Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол, основанный на срезах спинного мозга культивировали на нескольких матриц электродов для изучения функциональной регенерации проприоцептивных соединений в пробирке.

Аннотация

Взрослые высшие позвоночные имеют ограниченный потенциал восстановления после травмы спинного мозга. Недавно появились доказательства того, что проприоспинальные связи являются многообещающей мишенью для вмешательства для улучшения функциональной регенерации. До сих пор не существует модели in vitro, которая позволяла бы исследовать функциональное восстановление проприоспинальных волокон. Поэтому была разработана репрезентативная модель, основанная на двух органотипических срезах спинного мозга эмбриональной крысы, культивируемых рядом друг с другом на многоэлектродных решетках (МЭА). Эти срезы растут и в течение нескольких дней in vitro срастаются по бокам друг к другу. Конструкция используемых МЭА позволяет выполнять нанесение повреждений скальпельным лезвием через этот участок сращения без нанесения повреждений МПС. Срезы показывают спонтанную активность, обычно организованную в всплески сетевой активности, и могут быть охарактеризованы пространственные и временные параметры активности, такие как местоположение источников всплесков, скорость и направление их распространения, а также задержки между всплесками. Используя эти функции, можно также оценить функциональную связь срезов, вычислив количество синхронизированных пакетов между двумя сторонами. Кроме того, срезы могут быть морфологически проанализированы путем выполнения иммуногистохимического окрашивания после записи.

В этой модели объединены несколько преимуществ используемых методов: срезы в значительной степени сохраняют исходную архитектуру ткани с неповрежденной локальной синаптической схемой, ткань легко и многократно доступна, а нейронная активность может быть обнаружена одновременно и неинвазивно в большом количестве точек с высоким временным разрешением. Эти особенности позволяют исследовать функциональную регенерацию внутриспинальных связей в изоляции in vitro сложным и эффективным способом.

Введение

Органотипической срез культуры центральной нервной системы (ЦНС) широко используются для изучения различных физиологических и патологических явлений идущие от нейронов развития с нейродегенерацией. По сравнению с культурами клеток диссоциированных, органотипической ломтики имеют преимущество большей сложностью с интактной цитоархитектуры и местного синаптической схемы. В то же время, ткань может быть проанализирована в изолированной форме без необходимости вовлечь Сложность в целом в естественных условиях. Кроме того, легко и повторил доступ к клеткам выбора является оправданным, внеклеточный среда может быть точно контролировать и, как правило, модели, в пробирке являются менее дорогостоящими, чем их коллеги в естественных условиях. В последние годы, различные исследования представлены поразительные сходства между профилями развития долгосрочных культур по сравнению с аналогичным живых животных ^1,2. Было показано, что нейрональные цепей различного ЦНС регио-нс выразить спонтанную сетевую активность в ходе развития и органотипической ломтики частично сохранить этот феномен ^{3 -7.} Изолированные препаратах спинного мозга были особенно используется для исследования генерации ритма ⁶ и формирование нейронных цепей ^1.

Способ записи спонтанной активности органотипических срезов культуры их сверху мульти-электродных массивов (МПС). Эти устройства содержат несколько электродов, которые могут контролировать внеклеточные потенциалы, генерируемые потенциалов действия из многочисленных клеток одновременно (многоквартирных записи). Высокая временное разрешение МПС записей может быть использован для восстановления динамики точные деятельности в пределах данной нейронной цепи. Кроме того, в отличие от патча зажима технику является неинвазивным, которая позволяет долгосрочные результаты измерений и в том, что нейроны не влияет на их поведение.

Fили цель данного исследования, сочетание органотипических спинного мозга сокультурах и многоузловых записей был использован для исследования функционального регенерацию в спинном мозге. Так взрослых высших позвоночных были ограниченный потенциал, чтобы оправиться от повреждения спинного мозга, различные стратегии были изучены, чтобы способствовать регенерации после повреждения спинного мозга. Пока Кортикоспинальных тракта, как правило, был моделью система выбора для таких исследований. Эти эксперименты, как правило, отнимает много времени, дорогим и требует больших когорт животных из-за высокой изменчивости в пределах одной группы. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что проприоцептивных соединения (нейроны, которые полностью заключенных внутри спинного мозга) могут играть ключевую роль в процессе восстановления после повреждений спинного мозга ^8. Эти волокна трудно учиться в естественных условиях без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Bonnici и Kapfhammer ⁹ используется продольный спинной мозгломтик культуры послеродовых мышей в качестве альтернативного подхода. После выполнения механические повреждения они проанализировали полуколичественно морфологическое восстановление аксонов между сегментов спинного мозга. Они наблюдали, но не менее ни один аксоны, пересекающих сайт поражения в культурах, вырезанных в зрелом возрасте. В отличие от этого, культур, которые были повреждениями в молодом этапе отображается большое количество регенерации аксонов 5 - 7 дней после повреждения. Тем не менее, доказательство функциональных связей не была представлена.

Таким образом, развитие представителя в модели пробирке проприоцептивных волокон, позволяет исследовать функциональное регенерации может быть ценным инструментом для расширить наши знания о регенеративных процессов в спинном мозге.

Протокол

Уход за животными было в соответствии с руководящими принципами, утвержденными местными органами власти швейцарских (Amt für Landwirtschaft унд Натур суд кантона Берн, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, утверждение ЯРБ. 52/11 35/14 и). Эти руководящие принципы находятся в согласии с Директивой Европейского сообщества 2010/63 / ЕС.

Примечание: Работа в капюшоне ламинарного потока с стерильных инструментов и решений для всех этапов 1 - 5, включая суб-шагов.

1. Подготовка МЭС

Примечание: МЭС состоят из стеклянной подложки, микро-изготовлены металлические электроды и СУ-8 полимер изоляционного слоя (также см Tscherter др. ^3). Для целей данного исследования, коммерчески доступные МПС были заказаны с собственную структуру матрицы электродов (Рисунок 1 & В). В 68 электроды расположены в прямоугольной сетке, который разделен на две зоны с помощью 300 мкм широкого паза свободного электродов, электрческие провода и изоляции. Каждый электрод 40 х 40 мкм, и они разнесены друг от друга на 200 мкм от центра до центра. Четыре больших боковых электрода расположены вокруг участка записи. Они отличаются от других коммерчески доступных стандартных МПС в их размера (21 мм х 21 мм), и они не имеют фиксированного записи камеры.

1. Для дезинфекции промывочных МПС в 100% -ном этаноле (2х), 70% -ным этанолом (1x) и дистиллированной воды (2 раза), по крайней мере 30 сек каждый. Дайте высохнуть. Положите 10 - 12 МПС в чистой стеклянной чашке Петри (150 мм х 25 мм) и закройте крышку.
2. Автоклав МПС в течение 20 мин при 120 ° С. Хранить при комнатной температуре.
3. Подготовка раствора для покрытия (см список материалов) для МПС и хранить аликвоты при -20 ° С.
4. Положите каждый МЭС в индивидуальном стерильную чашку Петри (35 мм х 10 мм).
5. Использование охлажденного пипетки поместить по 150 мкл охлажденного раствора покрытия поверх электродов и закрыть крышку чашки Петри. После 10 мин, проверить пузырьков воздуха в верхней частиэлектроды и осторожно удалить их с обрезиненным шпателем, если это необходимо. Пусть остальные в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Аспирируйте остатки раствора для покрытия, мыть 1x с среде, оптимизированной для дородовой и эмбриональных нейронов и 2х с дистиллированной водой, стерильным. Если МПС не используются до следующего дня, держать их в дистиллированной воде, стерильном при 37 ° С в инкубаторе O / N. В противном случае, пусть напрямую сухой при комнатной температуре.

2. Состав, необходимые для подготовки и роста органотипической культур

1. Подготовка кальция без промывочного раствора (см список материалов).
2. Восстановить куриный плазмы в промывочного раствора (1: 1, слегка встряхнуть, во избежание образования пузырьков), центрифуги при 3000 мкг в течение около 20 мин и сливают четкое содержание в стерильную пробирку. Алиготе 200 мкл в криопробирок и хранят при -20 ° С.
3. Развести тромбина из бычьей плазмы соответственно (200 Ед / мл) и стерильной фильтр (0,2 мкм пор фильтра). Алиготе 200 мкл в crytotubes и хранить при -20 ° C.
4. За 30 культур подготовить 100 мл питательной среды (см список материалов).

3. ткани спинного мозга Препарирование

Примечание: урожайность процедуре в зависимости от количества эмбрионов, ломтики спинного мозга в течение примерно 25 - 35 совместных культурах и получают внутри колпака с ламинарным потоком в стерильных условиях.

1. Применить смертельную дозу фенобарбитала (0,4 мл) в родном животного внутримышечно. Подтвердите глубокого наркоза путем проверки педали снятие рефлекс. Доставка эмбрионов крыс E14 от кесарева сечения и жертвоприношения обезглавливания.
2. Передача органам эмбрионов в чашке Петри заполнена стерильной, охлажденной, промывочного раствора.
3. Выполнение одного полного разреза поперечный скальпелем выше задних конечностей и другой выше передних конечностей и удалить конечности от тела. Далее, сделать разрез во фронтальной плоскости, чтобы отделить внутренние органы от задней части, содержащей спинной сотрудничестварадиолярии
4. Для нарезки, передавать обратные части, содержащие спинной мозг по одному на монтажной диска и разрезают на участки толщиной 225 мкм - 250 с измельчителем ткани. Положите капли промывочного раствора на нарезанным ткани и передавать ломтики с помощью шпателя 35 мм х 10 мм чашки Петри, заполненные стерильной, охлажденной, промывочного раствора.
5. Для каждого среза отдельно, рассекают спинной мозг от оставшихся ткани. Оставить спинальных ганглиях прилагается.
6. Пусть ломтики отдохнуть в течение 1 ч при 4 ° С.

4. Монтаж ткани спинного мозга ломтики на МПС

1. Подогреть стерильную питательную среду в инкубаторе (37 ° С, слегка отвинтить крышку для оксигенации).
2. Позиция МПС стерильными пинцетами с обрезиненным наконечников при комнатной температуре в чашки Петри с помощью стереомикроскопа с электродной решетки в фокусе. Сосредоточьте 6 мкл каплю куриного плазмы на чистой, без пыли, и стерильной массива электродов. С помощью небольшой лопаточки аккуратно сдвиньтедва позвоночника разделы мозга с вентральной стороны друг против друга в плазме капли. Не прикасайтесь к электродам, с лопаточкой.
3. Добавить 8 мкл тромбина вокруг курицы плазмы капли. С помощью кончика пипетки тромбина, тщательно перемешать и распространение куриного плазмы / тромбина смеси вокруг двух ломтиков. Опять же, не прикасайтесь к хрупкому массив электродов непосредственно. Перед коагуляции, аспирации избыточного куриный плазменный / тромбина.
4. Крышка чашки Петри, чтобы сохранить высокую влажность, а сборка МЭА / культура сидит в течение приблизительно 1 часа в увлажненной камере внутри инкубаторе при температуре 37 ° С.
5. Осторожно добавьте 10 мкл питательной среды к культуральной камере, крышка чашки Петри и поставить обратно в инкубатор на 30 мин.
6. Поместите каждый узел МЭС / культура стерильными, обрезиненным наконечниками в роликовой трубки, добавить 3 мл питательной среды и плотно закройте крышку. Поместите трубки валика в роликовом барабане, вращающимся со скоростью 1 - 2 мин в инкубаторе в 5% CO _{2 -содержащих атмосфера при 37 ° С.}
7. Изменить половина питательной среды после 7 дней в пробирке (DIV), а затем 1 - 2 раза в неделю.

5. механические повреждения

1. Возьмите узел МЭС / культура стерильными, обрезиненным советы выхода из ролика трубки и места в чашке Петри без питательной среды под стерео микроскоп с тканью в центре внимания. Визуально убедитесь, что два ломтика слиты.
2. Держите MEA / Культура сборка устойчивый путем размещения пинцет с обрезиненным советы по МЭС.
3. Поместите лезвие скальпеля в канавке МЭС близко к срезы тканей. Держите скальпель, а горизонтально.
4. Лифт скальпель обрабатывать до но пусть скальпель лезвия остаться в паз МЭА таким образом, чтобы лезвие "валки" от основания до кончика, и тем самым прорезает ткани, покрывающей паз.
5. Тяжелые остаточные соединения тканей с кончика 25 G иглы, если necessичных. Работайте только в области в паз и не прикасайтесь нежные края.
6. Поставьте MEA / сборку культуры обратно в роликовой трубки. Обеспечение 3 мл свежей питательной среды для культур и поместить их обратно в валец в инкубаторе.

6. Электрофизиологические Записи спонтанной активности

1. Для исследования функционального регенерацию среди двух спинного мозга ломтиками после выбранного количества DIV, установить сборку МЭС / культура в записи камеры на микроскоп и применять около 500 мкл внеклеточной решение (см список материалов).
2. Подождите 10 мин до первой записи, чтобы система стабилизации.
3. Запись основные 2x спонтанной активности около 10 мин с каждой деятельности обнаружения электрода МЭС при комнатной температуре.
4. Для обеспечения стабильных условий внеклеточные, обмен внеклеточной решение после каждого сеанса записи.
5. Для disinhibit сети, применяются внеклеточный сотрудничества решениеntaining стрихнин (1 мкм) и gabazine (10 мкм). Подождите, по крайней мере 2 мин перед началом записи.

Анализ данных 7.

Примечание: Для обнаружения внеклеточно записанных потенциалов действия использовать для каждого электрода детектор на основе стандартных отклонений и последующего дискриминатора. Эта процедура подробно описана в Tscherter соавт. ^3.

1. Отображение обнаруженного нейронную активность каждого электрода в растровом участка соответствии со стандартными процедурами ³ (рис 1F).
2. Определить и показать общую сетевую активность для каждого среза путем суммирования числа событий в соответствии каналов в скользящем окне 10 мсек, сдвинутых на 1 мс (шагами рис 1G и посмотреть Tscherter др. ^3).
3. Обнаружение в каждый ломтик отдельных всплесков (кластеров деятельности, которые появляются на нескольких электродов). Следовательно, Установить минимальный порог пик активности в соответствующем общей сетевой активности и определить каждый взрыв старт и взрыв конец. Например, соответствующий порог 25% средней амплитуды цветовой синхронизации и началом вспышки может быть определена путем быть первым событием во временном окне, по меньшей мере 5 мс, взрыв конечного будучи последнее событие во временном окне в 25 мсек наименее (см Heidemann соавт. ^10).
4. Для количественной оценки функциональной регенерации вычислить процент синхронизированных вспышек между двумя ломтиками. Чтобы сделать это, вычислить задержку между пакетом в одном срезе и следующей пачки в другой секции.
   Примечание: Пара взрыв называется "синхронизирована", когда задержка меньше средней длительности пакета. Особенно в совместных культурах с большим деятельности, существует вероятность, что обе стороны по совпадению инициировать взрыв в выбранной задержки окне. Этот факт должен быть принят во внимание при количественной оценке процента SYnchronized всплески. Для более подробного описания вычислений см Heidemann др. ^10.

8. Фиксация культур и иммуногистохимии

1. Для всех шагов, которые включают мытье или инкубации убедитесь в том, культур на столе наклона, чтобы обеспечить надлежащее распространение решения через ткани.
2. Сразу после сеанса записи закончена взять сборку МЭС / культура из установки, положил его в чашку Петри (35 мм х 10 мм) и добавить около 2 мл внеклеточный раствор.
3. Чтобы отделить ломтики от окружающих слоев клеток, образовавшихся во время в пробирке, принять пипетки 10 мкл в круг и ломтики. Обратите внимание, чтобы не повредить культуры. Можно пропустить этот шаг, но встраивания в дальнейшем легче, когда она выполняется.
4. Используйте тонкий неметаллический иглу шприца (см материалы список) в сочетании с 1 мл шприца, заполненного внеклеточной Solutiна нежно удар культуру от МЭА.
5. Снимите наконечник пипетки Пастера и установите резиновую грушу на slivered конца. Используйте задний конец для передачи культуры в фиксаторе (4% параформальдегида с фосфатным буферным солевым раствором (PBS, 0,1 М)). Не следует использовать стандартный наконечник пипетки Пастера для передачи, так как он слишком мал, и культуры будет сложена и, возможно, повреждены. Исправление для 1 - 2 ч при 4 ° С. Промыть MEA дистиллированной водой и удаления остатков ткани с пальцев, но не царапают ногтем. Храните МЭС в дистиллированной воде при 4 ° С
6. Промыть 3 раза культур в PBS в течение по крайней мере 10 минут каждый. Хранить в PBS при 4 ° С или непосредственно начать с процедурой окрашивания.
7. Инкубируйте культур в течение не менее 90 мин в блокирующем растворе (5% козьей сыворотки, 1% бычий сывороточный альбумин, 0,3% моющего средства в PBS).
8. Добавьте первый антитело, разведенное в блокирующем растворе и инкубируют в течение 3 ночей при 4 ° С.
9. Вымойте 3x в PBS в течение по крайней лвосток 30 мин каждый.
10. Добавьте второй антитело, разведенное в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре.
11. Вымойте 3x в PBS в течение по крайней мере 30 минут каждый.
12. Перенесите ломтики с помощью пипетки Пастера с удаленного наконечником на слайде объекта. Удалите излишки PBS и вставлять с монтажной среды.

Результаты

Чтобы исследовать потенциал для восстановления функций совместного культивировани, полученных из спинного мозга крысиных эмбрионов E14, поражения проводили во временном окне от 8 до 28 DIV. От 2 до 3 недель, спонтанная активность нейронов регистрировали с МПС (Рисунок 1 C & D). В внеклеточно, записанные потенциалы действия были определены форума для каждой отдельной электрода (рис 1E). Из этих данных растровые участки были сгенерированы (рис 1F), затем сетевой активности участков для визуализации общую активность отдельно с каждой стороны (рис 1G). В каждой секции спонтанную активность, как правило, организованы в всплесков. Если кусочки функционально связаны, эти всплески могут распространяться от одного среза на другую. Таким образом, количество синхронизированных вспышек между двумя ломтиками была рассчитана для количественного измерения функциональной регенерации. Для детального описания того, как Int преобразованияО различных участков осуществляется и как была получена формула для расчета процент синхронизированной активности, пожалуйста, см Heidemann др. ^10.

Во всех экспериментах, активность впервые был отмечен в стандартных условиях. На втором этапе, синаптической ингибирование заблокирован добавлением стрихнин (1 мкМ) и gabazine (10 мкМ) в растворе ванны внеклеточной. Это расторможенность обычно приводит к более регулярной деятельности узор с длительными очередями и лопаются интервалами, что облегчает определение очередей и, таким образом, определение синхронизации сигнала между ломтиками.

Культуры повреждениями в молодом возрасте (7 - 9 дел) отображается большое количество синхронизированной активности через 2-3 недели после поражения в то время как культуры поражений на более поздних стадиях (> 19 дел) показали явное снижение способности к регенерации (рисунок 2 А - F). Эти данные показывают, что способность к регенерациифункциональных связей в спинного мозга срезов культур уменьшается от высокого уровня, представляющий состояние эмбриональных в живом организме, на низком уровне, представляющий дальнейшее развитие состояния в живом организме, в течение трех недель в культуре.

Какие соединений на самом деле участвует в пачке импульсов синхронизации между двумя ломтиками? Кроме того, проприоцептивных соединений, волокна могут также возникать из мотонейронов или спинных ганглиев. Было показано, что ранее спинные нейроны ганглиев корень не имеют отношения к функциональной связности между спинной мозг ломтики ^10. Тем не менее, участие мотонейронов остается возможность. Так мотонейроны, как известно, образуют холинергические подключения к нейронов спинного мозга через никотиновые рецепторы ^13, активность спинного мозга сокультурах был записан в 8 DIV, то время, когда культуры обнаруживают сильно синхронизированной активности ^10, и никотиновой антагониста Mecamиламин (MEC, 100 мкМ) добавляли к раствору ванны внеклеточной. Участием мотонейронов в связи между двумя ломтиками приведет к снижению процента синхронизированной активности. Тем не менее, это был не тот случай (MEC: 91,0 ± 4,5%, п = 7; управление: 93,6 ± 4,6%, п = 7, р> 0,05, критерий Вилкоксона соответствует тест пар). Эти результаты показывают, что холинергические синапсы не вносят вклад в функциональной связи между кусочками. Однако, поскольку мотонейроны, также было показано, чтобы освободить глутамат в синапсах в ЦНС ^{11, 15,} эти эксперименты не совсем исключить их участие.

Чтобы определить мотонейронов иммуногистохимических окрашивания против нефосфорилированном нейрофиламентов H с SMI-32 были выполнены. Они показали несколько меченых большие клеточные тела двигательных нейронов, характерные для, распределенных по ломтики (рис 3а). Прерываний SMI-32 антитела, как сообщается, маркировать клеточных тел motoneuroнс ^{12 и} эта находка имеет также верно для используемых культур ^13. Кроме того, окрашивание нейронных клеточных тел в целом, например, против б-III-тубулина или NeuN, а также глиальных клеточных тел., Например, астроциты с GFAP антитела в соответствии с другими отчетами и соответствовать морфологические описания этих типов клеток ( Рисунок 3 В - D). Тем не менее, маркировка аксонов с SMI-32 антитела в отношении (рис 3E). Вопреки ожиданиям, это огромная сеть из волокон появляется при использовании этого антитела и он похож на окрашивание SMI-31, что маркирует фосфорилированную нейрофиламентов H (рис 3F). Одно из толкований этого результата может быть, что регулирование развития нейрофиламентов фосфорилирования / дефосфорилирования не так плотно в используемых культур по сравнению с в естественных условиях ситуации. Смешанный появление фосфорилированных и нефосфорилированный нейрофиламентов в то же аксона может EXPLайн этот вывод. Другая возможность состоит в том, что ГИУ-32 меченых аксонов возникают из проекционных нейронов. Цанг и его коллеги ¹⁶ показали, что, например,, столбцов и столбцов intermediolateral клеток нейроны Кларка окрашивают по SMI-32, кроме моторных нейронов. Произносится аксонов распространение таких нейронов может также объяснить обилие SMI-32 положительных волокон.

Рисунок 1. Отображение и анализ спонтанной активности. (А) Схема с МЭА. Электроды платины покрыты изображены в черных, прозрачных проводов в красный и канавки в середине МЭС желтый. (Б) Крупный план электродной решетки, расположенной в центре МЭС. Диаграммы любезно предоставлены доктором М. Heuschkel. (С) Светлый поля изображения 8 DIV старой КУЛЬТУРАе. Срезы выросли и слиты вместе сторонах, обращенных друг к другу. Желтый бар представляет собой electrode- и изоляции без канавки МЭС. Масштаб бар = 400 мкм (D) Хронология экспериментов. Два спинного мозга ломтики эмбрионов крыс E14 находятся рядом друг с другом на МПС. В течение нескольких дней, ломтики расти и предохранитель по сторонах, обращенных друг к другу. В сроки от 8 - 28 DIV, полные повреждения производится путем слияния сайта. Два-три недели спустя спонтанная активность регистрируется и культуры закреплены за иммуногистохимических окрашивания. (Е) Спонтанные следов активности каждого отдельного электрода 23 DIV старой культуры. Для более четкого визуализации, только каждый второй след показано на рисунке. Оранжевые следы изобразить активность, которая была записана с ломтиком на правой стороне, синие следы от левой стороны. Большинство вспышек синхронизированы между ними. Стрелка указывает на взрыв, происходящие в левом срезе, что только рartially распространяются на правой секции. Деятельность в правильном копии, однако не достигли выбранного порога, по крайней мере 25% от усредненной максимальной пиковой активности по стороне, и поэтому не обнаруживается в порыве. Увеличения на право изображать последней синхронизации разрыва пары. (F), растровый сюжет активности, показанной в (Е). (G), Сетевая активность участок, определяемые всплесков (баров ниже базового уровня) в активности, показанной в (Е). Взято из Heidemann др. ^10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Синхронное против не синхронизированной активности. (А, Б) Растровые участки культур lesioneд в молодом возрасте (в 7 - 9 дел), показывая синхронизированной активности в стандартных условиях (А) и при расторможенность (B). (С, D) Растровые участки культур повреждениями в старости (при> 19 дел), показывая не синхронизированной активности в стандартных условиях (C) и под расторможенность (D). (E, F) Средний процент синхронизированной активности построены для каждого отдельного дня поражения записанного в стандартных условиях (Е) и под расторможенность (F). Записи были сделаны 2 - 3 недели после дня поражения. Взято из Heidemann др. ^10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3. Иммуногистохимический характеристика. (А) Окрашивание мотонейронов клеточных тел с SMI-32. (Б) β-тубулина III маркировки зрелых нейрональных клеток органов и их процессов. (С) Идентификация астроцитов GFAP с. (D), маркировка зрелого нейронов клетки тела с NeuN. (Е) SMI-32 окрашивание нефосфорилированный нейрофиламентов H. (F) Фосфорилированный нейрофиламентов H определены SMI-31. Взято из Heidemann др. ^10. Следует отметить, что с обоими, SMI-31 и SMI-32, большая сеть волокон видна в культурах. Бары AD = 20 мкм, H & F = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Некоторые элементы в представленном порядке являются основополагающими для выполнения точных и воспроизводимых экспериментов. Все шаги во время подготовки МПС, решения и производства срез культуры осуществляется в стерильных условиях в ламинарном боксе. Антибиотики не применяются к питательной среде, потому что они могут влиять на спонтанную активность ^14. Во время MEA покрытия, наиболее важной частью является, чтобы убедиться, что решение внеклеточный матрикс геля остается холодной на все времена. Оттепели в холодильник и держать его на льду в течение всей процедуры, чтобы обеспечить максимальную температуру, близкую к 0 ° С. В ходе подготовки ломтиков быстрого выделения и срезов, а также обращая внимания на низкой температуре с помощью льда холодные буферы рассечение увеличивает процент здоровых культур. Кроме того, плазма / тромбина коагуляции является одним из наиболее важных шагов. Во-первых, убедитесь, что плазма правильно михеd с тромбина. Во-вторых, обратить особое внимание на удаление столько остатка, как это возможно, чтобы обеспечить надлежащее крепление ломтиками в МПС. Этот шаг является чрезвычайно чувствительным ко времени; Если временной интервал слишком короток, слишком много плазмы / тромбина смеси удаляется. Если сроки слишком долго, коагуляция уже произошло, увеличивая риск удаления ломтики вместе с остаточной плазмы / тромбина.

Если механические повреждения планируется, важно использовать МПС с точной конструкции. Область, где поражение предназначен должен быть свободным от электродов, проволоки и изоляции. В противном случае, электрика МЭС будут повреждены, и поэтому ни одной записи не может быть выполнена больше.

Еще один важный шаг касается размера поражения. Было показано, что ранее повторном двух молодых ломтики после поражения занимает около двух дней ^10. Для всех экспериментов, эмпирическое правило, что используют в космической betweан срезов после поражения не должны быть больше, чем ширина паза МЭС (300 мкм). Больший размер повреждения может привести к более длительный срок для повторного подключения или, если повреждение не является слишком большой, не переподключение вообще. Для аннотирования, бывшие эксперименты показали, что начальная установка из двух ломтиков дальше, чем 1 мм в результаты очень низкой скорости соединения.

Перед началом записей, временем регулировки, по меньшей мере 10 мин до комнатной температуры, вместо 37 ° C инкубатора и с внеклеточным раствором, вместо питательной среде рекомендуется. Тщательное наблюдение картины деятельности в течение этих начальных минут гарантирует, что измеренные данные представляют разрывной образец культуры надлежащим после записи был начат.

Для обнаружения активности, сбора данных и дальнейшей обработки, домашнее метизы (запись камеры, подключение к усилителям и усилителей), программы в ЛабораторииВЗГЛЯД, С ^{++ и} IgorPro используются. Коммерческие MEA настройки и другие программные пакеты подходят также для этих операций. Здесь, сигналы видно электродами, усиливаются 1001 раз, а затем оцифрованы со скоростью 6 кГц.

Представленная модель может быть полезным инструментом для изучения проприоцептивных соединения, так как в естественных условиях, они трудны для изучения без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Совместное культивирование двух спинного мозга ломтиками может элегантно обойти этот вопрос. Культуры обеспечить микросреду, которые могут быть жестко контролируемой и легко манипулировать. С другой стороны, надостный и сенсорный вход, конечно, отсутствует. Кроме того, процесс подготовки культура представляет ситуацию поражения ЦНС. Глиальные клетки, такие как астроциты и микроглии, как известно, отвечают на поражений с повышенной пролиферацией и, следовательно, ткань в определенной степени реорганизованной. Относительно представленного режимел образование глиальных шрам после выполнения механические повреждения не наблюдалось. Одним из объяснений может быть, что адаптивные механизмы астроцитов уже срабатывает в процессе подготовки и поражений культур не приведет к дальнейшему ответ. Кроме того, нет никаких доказательств причастности миелиновых ингибиторов, связанных, например,., Nogo-A, в низкой регенеративного потенциала культур повреждениями в старости. Тем не менее, было показано, что лечение с фосфодиэстеразы 4 ингибитора Ролипрам, начиная непосредственно после выполнения поражений на 23 DIV увеличивает функциональную регенерации между кусочками ^10. Эти результаты показывают, что функциональное восстановление может быть увеличена в старых культур. Заметно, при подсчете количества аксонов, пересекающих поражения сайт, не было обнаружено никакой разницы между культурами повреждениями в молодом возрасте и культур повреждениями в старости. Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие регенерации аксонов не главная причина еили потеря восстановления после поражений в конце культуры и, следовательно, подчеркнуть необходимость для модели, что позволяет функциональный анализ регенерации. Формирование синапсов и синаптической пластичности могли бы играть важную роль в процессе восстановления ^10. Эти механизмы получили много внимания в последние годы, и это в настоящее время широко признается, что они имеют большое влияние на исход после повреждения спинного мозга. Таким образом, модель, которая обеспечивает стабильные условия для расследования этих процессов в изоляции и в мельчайших подробностях, безусловно, может помочь получить представление о функциональной регенерации спинного мозга.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Планарная многоэлектродная матрица	Qwane Biosciences		изготовлена по индивидуальному заказу в соответствии с конструкцией нашей лаборатории
Питательная среда			Для 100 мл
Dulbeccos модифицированная Eagle's среда	Gibco	31966-021	80 мл
Лошадиная сыворотка	Gibco	26050-070	10 мл
дистиллированная, стерильная вода			10 мл
Фактор роста нервов-7S [5 нг/мл]	Sigma-Aldrich	N0513	200 &микро; l
восстановлено в растворе для промывки с 1%
раствором
Гель для внеклеточного матрикса	BD Biosciences	356230	Должен постоянно оставаться холодным; разбавить 1:50 средой, оптимизированной для пренатальных и эмбриональных нейронов
средой, оптимизированной для пренатальных и эмбриональных нейронов	Gibco	21103-049
Раствор для промывки			[мг/л]
MgCl2-6H2O			100
MgSO4-7H2O			100
KCl			400
KH2PO4			60
NaCl			8,000
Na2HPO4 безводный			48
D-глюкоза (декстроза)			1,000
Согласно протоколу на
http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html Внеклеточный раствор (pH 7.4)			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
Na-пируват			2
Глюкоза			5
Блокирующий раствор
Моющее средство: Triton X-100			0,3%, вреден при проглатывании
бычьего сывороточного альбумина	Sigma-Aldrich	A9418	1%
Козья сыворотка	Gibco	16210-064	5%
Куриная плазма	Sigma-Aldrich	P2366	Лиофилизированный, восстанавливается с раствором для промывки
Gabazine	Sigma-Aldrich	SR-95531
Мекамиламин гидрохлорид	Tocris	2843	Токсичен при проглатывании
Микропипетка	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
Параформальдегид			вредный, 4%
SMI-31	Covance	SMI-31P
SMI-32	Covance	SMI-32R-500
стрихнин	Sigma-Aldrich	S0532	токсичный
тромбин	Merck Millipore	1123740001	раздражающим, сенсибилизирующим, восстанавливаемым с раствором
для промывкиПлоская трубка для культуры тканей 10 (= роликовая трубка)	Techno Plastic Products AG	91243

покрытия BSA