Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга

Summary

Фосфорилирование белков является центральной особенностью того, как клетки интерпретируют и реагируют на информацию в своей внеклеточной среде. В данной работе мы представляем протокол скрининга с высокой пропускной способностью с использованием киназ, выделенных из клеток млекопитающих, для быстрой идентификации киназ, фосфорилирующих представляющий интерес субстрат.

Abstract

Мы разработали платформу скрининга для выявления специальные протеинкиназы человека для фосфорилированных субстратов, которые могут быть использованы для выяснения новых путей передачи сигнала. Наш подход имеет применение библиотеки очищенных GST-меченый человека протеинкиназ и рекомбинантного белкового субстрата, представляющего интерес. Мы использовали эту технологию, чтобы идентифицировать MAP / микротрубочек сродства регулирования киназы 2 (Mark2), как киназы для глюкозы регулируется сайта на CREB-застройку транскрипционных коактиватора 2 (crtc2), белок, необходимый для пролиферации бета-клеток, а также Эксл семейство тирозинкиназ в качестве регуляторов клеточного метастазов по фосфорилирования белка адаптера ELMO. Мы описываем эту технологию и обсудить, как он может помочь создать комплексную карту, как клетки реагируют на стимулы окружающей среды.

Introduction

Белковые посттрансляционных модификаций (PTMs) имеют важное значение для внутриклеточного связи. Возможно, лучше всего изучен всего PTMs является фосфорилирование, катализируемое протеинкиназ, которые регулируют множество белковых функций, в том числе их биохимической активности, субклеточном локализации, конформации и стабильности. Идентификация сайтов фосфорилирования на целевых белков может быть достигнуто путем трипсином отображения фосфопептидного либо теперь стандартными методами с использованием протеомическим образцы обогащенные для фосфорилированных пептидов ^1,2. В то время как три четверти выраженной протеома, как ожидается, будет фосфорилируется ^{3 и} определены сайты фосфорилирования 200000 ^5, с оценками до 1 млн ^6, многие из них не имеют назначенного биологию, путь, или протеинкиназы сигнализации.

В то время как идентификация фосфорилированными сайтов является относительно простым, сравнительно больше, задача состоит вопределить родственный киназы (ы), что цели эти сайты, процесс мы называем отображения киназы: пар подложки. Существует несколько подходов для определения киназы: пары подложек были описаны, либо начиная с киназы интереса и ищет ее субстратами или начиная с подложкой интереса и пытается найти модифицирующий киназу экспериментально ^7-11 или вычислительно ^12. Чтобы определить киназы для известного фосфорилированного субстрата, биоинформатики могут быть использованы для идентификации белков, которые содержат короткий консервативную последовательность аминокислот, фланкирующих фосфорилированный остаток (консенсус-сайта), а также определение киназы, которые образуют осаждаемой комплекс с подложкой. Тем не менее, эти подходы требуют много времени и часто не увенчались успехом.

Мы разработали системный функциональный подход быстро определить киназы, которые могут фосфорилировать данную ^{подложку} 13. Экран анализа производит отличную специфику, с очень ясным отбора потенциальных родственных киназ ность. Учитывая центральное фосфорилирования биологического сигнализации, экран полезен для открытия практически во всех клеточных сигнальных путей ^14-16. Экран включает в себя проведение крупномасштабной киназы с библиотекой протеинкиназ человека. Киназы были помечены бактериальной глутатион S-трансферазы (GST) белка и очищают от млекопитающих клеточных экстрактов, что означает, что рекомбинантные ферменты - в отличие от тех, полученного из бактерий - генерируются в присутствии вверх по течению протеинкиназ часто требуемых для рекомбинантных ферментов обладают активностью в пробирке. Действительно, в то время как серин, треонин и тирозин киназы для активации нижнего киназы присутствуют в дрожжах ^10, геном дрожжей кодирует 122 протеинкиназы, указывая, что kinome млекопитающих, более 500 генов ^17, стало значительно сложнее, чтобы Регулат.е процессы, уникальные для более высокого порядка организмов. Кроме того, влияние различных стимулов, имеющих отношение к клеточной биологии и болезни человека (например, небольших молекул, факторов роста, гормонов и т.д.) могут быть использованы для модулирования ^14,15 киназной активности в соответствующем контексте.

Protocol

1. Подготовка реактивов, тарелки, и клеток

1. Сделать 500 мл буфера для лизиса: 25 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,5% Тритон Х-100, 5 мМ бета-глицерофосфат, 5% глицерина. Хранить при 4 ° С. Непосредственно перед применением, добавьте 1 мМ дитиотреитола (DTT), 1 мМ фенилметил сульфонильную (ФМСФ), и 1 мМ ванадата натрия. После этого шага, ФМСФ не требуется в любом полоскания буфера.
2. Сделать 20 мл 10х киназного буфера: 200 мМ Трис рН 7,5, 50 мМ бета-глицерофосфат (FW 216), 2 мМ ванадата натрия. Аликвоты по 1 мл пробирок и хранят при -20 ° С. Непосредственно перед использованием добавляют 5 мМ DTT.
3. Сделать 20 мл 10х буфера М-АТФ: 300 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ), 66 мМ MgCl _2, 33 мМ MnCl _2. Аликвоты в 1 мл пробирки и хранят при -20 ° С.
4. Сделать 100 мл 2x додецилсульфата натрия (SDS) буфера для лизиса: 1,5 г Трис база, 20 мл глицерина, 30 мл _Н 2 О. Растворить и довести рН до 6,8 с помощью HCl. Добавить 40мл 10% SDS, регулировки громкости до 100 мл. Добавить 25 мг бромфенолового синий.
5. Пятно 4 мкл 25 нг / мкл плазмиды млекопитающих, кодирующие экспрессии в GST-киназы ¹⁴ на лунку в наборы 96-луночных планшетах и планшетах этикеток соответственно. Печать и замораживание пластины при температуре -20 ° С до использования.
6. 1-2 дней до трансфекции культуры клетки HEK293T в модификации Дульбекко среде Игла полном (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики в 37 ° C инкубаторе с добавлением _CO 2 (конечная 5%). Прохождение трипсином и не позволяют фондовый стать> 80% сливающиеся в процессе расширения. Минимум 6 х 10 ⁷ клеток необходимы для экрана (примерно 3 х 15 см блюда HEK293T клеток в 80% слияния).

2. Трансфекция

Примечание: На рисунке 1 блок-схемы всего протокола.

1. Если пластины, содержащие плазмиды киназы были заморожены, оттепель при комнатной температурей центрифуге при 1900 мкг в течение 3 мин, чтобы собрать любую влагу на дне лунки.
2. Смешайте 8,6 мл среды сывороточного пониженном (например, OPTI-MEM) с 312,7 мкл липидного основе реагента для трансфекции. Пусть сидят в течение 5 мин.
3. Добавьте 10 мкл восстановленного среде сыворотки в каждую лунку с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты.
4. Добавьте 10 мкл на лунку восстановленного сыворотки среды / трансфекции смеси реагентов со стадии 2.2 с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты. Дайте настояться в течение 20 до 45 мин.
5. Ресуспендируют клетки 293Т 7,5 х 10 ⁵ клеток / мл в 80 мл полной среды DMEM. Добавить 100 мкл клеточной суспензии (т.е. 7,5 х 10 ⁴ клеток на лунку) с использованием автоматизированной дозатора жидкости, снабженного стандартной громкости кассеты.
6. Проверка под микроскопом скважин для равномерного распределения клеток и вернуться к инкубаторе в течение 24 часов.

3. GST-киназы Понижения

1. Сделайте преш: 4 мм pervanadate решение путем смешивания 60 мкл 0,2 М ванадатом натрия с 540 мкл _H 2 O. Во втором смеси трубки 2,7 мкл 30% перекиси и 1,4 мл PBS. Добавить два решения вместе, и пусть сидят в течение 15 мин перед использованием.
2. Использование многоканальной пипетки (не использовать автоматизированную дозатора жидкости, так как создает слишком много турбулентности в скважине) обойтись 2 мкл 0,25 М CaCl _{2 в} каждую лунку, после чего 2,5 мкл pervanadate, полученного на стадии 3.1. Инкубируют каждый планшет при 37 ° С в течение 10 мин, а затем поместить на льду.
3. Подготовьте 35 мл буфера для лизиса, добавив DTT, ФМСФ и ванадат натрия, как указано в разделе 1 (Приготовление реагентов).
4. Поддержание пластины на льду, удалить носитель из каждой лунки с помощью вакуумного аспиратора. Сразу добавить 50 мкл / лунку ледяной буфер лизиса с использованием автоматизированной дозатора жидкости, снабженного стандартной кассете. Пусть сидят 30 мин на льду лизировать (опционально: может останавливаться, если необходимо, уплотнения Platэлектронной и хранения при -80 ° С. Чтобы продолжить, оттепель пластины на льду).
5. Побочные пластины в 1900 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
6. Очистите клетки из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и передать все содержание надлежащим образом помечены пластины V-дно 96 также. Спин пластины при 1900 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
7. Во время спина, заполните глутатиона покрытием пластин (по одному для каждого 96-луночного планшета) с 100 мкл / лунку ледяной буфера для лизиса (без PMSF) в качестве полоскания. Хранить пластины на льду.
8. Удалить пластины V-дно из центрифуги. По одному, инвертировать глутатиона пластины над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер лизиса и пятном на бумажное полотенце. Передача буфера для лизиса с пластин V-нижней части, чтобы глутатион пластин, наклоняя пластину и с помощью многоканальной пипетки, следя, чтобы не мешать осадок на дне. Торцевые пластины и оставить на льду в течение 2 ч минимального связывать.
9. Ближе к концу стадии связывания 2 ч, подготовить станцию ​​радиоактивности, обеспечивая тон необходимые меры безопасности на месте для радиоактивных работы. Установите гибридизации духовку до 30 ° C.
10. Подготовьте 200 мл буфера для лизиса, добавив DTT и натрия ванадатом, как указано в разделе 1. PMSF не требуется на данном этапе.
11. Обратить глутатиона пластины над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер лизиса и промокните на бумажном полотенце. Промыть лунки 3 раза с 100 мкл буфера для лизиса (без PMSF). Не позволяйте скважин сидеть сухой - не держать их в полоскании до готовности, чтобы продолжить.
12. Подготовка 55 мл 1x киназного буфера (KB) путем разбавления 10x запас и добавление ДТТ, как указано в разделе 1. Промыть пластины один раз с помощью 50 мкл 1х КБ с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного стандартной объемной кассеты. Оставить 1x КБ в скважинах до раствор А не готова:
    1. Приготовьте раствор А, добавив 500 до 530 мкг субстрата интерес, 500 мкг основного белка миелина (ОБМ), 2,65 мл 10х KB, 13,25 мкл 1 М DTT, и _H 2 O до 15,9 мл.
13. По одному, инвертировать пластин над раковиной, чтобы удалить 1x KB полоскание, пятно на бумажное полотенце и сразу же добавить 30 мкл раствора А с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты. Хранить пластины на льду.
14. Приготовьте раствор B в области радиоактивности работы, добавляя 2,5 мл 10x M-АТФ, 500 мкКи гамма ³² P АТФ, и _H 2 O в 10 мл.
    1. Добавьте 20 мкл раствора В в каждую лунку с помощью пипетки ретранслятора, который помогает в смешивании из-за выброса силы. Накройте и инкубируйте в 30 ° C гибридизации печи в течение 30 мин.
15. Через 30 мин, трансфер пластины обратно в лед. Добавить 50 мкл 2x буфера для лизиса SDS в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Могут протекать при этой точке к следующему шагу, или не запечатать пластины с алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С до удобно.

4. Выполнение, окрашивание и сушка Гели

Примечание: Все работы должны быть выполнены в области DESIGNAТед радиоактивности.

1. Включите гибридизации печи и установлен на 85 ° С. Оттаивания пластины при комнатной температуре. После того, как печь достигла температуры, передачи пластин печи и инкубировать в течение 10 мин для денатурации образцов.
2. Нагрузка 26-а гели предварительно литые с 15 мкл каждого реакции с использованием многоканальной пипетки, чтобы заполнить несколько скважин сразу. Уход должны быть приняты, что все советы выравнивания с соответствующими перед добавлением образцов. Запустите гель при 150 В. Не позволяйте отслеживания краситель (синяя линия) бежать в нижней части геля, поскольку это содержит неинкорпорированную АТФ.
3. Демонтаж гели и отрезать неинкорпорированную АТФ (синяя линия), используя скальпель или прямой край, как это будет передержать фильмы. Поместите гели маркированных контейнерах и накрыть Coomassie пятно в течение 15 мин.
4. Удалить пятно Кумасси, кратко промыть водой гели с, и добавить destain решение. Destain гелей, пока белки не четко видны. Полоса для MBP и группа для подложки должныбудет видно для каждого образца.
5. Чтобы высушить гели:
   1. Вырезать большой лист фильтровальной бумаги и поместите его на стол.
   2. Смочите лист целлофана в дистиллированной воде, пока она не является гладкой и морщины бесплатно, и поместите его в верхней части листа.
   3. Положите гели сверху целлофановую листа, принятия к сведению порядка гелей. Смочите второй целлофановой лист и поместите на вершине гелей.
   4. Раскатать все пузырьки (плита уплотнения ролика работает хорошо для этого) для хорошей однородной поверхностью. Закрыть крышку, включить вакууме и высушить гели в течение 3 ч при 80 ° С.
6. После того, как гели сухой, не подвергайте их XAR фильма с помощью экрана, чтобы активизировать сигнал. Оберните кассету с пленкой или Саран полиэтиленовый пакет и запечатать лентой, чтобы не пустить мороз. Хранить кассету при -80 ° С в течение ночи.

5. Разработка Xar Фильмы

1. На следующий день, удалить кассету из морозильника и пусть оттепель при комнатной температуре. Разработка пленку вфотолаборатории с использованием процессора пленки в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Изучите фильмы для доказательства пар киназы-подложки. Второй больше экспозиции также может быть полезно для выявления слабых события фосфорилирования.

Results

Типичные результаты экране показаны на рисунке 2. 180 киназы, подвергали скринингу с использованием GST-меченый субстрат, соответствующий пептид АА 268-283 из crtc2 а также классический киназы субстрат основного белка миелина (МВР). Только два киназы, MARK2 и высоко связанные киназы фосфорилируется с Mark3 CRTC2 пептид. МВР входит в качестве внутреннего контроля во всех анализах, так как он содержит множество остатков phosphorylatable и работает на 18 кДа, в нижней части геля. Это позволяет для интерпре...

Discussion

С оригинальных публикаций, описывающих подход ^14,15, оригинальная библиотека 180 GST-киназы был расширен до 420 членов, или ~ 80% от kinome белка человека. С расширенной библиотеки, протокол, как описано занимает 4-5 дней, а затем 1-4 дней, чтобы развивать фильмы (по мере необходимости), которая может быть сокращен за счет использования phosphorimaging и цифровых технологий сигнала. Есть несколько ключевых шагов, где должны быть учтены (рисунок 1 для обзора протокола). Во-первых, это здоровье...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Буфер для лизиса	Сделано на месте		См. Шаг протокола 1.1
10x Буфер киназы	Сделано на месте		См. Шаг протокола 1.2
10x M-АТФ	Сделано на месте		См. Шаг протокола 1.3
Плазмиды киназы человека	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-помечено в доме
96 луночных планшетов	Fisher Scientific	CS003595
293Т-клетки	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	добавка с 100  Ед/мл пенициллин, 100  μ г/мл стрептомицина, 10% эмбриональная телячья сыворотка.
CO2	Sanyo	MCO-17AIC
15 см чашки для клеточных культур	Fisher Scientific	877224
Восстановленная сывороточная среда	Invitrogen	22600-050
Реагент для трансфекции на основе липидов	Invitrogen	11668-019
Автоматический дозатор жидкости	Thermo Scientific	5840300
Маленькая кассетная насадка	Thermo Scientific	24073295
Стандартная кассетная насадка	Thermo Scientific	14072670
4 мМ перванадат	Сделано на месте		См. Протокол шаг 3.1
0,25 М CaCl2	Сделано в собственном производстве
Многоканальный дозатор (20-200 μ l)	Labnet	p4812-200
Многоканальный дозатор (1-10 μ l)	Thermo Scientific	4661040
V-образным дном 6-луночные планшеты	Evergreen Scientific	290-8116-01V
96-луночные пластины с глутатионовым покрытием	Fisher Scientific	PI-15240
Гибридизационная печь	Biostad	350355
GST с маркировкой субстрат	Сделано в собственном производстве
Основной белок миелина (MBP)		M1891
(1 мл)	Eppendorf	22266209
32P гамма-АТФ	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x буфер для лизиса SDS (100  ml)	Сделано на месте		См. Протокол шаг 1.4
26-луночный сборный TGX гели	BioRad	567-1045	требуемый процент геля зависит от молекулярной массы интересующего субстрата
Краситель Coomassie Сделано	в доме		0,1% Coomassie R250, 10% уксусная кислота, 40% метанол
Кумасси удаляет пятна	Сделано внутри дома		10% уксусная кислота, 20% метанол
Маркированные гелевые контейнеры	Сделано на месте		Использованные пластиковые крышки от пустых коробок для наконечников, достаточно большие, чтобы вместить один гель
Ватман фильтровальная бумага	Fisher Scientific	57144
Целлофановые листы (2)	BioRad	165-0963
Гелевая сушилка	Labconco	4330150
Двойная эмульсионная авторадиографическая пленка	VWR	IB1651454
Кассета с пленкой	Fisher Scientific	FBAC-1417
Экран усиливающий	Fisher Scientific	FBIS-1417
Пластина уплотнительная резиновый ролик	Sigma	R1275