Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53149

⸱

30 сентября 2015 г.

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

В этой статье

Краткое содержание

Митохондрии играют центральную роль в регуляции метаболизма и гомеостазе. Тонкие изменения в митохондриальном метаболизме, которые влияют на физиологию организма, может быть трудно обнаружить в исследованиях метаболомики всего организма. В этой статье мы опишем метод выделения, который улучшает обнаружение тонких метаболических сдвигов у Drosophila melanogaster.

Аннотация

Поскольку митохондрии играют роль в метаболизме аминокислот, углеводном обмене и окислении жирных кислот, дефекты в функции митохондрий часто ставят под угрозу жизнь тех, кто страдает от этих сложных заболеваний. Обнаружение митохондриальных метаболических изменений жизненно важно для понимания митохондриальных нарушений и митохондриальных реакций на фармакологические агенты. Несмотря на то, что митохондриальный метаболизм лежит в основе метаболической регуляции, обнаружение тонких изменений в митохондриальном метаболизме может быть затруднено из-за чрезмерной представленности других цитозольных метаболитов, полученных с помощью экстракции всего организма или целой ткани.

Здесь мы описываем метод выделения, который обнаружил выраженные митохондриальные метаболические изменения у дрозофил, которые отличались от цельных мух и митохондриальных обогащенных препаратов. Чтобы проиллюстрировать чувствительность этого метода, мы использовали группу дрозофил, несущих генетически разнообразные митохондриальные ДНК (мтДНК), и подвергли их воздействию препарата рапамицин. Используя этот метод, мы показали, что рапамицин модифицирует митохондриальный метаболизм в зависимости от митохондриального генотипа. Тем не менее, эти изменения гораздо более заметны в метаболомических исследованиях, когда метаболиты были извлечены из фракций, обогащенных митохондриями. Напротив, экстракты цельных тканей обнаруживали только метаболические изменения, опосредованные препаратом рапамицином, независимо от мтДНК.

Введение

Цель этой процедуры заключается в разработке обогащенных фракций митохондрий, которые дают достаточно митохондриальных метаболитов для метаболомики исследований с использованием дрозофилы. По нашему опыту, метаболомика анализа, используя весь методы извлечения сотовой неспособны обнаружить тонкие изменения митохондрий метаболитов в дрозофилы. Тем не менее, митохондриальная дробление до анализа Метаболомика повышает чувствительность для выявления митохондриальных метаболитов сдвиги.

Митохондрии клеточные органеллы, ответственные за обеспечение 90% энергии, что клетки необходимо для нормальной функции 1. В последние годы было признано, что митохондрии играют гораздо более активную роль в клеточном и организменном функции, чем просто производство аденозинтрифосфата (АТФ), и в настоящее время признается в качестве центров для регуляции метаболического гомеостаза 2,3. Митохондрии являются результатом процесса, в котором эндосимбиотических DISдалась отчетливая микробные клоны объединены ~ 1,5 млрд лет назад 4. Как митохондрии превратилась в истинных органелл, гены от эндосимбионта были включены в формирующемся ядерного генома. У животных сегодня, примерно в 1500 митохондриальные белки кодируются ядерным, а 37 генов остаются в мтДНК, 13 из которых кодирует митохондриальные белки, которые субъединицы ферментных комплексов окислительного фосфорилирования 5. Координация между митохондриями и ядерных отсеков необходим для поддержания надлежащего функции митохондрий.

Используя методы, описанные здесь, мы были в состоянии обнаружить митохондриальных метаболические изменения в дрозофилы, которые являются результатом манипуляции координации между митохондриальных геномов и ядерных. Мы использовали штамм дрозофилы, в котором мтДНК от своих побратимов видов Д. simulans был сделан на одном D. MELANOGASTER ядерной фон 6. Это "нарушается" mitonuclearгенотип по сравнению с "родной", или совместно эволюционировали mitonuclear генотипа D. MELANOGASTER неся же ядерный геном с его родной D. MELANOGASTER мтДНК. Д. MELANOGASTER и D. simulans мтДНК отличается от ~ 100 аминокислоты и> 500 синонимичные замены, которые влияют mitonuclear 7,8 связи. Мы создали целые лету экстракты и митохондриальных обогащенных экстрактов для изучения метаболитов сдвиги в ответ на фармакологическое стресса. Здесь мы показываем, что при использовании обогащенного митохондриальные фракции мы обнаруживаем выраженные сдвиги в митохондриальных метаболитов между родной, со развивались генотипа несущей D. MELANOGASTER мтДНК и разрушенные генотип, несущие D. simulans мтДНК. В противоположность этому, изменения метаболитов между этими двумя генотипами являются тонкими, используя обычные методы, которые используют весь экстракт лету. Таким образом, этот метод обеспечил путь понять, как мтДНК посредником митохондриальные измененияОтвет на разных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Реагенты и растворы

  1. Подготовка летучей пищи и СМИ
    1. Тепловые мух ингредиенты 11% сахара, 2% автолизированных дрожжи, 5,2% кукурузной муки, агар 0,79% вес / об в воде в плите, установленной при 90 ° С. Движение регулярно, пока не будет получена однородная смесь слегка плотным. Подготовьте конечный объем 550 мл летучей пищи в общей сложности 100 флаконов по 5 мл летать еду в каждом.
    2. Удалить из источника тепла, помешивать, пока продукты не остынет до 80 ° С и добавляют 0,2% tegosept-метил-4-гидроксибензоата, растворенный в 95% этанола.
    3. Сплит пищу в двух равных объемах. Добавить 1.1 мл 50 мМ рапамицин растворяют в этаноле к одному объему и 1,1 мл этанола, с другой объем. Движение рапамицина и этанола решения в пищу. Будьте уверены, что температура снижается до 50 ° C перед добавлением лекарства.
  2. Выделение буфера
    1. Подготовьте 500 мл буфера изоляции [225 мм маннита, 75 мМ сахарозы, 10 мМ 3- (N </ EM> -morpholino) пропансульфоновой кислоты (МОПС) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 2,5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)] в воде.
    2. Доводят рН до 7,2 с помощью гидроксида натрия. Начальный рН будет кислой.
    3. Использование стерильные флаконы для хранения фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации раствора и хранить его при температуре 4 ° С.
  3. Промывочный буфер
    1. Подготовьте 500 мл промывочного буфера [225 мм маннита, 75 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl и 5 мм KH 2 PO 4] в воде.
    2. Доводят рН до 7,2 с помощью гидроксида натрия. Начальный рН будет кислой.
    3. Использование стерильные флаконы для хранения фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации раствора и хранить его при температуре 4 ° С.

2. Разведение дрозофилы штаммов

  1. Для управления личиночной плотности в процессе разработки, разместить 25 пар родителей к бутылке культуры и позволить им, чтобы отложить яйца в течение 48 часов.
  2. Удалить родителей после 48 часов, чтобы регулировать плотность яиц.
  3. Повторите шаги 2.1 и 2.2, используя складывающуюся потомство F1, так что два поколения этого контроля плотности достигается.
  4. Для сбора взрослых, обезболить мух, используя углекислый газ (CO 2) и отдельный от пола.
    1. Использование единого регулятора стадии к поставленной чистого СО 2 с высокой оказывают давление на резервуар непрерывного потока 5 фунтов на квадратный дюйм. Чтобы избежать статического электричества, использовать пластиковые трубы, чтобы катализировать CO 2 в 500 мл колбу фильтрации водой.
    2. Использование резиновой пробкой с одним отверстием для герметизации колбы. Использование пластиковых труб для подключения боковое отверстие колбы с СО 2 подушки.
    3. Поместите мух в площадку не более чем на 10-15 мин. Разрешить, чтобы оправиться от наркоза в течение 24 часов, прежде чем поместить их в экспериментальных условиях.
  5. Для создания достаточно метаболитов митохондриальных обогащенных фракций, используйте 300 мух в образце. Вот, используйте самок, но gendeR может отличаться в других экспериментах. Перевести 150 мух самодельной 1 л демографии клетке. Разрешение доступа к 5 мл летучей пищи во флаконе.
  6. Перенесите оставшиеся 150 мушек в другую 1 л клетке. Не перенаселять клетки с более чем 150 мух.
  7. Используйте шесть одинаковых образцов за экспериментальных условиях. Так целые экстракты животного принесет больше метаболитов, чтобы произвести 1 образец целого животного изолирует, трансфер 50 женщина летит в одной клетке. Что касается митохондриальных изолятов, использовать шесть одинаковых образцов за экспериментальных условиях.
  8. Место клеток при 25 ° С с циклом 12 ч света и 12 ч темноты.
  9. Обеспечить свежие продукты каждые 2 или 3 дня в пробирке 5 мл пищи для поддержания качества продуктов питания.
  10. Поддерживать мух на еде в течение 10 дней. Этот шаг необходим для лечения рапамицина 7. Другие методы лечения или условия будут отличаться.

3. Выделение митохондриальных фракций

  1. Самосвал летит из одной клетки (150) мух встекло-тефлоновый гомогенизатор Даунса заполнены 1 мл охлажденного буфера изоляции.
  2. Перемешать, перемещая пестик вверх и вниз в течение 15 ударов. Держите раствор на льду, чтобы сохранить нетронутыми митохондрии.
  3. Передача гомогената в 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  4. Возьмем супернатант и центрифуги при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для обогащения митохондрий.
  5. Как супернатант содержит цитозольную фракцию, отбросить супернатант или использовать его для альтернативных экспериментов. Ресуспендируют осадок в 300 мкл промывочного буфера.
  6. Повторите шаги 3.1 - 3.5 для второй клетке. Объедините ресуспендировали гранул обоих клетках в криогенной трубки микроцентрифужных.
  7. Центрифуга при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  8. Жидкость над осадком сливают и флэш-заморозить гранул в жидком азоте.
  9. Хранить митохондриальных обогащенных фракций при -80 ° С или более низкой температуре.
    1. Кроме того, для всей животной предварительноторных, поместите взрослых в криогенной трубки микроцентрифужных. Вспышка заморозить флакон в жидком азоте и хранить взрослых при -80 ° С или более низкой температуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование протокола объяснено выше, мы провели анализ на метаболомики митохондриальных обогащенных фракций и целых экстрактов животных, чтобы проверить действие препарата рапамицина на расходящихся мтДНК 7. Мы поставили 200 мкм рапамицина путем растворения препарата в летучей пищи. Мухи подвергались рапамицина в течение 10 дней. Метаболиты из целых мух экстрактов и экстрактов из митохондрий, получены при использовании масс-спектрометрии газовой хроматографии (ГХ / МС)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важные шаги в этом протоколе, являются: 1) воспитание достаточно мух в изобилии пространства. Это очень важно, чтобы не перенаселять демография клетки с более чем 150 мух каждый; 2) изменение пищу клеток часто, чтобы избежать пищевой конкуренции и питания стресс; и 3) поддержание всех образцов при 4 ° С, чтобы обеспечить целостность в процессе выделения митохондриальной фракции. Рекомендуется также, чтобы охладить буфер изоляции, промывочный буфер, и стекло-тефлоновый гомогенизатор Даунса перед использованием. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом на развитие факультета Университета Адельфи и грантом R15GM113156 от NIGMS, присужденным EVC, грантом R01GM067862 от NIGMS и грантом R01AG027849 от NIA, присужденным DMR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2% тегосепт-метил4-гидроксибензоатVWRAAA14289
этанолSigma-Aldrich792799
MannitolSigma-AldrichM4125
СахарозаSigma-AldrichS9378
3-(N-morpholino) пропансульфоновая кислота (MOPS)Sigma-AldrichM1254 
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-Aldrich38057 
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-Aldrich5470
KClSigma-AldrichP9333
Tris HClSigma-AldrichRES3098T-B7
KH2PO4Sigma-Aldrich1551139
CO2 подушечки для обезболивания мухTritech ResearchMINJ-DROS-FP
1 л клеткаИнтернет-магазин999RD32
л клетка крышкаВеб-магазин999LRD
стекло-тефлоновый гомогенизатор NC9661231Fisher
Гидроксид натрияSigma-AldrichS8045
рапамицин ЛК Лаборатории R-5000
анти-поринMitoSciencesMSA03
анти-альфа тубулинИсследования развития Hybridoma Bank12G10
Pierce BCA Protein Assay Kit Термо Научный 23225
CO2 прокладкаTritech Research, IncФильтрующая
резиновая пробкаenascoS08512M
1 Научный колба enasco SB08184M

Ссылки

  1. Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Drosophila
Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.