Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

Simon W. Fellgett; Simon A. Ramsbottom; Richard J. Maguire; Stephen Cross; Peter O'Toole; Mary E. Pownall

doi:10.3791/53162

Методическая статья

Использование конфокальной Анализ

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 декабря 2015 г.

Simon W. Fellgett¹ , Simon A. Ramsbottom² , Richard J. Maguire³ , Stephen Cross⁴ , Peter O'Toole⁵ , Mary E. Pownall⁵

¹Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ²Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, ³Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ⁴School of Biochemistry, University of Bristol, ⁵Biology Department, University of York

В этой статье

Краткое содержание

Рукопись здесь предоставляет простой набор методов для анализа секрецию и распространение флуоресцентно меченых лигандов в Xenopus. Это обеспечивает контекст для тестирования на способность других белков, чтобы изменить распределение лиганда и позволяет эксперименты, которые могут дать представление о механизмах, регулирующих морфогена градиенты.

Аннотация

Этот протокол описан способ визуализации лиганды распределенными по области клеток. Легкость выражения экзогенные белки, вместе с большим размером их клеток в ранних эмбрионов, сделать Xenopus Laevis полезную модель для визуализации GFP-тегами лигандов. Синтетические мРНК эффективно переведены после инъекции в ранней стадии эмбрионов Xenopus, и инъекции могут быть направлены к одной ячейке. В сочетании с клона метки, такие как мембраны на привязи RFP, вводимый элемент (и его потомки), которые производят суперэкспрессированный белок легко может следовать. Этот протокол описывает способ получения флуоресцентно помечены Wnt и Shh лигандов из введенного мРНК. Способы включают МиCRO рассечение эктодермальных эксплантов (шапки животных) и анализа лиганда диффузии в нескольких образцах. При использовании конфокальной микроскопии, информация о секреции лиганда и диффузии над полем клеток может быть получена. Статистический анализ конфокальной изображений обеспечивают количественные данные о форме лигандов градиентов. Эти методы могут быть полезны для исследователей, которые хотят, чтобы проверить эффекты факторов, которые могут регулировать форму морфогена градиентов.

Введение

Во раннего эмбрионального развития, клетки постепенно стремится следовать конкретные клоны дифференциации: это означает группу Тотипотентных (или плюрипотентных клеток) становятся постепенно ограничивается установления популяции клеток-предшественников определенных для возникновения одного типа клеток. Сигнализация межклеточных занимает центральное место в регуляции спецификации клонов во время эмбрионального развития. Манипулирование этих сигналов будет необходимо направить стволовые клетки к тем или иным судьбы поддерживать новые лечебные процедуры.

Относительно небольшое количество сигнальных путей повторяются в процессе развития, в то....