Митохондрии играют центральную роль в регуляции метаболизма и гомеостазе. Тонкие изменения в митохондриальном метаболизме, которые влияют на физиологию организма, может быть трудно обнаружить в исследованиях метаболомики всего организма. В этой статье мы опишем метод выделения, который улучшает обнаружение тонких метаболических сдвигов у Drosophila melanogaster.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поскольку митохондрии играют роль в метаболизме аминокислот, углеводном обмене и окислении жирных кислот, дефекты в функции митохондрий часто ставят под угрозу жизнь тех, кто страдает от этих сложных заболеваний. Обнаружение митохондриальных метаболических изменений жизненно важно для понимания митохондриальных нарушений и митохондриальных реакций на фармакологические агенты. Несмотря на то, что митохондриальный метаболизм лежит в основе метаболической регуляции, обнаружение тонких изменений в митохондриальном метаболизме может быть затруднено из-за чрезмерной представленности других цитозольных метаболитов, полученных с помощью экстракции всего организма или целой ткани.
Здесь мы описываем метод выделения, который обнаружил выраженные митохондриальные метаболические изменения у дрозофил, которые отличались от цельных мух и митохондриальных обогащенных препаратов. Чтобы проиллюстрировать чувствительность этого метода, мы использовали группу дрозофил, несущих генетически разнообразные митохондриальные ДНК (мтДНК), и подвергли их воздействию препарата рапамицин. Используя этот метод, мы показали, что рапамицин модифицирует митохондриальный метаболизм в зависимости от митохондриального генотипа. Тем не менее, эти изменения гораздо более заметны в метаболомических исследованиях, когда метаболиты были извлечены из фракций, обогащенных митохондриями. Напротив, экстракты цельных тканей обнаруживали только метаболические изменения, опосредованные препаратом рапамицином, независимо от мтДНК.
Введение
Цель этой процедуры заключается в разработке обогащенных фракций митохондрий, которые дают достаточно митохондриальных метаболитов для метаболомики исследований с использованием дрозофилы. По нашему опыту, метаболомика анализа, используя весь методы извлечения сотовой неспособны обнаружить тонкие изменения митохондрий метаболитов в дрозофилы. Тем не менее, митохондриальная дробление до анализа Метаболомика повышает чувствительность для выявления митохондриальных метаболитов сдвиги.
Митохондрии клеточные органеллы, ответственные за обеспечение 90% энергии, что клетки необходимо для нормальной функции 1. В после....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Реагенты и растворы
- Подготовка летучей пищи и СМИ
- Тепловые мух ингредиенты 11% сахара, 2% автолизированных дрожжи, 5,2% кукурузной муки, агар 0,79% вес / об в воде в плите, установленной при 90 ° С. Движение регулярно, пока не будет получена однородная смесь слегка плотным. Подготовьте конечный объем 550 мл летучей пищи в общей сложности 100 флаконов по 5 мл летать еду в каждом.
- Удалить из источника тепла, помешивать, пока продукты не остынет до 80 ° С и добавляют 0,2% tegosept-метил-4-гидроксибензоата, растворенный в 95% этанола.
- Сплит пищу в двух равных объемах. Добавить 1.1 мл 50 мМ рапамицин растворяют в этаноле к одному....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Использование протокола объяснено выше, мы провели анализ на метаболомики митохондриальных обогащенных фракций и целых экстрактов животных, чтобы проверить действие препарата рапамицина на расходящихся мтДНК 7. Мы поставили 200 мкм рапамицина путем растворения препарата в летучей пищи. Мухи подвергались рапамицина в течение 10 дней. Метаболиты из целых мух экстрактов и экстрактов из митохондрий, получены при использовании масс-спектрометрии газовой хроматографии (ГХ / МС).......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важные шаги в этом протоколе, являются: 1) воспитание достаточно мух в изобилии пространства. Это очень важно, чтобы не перенаселять демография клетки с более чем 150 мух каждый; 2) изменение пищу клеток часто, чтобы избежать пищевой конкуренции и питания стресс; и 3) поддержание всех образцов при 4 ° С, чтобы обеспечить целостность в процессе выделения митохондриальной фракции. Рекомендуется также, чтобы охладить буфер изоляции, промывочный буфер, и стекло-тефлоновый гомогенизатор Даунса перед использованием. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом на развитие факультета Университета Адельфи и грантом R15GM113156 от NIGMS, присужденным EVC, грантом R01GM067862 от NIGMS и грантом R01AG027849 от NIA, присужденным DMR.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2% тегосепт-метил4-гидроксибензоат | VWR | AAA14289 | |
| этанол | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Сахароза | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) пропансульфоновая кислота (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 подушечки для обезболивания мух | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 л клетка | Интернет-магазин | 999RD32 | |
| л клетка крышка | Веб-магазин | 999LRD | |
| стекло-тефлоновый гомогенизатор | NC9661231 | Fisher | |
| Гидроксид натрия | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| рапамицин | ЛК Лаборатории | R-5000 | |
| анти-порин | MitoSciences | MSA03 | |
| анти-альфа тубулин | Исследования развития Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Термо Научный | 23225 | |
| CO2 прокладка | Tritech Research, Inc | Фильтрующая | |
| резиновая пробка | enasco | S08512M | |
Ссылки
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
