Твердые липидов Наночастицы (SLNS) для внутриклеточного Ориентация Приложения

Краткое содержание

В этом исследовании был описан метод синтеза ультрамалых популяций биосовместимых наночастиц, а также несколько методов in vitro для оценки их клеточных взаимодействий.

Аннотация

Средства доставки на основе наночастиц показали большие перспективы для внутриклеточных приложений, обеспечивая механизм специфического изменения клеточной сигнализации и экспрессии генов. В предыдущем исследовании был продемонстрирован синтез сверхмалых твердых липидных наночастиц (SLN) для местной доставки лекарств и обнаружения биомаркеров. SLN являются хорошо изученным примером системы доставки наночастиц, которая стала многообещающим средством доставки лекарств. В этом исследовании SLN были загружены флуоресцентным красителем и использовались в качестве модели для изучения взаимодействий частиц и клеток. Метод фазовой инверсии температуры (PIT) был использован для синтеза ультрамалых популяций биосовместимых наночастиц. Для установления соответствующих уровней дозирования до начала исследований взаимодействия наночастиц с клетками использовали анализ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Кроме того, первичные дермальные фибробласты человека и дендритные клетки мыши подвергались воздействию SLN, загруженного красителем, с течением времени, а взаимодействие в отношении токсичности и поглощения частиц было описано с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Это исследование показало, что сверхмалые SLN, как система доставки наночастиц, подходят для внутриклеточного нацеливания на различные типы клеток.

Введение

Средств его доставки на основе наночастиц показали большие перспективы для внутриклеточных нацеленных приложений, обеспечивая механизм специально изменить сотовой сигнализации и экспрессию генов. Эти транспортные средства могут быть загружены с препаратами, белков и нуклеиновых кислот, предназначенных для воздействия клеточных ответов и достичь желаемого эффекта в тканях-мишенях. Многие типы наноносителей были исследованы на терапевтического и диагностического пользу в том числе липидов, полимеров, кремний и магнитных материалов. Эти системы являются привлекательными из-за их потенциала для локализованной доставки лекарств, повышения терапевтической концентрации в тканях-мишенях, и снижение системной токсичности.

Твердые липидные наночастицы (SLNS) являются хорошо изученным примером системы доставки наночастиц, которая возникла в качестве перспективного средства доставки лекарственных в последние годы. SLNS может быть легко сформулированы для нескольких приложений, включая био-зондирования ^{1, 2,} косметики и тЛечебно доставка ^3-7. Их полезность проистекает из того факта, что они полностью состоит из рассасывающихся, нетоксичных липидов, что приводит к усилению биосовместимости. Во время синтеза, липофильных лекарственных средств могут быть включены в SLn транспортных средств, тем самым увеличивая растворимость лекарственного и пригодность для парентерального введения. SLN транспортные средства также помогают стабилизировать инкапсулированные терапии, уменьшая их деградации и оформление, и максимизации терапевтического действия. Эти транспортные средства, особенно хорошо подходит для длительного действия с контролируемым высвобождением препаратов из-за их стабильности при температуре тела ^3,4,8,9. Важно отметить, что инкапсуляция наркотиков в липидных наночастиц изменяет внутренние Фармакокинетические профили молекул наркотиков. Это обеспечивает потенциальное преимущество, позволяя контролируемое высвобождение лекарств с узким терапевтическим индексом. Скорость высвобождения SLn-терапии включены могут быть настроены на основе скорости деградации липидов или скорости диффузии лекарственного средства влипидов матрица.

SLNS часто инженерии накапливаться в тканях-мишенях конкретных. Например, их размер (как правило, больше, чем 10 нм) потенцирует удержание в обращении, где вытекающей сосудистая опухолевой ткани облегчает осаждение. Кроме того, путь введения частиц, как было показано изменить биораспределение с потенциалом для решения конкретных физиологических структур, таких как лимфатические узлы ^10,11. По отложения в тканях-мишенях, достижения соответствующих клеточных взаимодействий и возможной интернализации наночастиц является сложной задачей из-за способности клеточных мембран для селективного управления потоком ионов и молекул в и из клетки ^12. Для облегчения клеточное поглощение, можно изменить наноносителей с специфическими лигандами, включая пептиды, небольшие молекулы, и моноклональных антител ^13,14. Некоторые механизмы, включая как пассивного проникновения и активного транспорта наночастицчерез клеточную мембрану были описаны ранее ^3,12,15. В общем, было продемонстрировано, что клетки-наночастиц взаимодействия зависит от физико-химических свойств наночастиц в том числе размер, форма, поверхностный заряд и поверхностной химии, в дополнение к параметрам соты, таких как тип клеток или фазе клеточного цикла ^12.

Предыдущая исследования показали, синтез суб-10 нм SLNS для местного и ¹⁶ биомаркеров приложений обнаружения ¹ с использованием метода ¹⁷ температура обращения фаз (PIT). Это нежный метод синтеза, где ² композиция остается постоянной, пока температура постепенно изменяется. Непрерывное перемешивание нагретого раствора, при охлаждении результатам RT в наноэмульсии. Этот процесс приводит к синтезу SLNS с меньшим размером частиц, чем ¹ сообщалось ранее, используя различные методы синтеза липидов нанoparticles ^17-22. Полученную фактический размер менее 20 нм, обеспечивает преимущество для нацеливания внутриклеточных применения благодаря увеличенной площади поверхности и возможности для обеспечения клеточных взаимодействий.

Схема SLNS, предназначен для доставки флуоресцентного красителя или терапевтического, показан на рисунке 1. В SLNS состоят из липидов внутреннего (например, линейные алканов), что позволяет включение липофильных соединений (например, красителей или терапевтических) и поверхностно-активного вещества внешней (например, линейные неионное ПАВ) окружен водой. В этом исследовании, были загружены SLNS флуоресцентным красителем и использовали в качестве модели для исследования частиц клеточных взаимодействий. Первичные фибробласты кожи человека и мыши дендритные клетки подвергали воздействию красителя загружены SLN с течением времени для того, чтобы охарактеризовать взаимодействие по отношению к токсичности и поглощение частиц. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-diphenylphenyltetrazolium бромид (МТТ) был Utiliзет, чтобы установить соответствующие уровни дозировки. Флуоресцентная микроскопия и проточной цитометрии было два методы, используемые для изучения поглощения частиц в пробирке.

Рисунок 1. Схема СЛН показывающую основные компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Протокол

1. Обработка SLNS

1. Синтез SLNS
   Примечание: Используйте метод PIT ^1,17,20 подготовить нм SLNS ¹ суб-20.
   1. Используйте асептики, биореагентов или культуры клеток реагенты класса, и стерильные материалы (например, пипетки, шпатели, флаконы и т.д.).
   2. Используйте шкаф биобезопасности для синтеза SLNS (рис 2).
   3. Смешайте 0,6 мг флуоресцентного красителя (нильский красный (NIR), концентрация НИР примерно 0,3 мг / мл) и 0,10 г Heneicosane (липидный, 5 вес / вес% липидов концентрации) в пробирку (15 мл), со-расплава при 90 ° С, и размешать.
   4. Добавить 0,11 г полиоксиэтилен (10) олеиловый эфир (поверхностно-активное вещество, 5,5 вес / вес% поверхностно-активного вещества концентрации). Полученную смесь CO-расплава при температуре 90 ° С и перемешивают.
   5. Добавить 1,79 г стерильной воды к смеси, тепловой до 90 ° С, и перемешать до прозрачного наноэмульсия не образуется.
      Примечание: В продолжение перемешивания и регулируемого охлаждения, SLNs создаются. Эти условия вызывают инверсию эмульсии вода-в-масле в эмульсию масло-в-воде. Липофильные молекулы, такие как Нир раздела в липидных капель.
   6. Приготовьте наноэмульсии параллельно без добавления флуоресцентного красителя, чтобы служить в качестве контрольного образца. Смешайте 0,10 г Heneicosane и 0,11 г полиоксиэтилен (10) олеиловый эфир во флакон (15 мл) со-расплава при температуре 90 ° С и перемешивают.
      1. Добавить 1,79 г стерильной воды к смеси, тепловой до 90 ° С, и перемешать до прозрачного наноэмульсия не образуется.
   7. Кроме того стерилизации каждый наноэмульсии используя стерильный фильтр 0,2 мкм.
   
   Рисунок 2. Схема синтеза SLNS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. Размер частиц и Полydispersity
   1. Используйте динамического рассеяния света (DLS) для измерения размера частиц и полидисперсности SLNS ¹ с использованием стекла кюветы и инструмент предназначен для измерения размера частиц.
   2. Перед проведением измерений образцов, измерения размеров частиц двух известных стандартов в соответствии с протоколом производителя для стандартов подготовки и измерения.
   3. Заполните стеклянную кювету с 1,5 мл стандартного раствора и измеряют стандартный раствор с использованием тех же условий измерения, как образцы.
      Примечание: Предыдущая шаг повторяется для каждого стандарта.
   4. Измерьте образцы подготовленный. Для каждого, использовать следующие экспериментальные параметры: время пробега 100 сек, преломления воды (1.33), вязкость воды при 20 ° C (1,002 мПа · сек).
      Примечание: Этот метод использует частоты сдвигается свет для измерения размеров наночастиц.
   5. Сообщить средний диаметр частиц и полидисперсность ПартиейРаспределение размера НКУ.
3. Точка плавления и скрытой теплоты плавления
   1. Используйте дифференциальный сканирующий калориметр (DSC), оснащенного автоматической пипетки и источника охлаждения жидким азотом, чтобы исследовать термическое поведение SLNS ^1.
   2. Внесите в подготовленные SLNS в 40 мкл алюминиевую кастрюлю с массой примерно 25 мг и герметизации кастрюлю с помощью универсального обжимных щипцов нажмите, чтобы свести к минимуму потерю влаги во время сканирования DSC.
   3. Измерьте каждый наноэмульсии от 5 до 80 ° C.
   4. Сообщить точка плавления и скрытой теплоты плавления от участка ДСК, где долина представляет точку плавления и интеграл от площади под кривой на графике ДСК, деленное на количество материала представляет собой скрытую теплоту плавления.

2. Взаимодействие с SLNS фибробластов и дендритных клеток

1. Культура первичных фибробластов человека
   1. Культура основной человеческой фантастическиефибробластов в соответствии с инструкциями завода-изготовителя в жидкой среде для культуры фибробластов кожи человека (средних 106), с добавлением низкого дополнением рост сыворотки (МСУ) комплект. Поддержание клеток в увлажненной атмосфере при 37 ° С, 5% СО ₂ и субкультуры по достижении 80% слияния.
   2. Для обоих МТТ и анализа изображений, семенных клеток в 96-луночный планшет при плотности 2 х 10 ⁴ клеток на лунку, и позволяют прийти в равновесие при 37 ° CO / N до SLN воздействия.
   3. В нулевой момент времени, разбавленные SLNS в полной среде, как указано (рисунок 4), по отношению к концентрации липидов, и добавить 10 мкл на лунку в каждую лунку репликации в 96-луночный планшет.
   4. Поддержание клеток при 37 ° С, _5% СО 2, в течение инкубационного периода.
2. МТТ Анализ токсичности
   1. Через 24 часа инкубации с SLNS, определить жизнеспособность клеток с использованием МТТ, в соответствии с протоколом производителя.
   2. Промыть клетки один раз и добавить свежую среду в каждую лунку (100 мкл / лунку). Убить контрольные лунки путем инкубации в 70% -ном растворе метанола в течение 10 мин перед заменой свежей средой.
   3. Добавить МТТ реагента (10 мкл на лунку) в каждую лунку микропланшета и инкубируют O / N при 37 ° С.
   4. После вывода / N инкубации, растворения кристаллов внутриклеточные Formazin с прилагающимся раствором моющего средства (100 мкл на лунку) в соответствии с протоколом производителя.
   5. После 3 ч инкубации при комнатной температуре, получают значения абсорбции при длине волны измерения 570 нм с использованием микропланшет-ридера.
      Примечание: МТТ реагент, используемый должно быть меньше, чем 1% (вес / объем) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-дифенил-тетразолия бромидом.
3. Флуоресцентной микроскопии
   1. В определенные моменты времени после дозировки фибробластов с SLN, мыть фибробласты дважды стерильной фосфатным буферным раствором (PBS) и зафиксировать в течение 10 мин с холодным 70% -ным метанолом.
   2. Через 10 минЗаменить метанола с PBS и захвата изображения с помощью инвертированного микроскопа, используя полосу пропускания (BP) 690/50 нм набор фильтров.
4. Культура костного мозга мыши дендритных клеток
   1. Индуцируют костного мозга мыши, полученные дендритные клетки (BMDC), как описано ранее ^23,24. Вкратце, пластина одной клетки суспензии C57BL / 10 костного мозга в 100 мм чашках Петри на 2 ^× 10 6 / пластины с рекомбинантный мышиный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, 300 ед / мл) и рекомбинантный мышиный IL-4 (В-клеточным стимулирующим фактором, 200 Ед / мл). Изменить СМИ каждые 3 дня.
   2. На 7 день, добавить НИР-нагруженные SLNS к блюдам в конечной концентрации 0,5 и 5,0 мкг / мл липида и поддержания клеток в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение требуемого времени экспозиции.
   3. Сбор клеток из блюд путем аспирации всех средств массовой информации в своей тарелке, собирая его в 50 мл трубки, с последующей тщательной промывкой пластины (выбить затягивая объявлениекогерентные клетки) с 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащем 4 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Собирают полученное клеточной суспензии в той же пробирке на 50 мл.
5. Оценка SLNS Регистрации с помощью проточной цитометрии
   1. Определить концентрацию суспензии клеток, полученной в пункте 2.4.3 и распространять 3x10 ⁵ клеток в 12 мм х 75 мм с круглым дном FACS трубы.
   2. Промыть клеток путем добавления 1 мл PBS, а затем центрифугируют пробирки в течение 5 мин при 400 х г при температуре 4 ° С.
   3. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку с 100 мкл PBS / 2 мМ ЭДТА / 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (окрашивание буфер), содержащим анти-CD11c-FITC моноклональных антител (0,25 мкг / мл конечная). Инкубировать в течение 30 минут на льду в темноте.
   4. Промыть клеток с 1 мл PBS и затем центрифуги трубки в течение 5 мин при 400 х г при температуре 4 ° С.
   5. Удалите супернатант и ресуспендируют каждыйосаждения с 400 мкл окрашивающего буфера. Клетки готов к приобретению образцов с цитометра потока (возможно, оснащенного синего и красного лазеров).
   6. Использование проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, оценки уровня включения SLNS по ДК стробирования на население CD11c + клеток (FITC положительный) и сравнивая интенсивность флуоресценции SLNS-связанные (измеряется в каналах PerCP-Cy5.5 или APC).

Результаты

Способ PIT был использован для синтеза SLNS и температура обращения фаз была определена с использованием водяной бани. Образцы медленно нагревают и осторожно перемешивают, пока раствор не появилась ясно. Температура инверсии фазы для SLNS сделаны с помощью heneicosane липида 45 ° С. В таблице 1 приведены размеры частиц, полидисперсности, температуру плавления и скрытой теплоты плавления для SLNS. В SLNS синтезированные с использованием условий обработки, описанных выше в результате управления SLNS и НИР...

Обсуждение

В этом исследовании, синтез SLNS и их применимость для внутриклеточных нацеленных приложений были изучены. Эти наночастицы биосовместимые показали обещание как средства доставки для нескольких приложений, включая поставки наркотиков, сайленсинга, вакцин и технологий ^25-30. Крохотные SLNS были синтезированы с использованием легкое процесс, были исследованы их взаимодействия с первичными клетками кожи и первичных иммунных клеток. SLNS были разработаны, чтобы включить инкапсуляцию флуоресцентного красителя (NIR)...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	Биореагент, подходящий для флуоресценции, ≥ 98,0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10 Sigma		P6136	Brij 97, C18-1E10, Полиоксиэтилен (10) олеиловый эфир
Вода	Sigma	W3500	Стерильно-фильтрованный, Биореагент, подходит для клеточных культур
Шприц-фильтр 0,2 & микро; m Supor Membrane с низким связыванием белков	Life Sciences	PN4612	Непирогенный
наноtrac Ultra	Microtrac	серийный номер U1985IS	Инструмент
Дифференциальный сканирующий калориметр	Mettlet-Toledo		Instument
Первичные фибробласты человека	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Стерильная жидкая среда для культивирования дермальных фибробластов человека.
Набор добавок для снижения роста в сыворотке крови (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	Все компоненты полного набора для
пролиферации клеток	Trevigen	4890-025-K	Чувствительный набор для измерения пролиферации клеток на основе восстановления соли тетразолия, 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолия бромида (МТТ)
Safire2 микропланшетный ридер	Tecan	----
Инструмент Фосфат буферный солевой	Sigma	P5493	Для молекулярной биологии
Рекомбинантный мышиный GM-CSF	Пепротех	315-03	>97%, по SDS-PAGE в восстановительных условиях и визуализируется серебряным окрашиванием.
Мышиный рекомбинантный ИЛ-4	Пепротех	214-14	>97%, по SDS-PAGE в восстановительных условиях и визуализируется серебряным окрашиванием.