экспрессии трансгена биолюминесценции.

Критические параметры в протокол включают стадию развития, при которой инициируется экспозиции, длительность воздействия, и получение подобных число нематод в различных скважинах. Воздействие может начаться в любой стадии развития нематод, однако L3 этап и старше является предпочтительным. С этого момента на нематоды зависит от окислительного фосфорилирования для развития в зрелом возрасте, о чем свидетельствует очень значительным увеличением содержания мтДНК, потребление кислорода и уровня АТФ. ^18,19,20 Настоящий Протокол инициирует выставкахЮр на стадии L4. Причиной аликвоты нематод в 96-луночных планшетах только на этой стадии (а не когда они впервые были обеспечены питанием на стадии L1), является то, что хотя пластины помещают в сырых камерах, чтобы минимизировать испарение, степень испарения все еще происходит в наш пожимая инкубатор, который рассматривается как очень маленьких капелек, образующих на крышках (это не может быть проблемой с другими пожимая инкубаторов). По аликвоты нематод на пластинах непосредственно перед добавлением стандартов наркотиков, фактическая концентрация лекарственного средства не зависит от любого малом изменении объема за счет испарения. Загрузка нематод пластину с автомобиля только полезно, чтобы проверить, что нематоды были равномерно распределены между скважинами. Любые существенные различия, найденные для автомобиля только пластины будет свидетельствовать о плохой техники в дозирования нематод в лунки.

Длина воздействия является важным фактором. Если воздействие на состояние энергетической независимо от роста представляют интерес, протокол может быть изменен, чтобы вместить более короткие выдержки (от почти немедленных реакций к, например, 2 часа). С другой стороны, ввод соединений в C. Элеганс ткани может занять некоторое время. Например 12-24 ч требуется для достижения максимальной концентрации внутренних ресвератрола и 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FudR). ²¹ Таким образом, длительная экспозиция (от 18 до 24 ч) может быть оправданным, чтобы максимизировать уровни воздействия. Время экспозиции должна быть ограничена времена, которые не позволяют значительные уровни воспроизводства состоится в скважине. Мы рекомендуем, что общее время развития нематод находится под 66-67 ч. Хотя удобно, нематоды беременных тогда и начали egglaying. Тем не менее, мы нашли показания биолюминесценции из яичного препаратов можно пренебречь (не показан). Сур-5 промоутер приводом трансгенная экспрессия впервые обнаружены только два-два с половиной часа после оплодотворения на стадии 100 клеток ^{22 и} Chitinous яичной скорлупы, вероятно, ограничит въезд люциферина. Другие нашли, что куриных эмбрионов не вносят значительный вклад в метаболизм беременных взрослых. ²³ Тем не менее, условия, позволяющие для значительного производства потомства следует избегать. При желании, экспериментальная шкала времени может быть смещена назад: мы уже инициировал воздействия окружающей среды токсина в конце L3 личиночной стадии (36 ч) и осуществляется биолюминесценции и GFP измерения при 55 ч ² Кроме того, генетические фоны, которые условно стерильными. может быть использован для предотвращения производства потомства, как, например, FER-15 (b16) II; ПЭМ-1 (hc17) IV двойной мутант, который может поддерживаться при 15 ° С, но стерильно при 25 ° С. ²⁴ использованию FudR индуцировать стерильность не рекомендуется, поскольку это само по себе может повлиять нематод метаболизм. ²⁵ Анализ может также выполняться в штаммах с более проницаемыми кутикулы, такие как частичная с потерей функционная шины 8 мутанты, которые с множественной лекарственной чувствительны из-за повышения проницаемости наркотиков. ²⁶ Это будет способствовать более короткие выдержки и более низкие концентрации соединения. Условия для добавления люциферин этих нематод может также необходимо корректировать т.е. 1% ДМСО и 0,05% Triton-X100 в буфере люминесценции может не потребоваться для повышения доступности люциферин.

Протокол использует 1% ДМСО в качестве носителя для соединения доставки. Хотя это и не смертельно, эта концентрация ДМСО имеет некоторые биологические эффекты, как мы уже говорили в предыдущей публикации. ³ Многие из доступных библиотек наркотиков получают 100% ДМСО, в концентрациях, которые будут пригодны для анализов на основе клеток после разбавления автомобиля до 0,1%. Более высокие концентрации соединений требуются, чтобы получить ответы на C. Элеганс по сравнению с клетками человека, например, что часто невозможно провести анализы на менее 1% ДМСО. Опять же, использование штаммов сболее проницаемыми кутикулы может привести к тестированию с более низкими концентрациями автомобиля. Концентрации ДМСО выше, чем 1% не рекомендуется.

Время множество инкубации с люциферина до показаний следует придерживаться. Как было показано ранее, люминесценции достигает максимальных уровней в пределах второй минуте после добавления люциферин, оставаясь относительно стабильным в течение первых 5 мин, с последующим медленным постепенным снижением люминесценции в течение следующих 30 мин ^1. Кинетические реакции на конкретного химического вещества может быть осуществлено в течение этого начального этапа 30 мин после начального дозирования люциферин.

Протокол включает стадию голодания следующий набор яйца для достижения синхронизации населения нематод. Мы рекомендуем синхронизации тестовых нематода населения, так как различные этапы развития отличаются клеточных уровней АТФ и может по-разному реагировать на тестируемых соединений. При проведении голода в S комплектныесредней, в отличие от М9, инкубационные нематоды снабжено источником углерода (этанол), так что личинки не развиваются, но не полностью голодали. ^27,28 Было также показано, что задержанные L1-х нацелены на быстрое реагирование на питание и нормальную скорость роста L1 достигается в течение 3 ч, после еды становится доступным. ²⁹ Тем не менее, возможность того, что шаг голодание может изменить метаболизм C. Элеганс не может быть исключена. ³⁰ По этой причине длина от голода, не должен превышать 24 ч (18 ч достаточно для синхронизации). Некоторые лаборатории могут иметь возможность использования Copas Biosorter для синхронизации возрастной минуя стадию голодания. Другие лаборатории могут иметь предпочтение для расширения население нематод на твердом носителе (NGM пластин с OP50) до обесцвечивания (шаг 3.1), и это будет хорошо работать тоже. Мы используем S среду во время соединения воздействия в качестве стандартного среды для культивирования нематод, Howeveг другие средства массовой информации могут быть выбраны, например, K среды или EPA умеренно жесткой воде часто используются для экотоксикологических исследований. ^31,32

Протокол предоставляет средства на экран и определить кандидатов для дальнейшего тестирования с точки зрения воздействия на функции митохондрий. На этапе первичного скрининга вполне вероятно, что некоторые соединения будут пропущены из-за только один концентрации тестируемого, поэтому экраны препарат не следует считать исчерпывающим. Удар может быть подтверждено путем использования методов оценки различных аспектов функции митохондрий для потребления кислорода, например, C. Элеганс штаммы с GFP выражения митохондрий, пятна на митохондриальной мембраны потенциала и / или измерений АФК. ^16,33,34 Наибольшее значение методологии, чтобы иметь средства для скрининга большого количества соединений и / или условий, при многоклеточного организменном уровне, и главное, чтобы иметь возможность воспользоваться йе генетическая уступчивость С. Элеганс, чтобы исследовать механизмы действия. Методика может помочь ускорить и найти новые пути к открытию интересных соединений и задач. Предполагается, что комбинация датчика с генетическими фонов связанных с заболеванием человека для скрининга библиотек соединений в соответствующем контексте заболевания будут иметь много, чтобы предложить.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микропланшетный люминометр Orion II	Berthold Detection Systems		с инжектором и программным обеспечением Simplicity 4.2; передача данных в Excel по окончании измерения пластины
флуориметром FLx800;	Biotek		с программным обеспечением Gen5; передача данных в Excel в конце измерения планшета
Ks 130 базовая платформа для встряхивания	Ika	#0002980000
Innova 4349	Нью-Брансуик Научный		охлаждаемый инкубатор шейкер
Eppendorf центрифуга 5804R	Eppendorf		с ротором eppendorf A-4-44  (для 50/15  мл тубы)
Стрипэтка, Costar	Corning	#4489	Серологическая пипетка
Cellstar 50 мл тубы	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 мл тубы	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 мм тканевые культуральные планшеты	Greiner bio-one	#628160
Предметные стекла для микроскопа Superfrost	VWR	#631-0909
Стерильный шпатель	Corning	#3007; #3004	для взвешивания химикатов
0,22 мМ Millex GP фильтры	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1,5 мл	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 пластина для анализа	VWR	#3603	Черная пластина с прозрачным дном и крышкой
Nunc 96 Пластина для анализа лунок	Fisher Scientific	#236105	Белая пластина с крышкой
Реактив для резервуара 60 мл	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	используется в качестве кормушки для нематод в разделе протокола 4.4.1
Коробка для хранения/влажная камера	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 х 101 х 56,6 мм, используется как влажная камера с влажными бумажными полотенцами; 2x 96-луночные планшеты с крышками могут поместиться в одну, нижнюю сидящую сверху крышку микропланшета
Отбеливатель: Раствор гипохлорита натрия 4-4,99% Содержание хлора	Sigma Aldrich	#239305	Хранить в аликвотах при 4  ° С,  запечатать парапленкой для предотвращения потери хлора и покрыть фольгой
D-люциферин, калийную соль	Biotium Inc	# 10101-2	Молекулярные зонды также могут быть использованы в качестве поставщика; приготовьте запас 20 мМ в ddH2O, держите при -20 °°; C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Purity 99.99%Triton
X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute до 10% в ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans биолюминесцентные штаммы	Собственная лаборатория автора	PE254, PE255	содержат интегрированные матрицы feIs4 и feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] соответственно на хромосоме V и X; отбирать для однородной и сильной экспрессии luc::GFP методом флуоресцентной микроскопии (e. выбрать 15 червей) время от времени.
E. coli OP50	CGC
General Chemicals	Sigma Aldrich/Fisher Scientific