Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование CaCO 2-Cells по изучению транспорта липидов в кишечнике

19.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53086

⸱

20 августа 2015 г.

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

В этой статье

Краткое содержание

Клетки Caco-2 могут служить моделью in vitro для изучения энтероцитарного транспорта липидов и жирорастворимых лекарств/витаминов. Проницаемая мембранная система отделяет апикальный компартмент от базолатерального, в то время как система экспрессии лентивируса предлагает эффективный метод сверхэкспрессии генов. Выделение липопротеидов подтверждено методом ПЭМ.

Аннотация

Исследования усвоения жиров с пищей обычно проводятся с использованием животной модели, оснащенной лимфатической канюлей. Несмотря на то, что эта животная модель широко известна в качестве модели абсорбции жиров с пищей in vivo, используемые хирургические методы являются сложными и дорогостоящими. Генетическая манипуляция с животной моделью также является дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативная модель in vitro, возможно, более доступна, экономит время и менее сложна. Важно отметить, что модель in vitro позволяет исследователям исследовать энтероциты как изолированную систему, снижая сложность, присущую модели всего организма. В этой статье описывается, как клетки карциномы толстой кишки человека (Caco-2) могут служить моделью in vitro для изучения энтероцитарного транспорта липидов, а также жирорастворимых лекарств и витаминов. Объясняется правильное содержание клеток Caco-2 и приготовление их липидной смеси; Далее в нем обсуждается ценный вариант использования проницаемой мембранной системы. Поскольку дифференцированные клетки Caco-2 поляризованы, основным преимуществом использования проницаемой мембранной системы является то, что она отделяет апикальный компартмент от базолатерального. Следовательно, липидная смесь может быть добавлена в апикальный компартмент, в то время как липопротеины могут быть собраны из базолатерального компартмента. Кроме того, обсуждается эффективность системы экспрессии лентивируса в повышении экспрессии генов в клетках Caco-2. Наконец, в этой статье описывается, как подтвердить успешное выделение кишечных липопротеинов с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Введение

Исследования кишечной абсорбции пищевых жиров и жирорастворимых лекарственных препаратов и витаминов может быть проведена в естественных условиях с помощью свища модель лимфатических 1 - 4. Тем не менее, хирургические методы, вовлеченные не только сложно, но и дорого. Хотя в естественных условиях подходы, основанные на анализе фекальной может быть использован, они используются в основном для определения поглощение процентов от желудочно-кишечного тракта 2,5. Модель в пробирке описано в этой статье является более экономически эффективным, и методы, связанные, возможно, являются менее сложным. Генетические исследования модификации также более экономичным и менее трудоемким, когда они выполняются с использованием этой модели ин витро.

Так липидорастворимые материалы, которые принимаются до энтероцитами упакованы в липопротеинов 6,7, эффективность этой модели в пробирке, чтобы произвести липопротеины очень важно. Два основных intestinaл липопротеины хиломикронов и очень низкой плотности (ЛПОНП). Chylomicrons, определенные как липопротеинов с 80 нм или более в диаметре, получают строго в тонком кишечнике, когда липиды в большом количестве присутствуют в желудочно-кишечном просвете. Так как они являются крупнейшими липопротеины, хиломикроны являются очевидно наиболее эффективные транспортеры липидов. Эта модель в пробирке, который способен производить хиломикроны 8, может быть использован для изучения диетическое всасывание жира, жирорастворимых витаминов поглощения в кишечнике и полости рта липофильный биодоступность лекарства. Наличие жирорастворимых молекул, витаминов, лекарственных препаратов или в фракции липопротеинов является показателем их абсорбции в тонком кишечнике. Как обсуждалось ранее, эта модель может быть использована, чтобы улучшить пероральную биодоступность лекарства липофильный 6.

Эта статья описывает, как клетки Сасо-2 должна быть сохранена в мембрану или регулярных культуры ткани блюд, то как липидные миxture для стимулирования производства липопротеинов должны быть подготовлены, как лентивирусов система экспрессии может быть использован для достижения эффективной сверхэкспрессии, и как изолированного липопротеины должны быть проанализированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Техническое обслуживание Сасо-2 клетки

  1. Использование регулярных культуры ткани блюда
    1. Растаяйте клеток Сасо-2 из замороженного флакон, поместив флакон в водяную баню при 37 °, и сразу же добавить их в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды (15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS ) в Игла в модификации Дульбекко (DMEM)).
      1. Когда клетки Сасо-2 достигли 50-70% слияния, разделить их 1: 6 инкубацией клеток с 3 мл 0,05% трипсина / 0,53 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 ° С, пока они не отделены (15 мин) , Чтобы избежать образования комков клеток, смешать клеткам несколько раз осторожно пипеткой. Добавить 0,5 мл трипсином клетки в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 10 мл предварительно нагретой питательной среды.
    2. Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Избегайте закрученного блюдатак как это может привести к неравной дисперсии клеток.
    3. Поместите посуду на плоской поверхности в 37 ° C инкубатора поставляется с 5% CO 2. Наклонные поверхности могут также привести к неравной дисперсии клеток.
    4. Изменить питательных сред на следующий день после начала инкубации.
    5. Монитор клетки и записывать день они достигают слияния. Это займет около 1 недели для клеток, чтобы достичь слияния со дня их разделить.
    6. Замените носитель роста в два раза за неделю до клетки достигают слияния. После того, как клетки достигли слияния, изменить питательной среды через день. После клетки 7 дней после сливной измените носитель роста в день.
      Примечание: клетки готовы для экспериментов, когда они 13-дней после сливающихся (Рисунок 1). Поскольку клетки в конечном итоге становятся менее эффективными в производстве липопротеинов, использовать клетки, которые находятся между 13 до 17 дней после сливающихся 8. Перейдите к шагу 3 о том, как проводить эксперимент.
  2. Использование проницаемых мембран систему
    1. Семени клеток Сасо-2 в мембрану вставки, как описано в шаге 1.1.1.1. выше. Избегайте использования клеток из замороженного флаконе, поскольку их рост клеток, как правило, медленнее (период восстановления). Вкратце, добавить 0,5 мл трипсином клеток в апикальную камеру (верхний отсек), который содержит 10 мл предварительно нагретой питательной среды. Кроме того, добавьте 10 мл подогретого СМИ роста на базолатеральную камеры (нижний отсек).
      Примечание: Для лучшей практике, добавить питательную среду в апикальную камеру, а затем в базолатеральной камере. При удалении старых СМИ, удалить базолатеральный СМИ перед верхушечных СМИ. Избегайте тыкать поликарбоната мембраны, как это может привести к разрыву мембраны.
    2. Из-за плохой видимости клеток через поликарбонатную мембрану, семена ЦАС-2 клетки в регулярном блюдо культуры ткани с одинаковой плотности, и использовать это блюдо, чтобы судить клеток слияния.
    3. Следуйте ейТЭЦ 1.1.2-1.1.6 выше.

2. Джин Избыточная

  1. Использование регулярных подход трансфекции
    1. Семенной ЦАС-2 клеток на ткани блюдо культуры, как описано в 1.1.1.1.-1.1.4 выше.
      Примечание: Когда клетки около 40-50% сливной, они готовы для трансфекции.
    2. Добавить 67 мкл реагента для трансфекции в 472 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы.
    3. Добавить 23 мкг pLL3.7 усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP), 9 в трансфекции реагента / восстановленной смеси сыворотки СМИ.
    4. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Замените питательной среды клеток Сасо-2 "с 8 мл 10% FBS в DMEM.
    6. Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду.
    7. Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и баckward направлении, а затем в влево и вправо направлении.
    8. Поместите блюдо в 37 ° C инкубатора.
    9. Замените СМИ в блюдо с 10 мл питательной среды день после начала инкубации.
    10. Монитор экспрессию генов.
      1. Монитор экспрессию гена без 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол окрашивания (DAPI). Использование флуоресцентного микроскопа, определить процент клеток, которые зеленый. Процент представляет эффективность трансфекции.
      2. Монитор экспрессию гена с окрашиванием DAPI.
        1. Промыть клеток фосфатно-солевым буфером (PBS) в три раза.
        2. Зафиксировать клетки добавлением 10 мл 4% формальдегида в PBS (10 мин инкубации при комнатной температуре).
        3. Промыть клеток с PBS три раза.
        4. Инкубируйте клетки в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре с 8 мл PBS, содержащим 1: 500 DAPI, 1% БСА, 0,01% дигитонина.
        5. Промыть клеток с PBS три раза.
        6. Uпеть флуоресцентного микроскопа, определить количество клеток, которые зеленый / синий отношению к тем, которые являются синий (Рисунок 2 верхняя панель). Рассчитанная процент представляет эффективность трансфекции.
  2. Использование системы лентивирус избыточная экспрессия 10
    1. Семенной человека эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки в 15 см блюдо культуры ткани (10% FBS, в DMEM как их питательной среды).
      Примечание: Когда клетки около 60-70% сливной, они готовы для трансфекции.
    2. Добавить 162 мкл реагента для трансфекции в 1133 мкл восстановленных в сыворотке СМИ в микроцентрифужных трубки 11. Избегайте контакта неразбавленного трансфекции реагента со стенкой трубы.
    3. Добавить 24 мкг pLL3.7 EGFP (или другой конструкта), 15,6 мкг Rev элемент ответа (РРЭ), 6,0 мкг REV и 8.4 мкг вируса везикулярного стоматита гликопротеина (VSVG) в трансфекции реагента / гразвита сыворотки СМИ смесь.
    4. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Замените СМИ роста с 16 мл 10% FBS в DMEM.
    6. Добавьте ДНК / реагента для трансфекции / уменьшается в сыворотке СМИ смесь по каплям к блюду.
    7. Слегка встряхните посуду несколько раз в прямом и обратном направлении, а затем в влево и вправо направлении. Это нормально, чтобы увидеть некоторые из HEK293T клеток отдельных в этой точке.
    8. Поместите блюдо в инкубаторе.
    9. После 24 часов инкубации, заменить носитель в чашке с 25 мл питательной среды.
    10. На следующий день, собирать средства массовой информации роста, содержащий лентивирус (первый сбор).
    11. Повторите шаг 2.2.10, чтобы собрать больше лентивирус (вторая коллекция).
    12. Бассейн первый и второй сборник, и удалить остатков клеток путем центрифугирования (2500 мкг в течение 5 мин).
    13. Фильтр сбора с одноразовые бутылки верхней фильтра (0,45 мкм пор), исконцентрировать вирус центрифугированием сбор на 31400 х г в течение 2 ч при комнатной температуре (JA-20) ротора. Отметить дно центрифужную пробирку, где осадок находится. Декантировать супернатант, и оставить трубу перевернутой при комнатной температуре в течение примерно 15 мин.
    14. Ресуспендируют содержащую вирус осадок 100 мкл 1X PBS. Избегайте пузырей.
    15. Хранить концентрированный вирус при -80 ° С. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
    16. Определить оптимальное количество вируса необходимое для трансдукции клеток Сасо-2 путем титрования. Чтобы сохранить стоимость, использовать 24-луночного планшета (0,3 мл питательной среды / лунка) вместо 10 см культуре ткани блюдо для титрования.
      1. Добавить большее количество концентрированного вируса (0, 1, 2, 5, 10, 25, и 50 мкл / лунку), дополненной полибреном (конечная концентрация = 5 мкг / мл) в 40-70% сплошности клеток Сасо-2. Встряхнуть тарелку 24-а нежно, как описано в 1.1.2.
      2. Монитор их экспрессию генов (шаг 2.1.10.) (Рис 2 снизу4 панели).
    17. Так выражение трансгена, как правило, поддерживается, поддерживать трансдуцированных клеток для будущих экспериментов и постоянно следить за их экспрессию генов (шаг 2.1.10.).

3. Стимулирование липопротеина секрецию

  1. Использование регулярных блюдо культуры ткани
    1. Подготовка смеси липидов 100X путем смешивания 50 мг олеиновой кислоты, 40 мг лецитина и 48 мг таурохолата натрия. Довести объем до 900 мкл с PBS (достаточно для 8 блюд). Vortex липидной смеси энергично.
    2. Добавить 900 мкл липидной смеси 100X в 89,1 мл питательной среды. Смешайте и фильтровать липидов, содержащих носители. Конечные концентрации (1x) олеиновой кислоты, лецитин, и таурохолата натрия 2,0 мМ, 1,36 мМ и 1,0 мМ, соответственно.
    3. Добавьте 10 мл липидной-содержащей среде с клетками.
    4. Инкубируйте клетки с липидными-содержащей среде в течение 4 ч в 37° C инкубатор.
    5. Промыть клеток с PBS три раза.
    6. Добавьте 10 мл питательной среды к клеткам, чтобы собрать секрецию липопротеинов.
    7. Инкубируют в течение 2 ч в 37 ° C инкубаторе.
    8. Соберите липопротеинов, содержащих носители.
  2. Использование проницаемых мембран систему
    1. Выполните шаги 3.1.1-3.1.2 подготовить липидной смеси.
    2. Добавьте 10 мл липидного средах, содержащих в апикальную камеру и 10 мл питательной среды в базолатеральной камере.
    3. Инкубируют в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе. Соберите липопротеинов, содержащих средств массовой информации в базолатеральной камере.

4. Выделение липопротеинов (рисунок 3)

  1. Удалить остатков клеток от липопротеинов, содержащих сред центрифугированием (2000 х г в течение 5 мин).
  2. Слейте СМИ в 50 мл трубки.
  3. Добавить 5,95 г хлорида натрия в средствах массовой информации.
  4. Если SAmple будут проанализированы ТЕА, добавить 1 ингибитор протеазы коктейль таблетки для поддержания целостности липопротеинов.
  5. Довести объем до 23 мл с водой (1,2 г / мл NaCl плотность раствора).
  6. Растворите растворенные вещества полностью.
  7. Декантировать весь раствор в ультрацентрифужную пробирку из поликарбоната.
  8. Осторожно накладывать плотность раствора 1,2 г / мл с 0,5 мл воды (1,0 г / мл) плотности.
  9. Баланс трубки по весу, а не по объему.
  10. Аккуратно загрузите пробирки в T865 ротора.
  11. Спин образцов в ультрацентрифуге при 429460 х г в течение 24 ч при 4 ° С.
  12. Сразу изолировать верхнюю 0,5 мл раствора, осторожно пипеткой. Держите трубку, как до сих пор, как это возможно.

5. Анализ ПЭМ

  1. Подготовка 5 мл 2% фосфовольфрамовой кислоты (вес / объем) и доведения рН до 6,0.
  2. Фильтр 2% фосфовольфрамовой кислоты с помощью шприца фильтра (размер пор: 0,2 мкм).
  3. Падение 20 мкл образца липопротеинов на стерильную чашку.
  4. Падение 20 мкл фильтрованного 2% фосфовольфрамовой кислоты рядом с образцом на одной тарелки.
  5. Аккуратно падение ЭМ сетки с тупой стороны отдыхает на образце.
  6. Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин.
  7. Аккуратно нажмите на сторону сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить образец из сетки.
  8. Осторожно опустить EM сетки с тупой стороны отдыхает на 2% фосфорно кислоты.
  9. Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин.
  10. Аккуратно нажмите на стороне сетки ЭМ на фильтровальной бумаге, чтобы удалить фосфовольфрамовой кислоты из сетки.
  11. Использование ПЭМ, захватить изображения липопротеинов (рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлены нормальные 13-дней после сливной Сасо-2 клетки. Появление куполообразных структур и капель внутриклеточных липидов характерны дифференцированных клеток Сасо-2. Когда клетки Сасо-2 не разошлись одинаково во посева, они будут группироваться и зарастают в некоторых районах блюдо; и там будет несколько областей в блюдо без каких-либо клеток. Вихревой и размещение тарелки на наклонной поверхности, следует избегать. Важно также отметить, что после сливной клетки Сасо-2, более восприи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье, эти две системы, которые могут быть использованы для поддержания Сасо-2 клетки описаны, а именно, регулярные блюдо культуры тканей и мембрану. Преимущества с использованием проницаемой мембраны системы включают в себя разделение апикального и базолатеральной отсеки, а также возможность для инкубации липидной смеси и сбора секреции липопротеинов одновременно. Тем не менее, мембрана вставки являются дорогостоящими, и их поликарбонатную мембрану не позволяет хорошей видимости клеток. Одним из преимуществ это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Seed Grant Award от Калифорнийского колледжа фармацевтики Северогосударственного университета (AMN). Авторы хотели бы поблагодарить Фармацевтический колледж Калифорнийского университета Нортстейт за покрытие расходов на публикацию этой статьи, а также Джорджа Тэлботта за его помощь в редактировании этой рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMVWR16750-112Предварительно подогрейте питательную среду в отдельной чашке для культуры тканей перед добавлением клеток
FBSFisher 3600511Мы не нагреваем инактивацию нашей сыворотки
ТрипсинVWR45000-660Клетки можно промыть PBS перед лечением трипсином 
Проницаемая мембранная системаFisher7200173чашка 10 см, размер пор 3 мм, поликарбонатная мембрана
10 см чашкаFisher08-772-EЧашка для культуры тканей
15 см чашкаFisher08-772-24Чашка для культуры тканей
24 лунки ЧашкаFisher12565163Тарелка для культуры тканей
Реагент для трансфекции на основе липидовFisherPRE2691Может быть заменен другим реагентом для трансфекции
Уменьшенная сывороточная средаInvitrogen11058021Для трансфекции
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
Фильтр для бутылкиFisher97611200,45 мм пор
PolybreneFisherNC984045410 мг/мл
Олеиновая кислотаSigma01383-5GПредотвратить цикл замораживания-оттаивания
Лецитин ФишерIC10214625Яичный лецитин 
Таурохолат натрияFisherNC9620276Продукт снят с производства; альтернативный каталожный номер: 50-121-7956
Коктейльная таблетка ингибитора протеазы (без ЭДТА)Fisher5892791001Используется в основном для образцов, требующих анализа ПЭМ
Ультрацентрифужная трубка из поликарбонатаFisherNC9696153повторное использование многократно приведет к сворачиванию крышки пробирки
для ультрацентрифужной пробиркиFisherNC9796914Для снятия трубки/крышки с ротора требуется инструмент
ШприцFisher50-949-261Одноразовый
шприц-фильтрFisher09-719CРазмер пор = 0,2 мм; нейлон
Фосфовольфрамовая кислотаFisherAC208310250Для приготовления 2% фосфовольфрамовой кислоты, pH 6,0
ПинцетFisher50-238-62Экстра тонкий и прочные наконечники
Формвар/карбоновая сеткаFisher50-260-34Формвар/карбоновая пленка квадратная сетка 400 Медь
для культуры тканей

Ссылки

  1. Drover, V. A., et al. CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood. J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).
  2. Nauli, A. M., et al. CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine. Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).
  3. Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).
  4. Lo, C. -M., et al. Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).
  5. Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption. Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).
  6. Nauli, A. M., Nauli, S. M. Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability. Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).
  7. Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein. Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).
  8. Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm. Physiol Rep. 2 (6), (2014).
  9. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Pottekat, A., et al. Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release. Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).
  12. Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells. Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).
  13. Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport. Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).
  14. Luchoomun, J., Hussain, M. M. Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly. J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Система с проницаемой мембранойультрацентрифугирование в градиенте плотности хлорида натрияпросвечивающая электронная микроскопиясекреция липопротеинованализ хиломикроновлентивирусная экспрессионная системавыделение кишечных липопротеиновприготовление липидной смеси
Использование CaCO 2-Cells по изучению транспорта липидов в кишечнике
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.