Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование конфокальной Анализ

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

В этой статье

Краткое содержание

Рукопись здесь предоставляет простой набор методов для анализа секрецию и распространение флуоресцентно меченых лигандов в Xenopus. Это обеспечивает контекст для тестирования на способность других белков, чтобы изменить распределение лиганда и позволяет эксперименты, которые могут дать представление о механизмах, регулирующих морфогена градиенты.

Аннотация

Этот протокол описан способ визуализации лиганды распределенными по области клеток. Легкость выражения экзогенные белки, вместе с большим размером их клеток в ранних эмбрионов, сделать Xenopus Laevis полезную модель для визуализации GFP-тегами лигандов. Синтетические мРНК эффективно переведены после инъекции в ранней стадии эмбрионов Xenopus, и инъекции могут быть направлены к одной ячейке. В сочетании с клона метки, такие как мембраны на привязи RFP, вводимый элемент (и его потомки), которые производят суперэкспрессированный белок легко может следовать. Этот протокол описывает способ получения флуоресцентно помечены Wnt и Shh лигандов из введенного мРНК. Способы включают МиCRO рассечение эктодермальных эксплантов (шапки животных) и анализа лиганда диффузии в нескольких образцах. При использовании конфокальной микроскопии, информация о секреции лиганда и диффузии над полем клеток может быть получена. Статистический анализ конфокальной изображений обеспечивают количественные данные о форме лигандов градиентов. Эти методы могут быть полезны для исследователей, которые хотят, чтобы проверить эффекты факторов, которые могут регулировать форму морфогена градиентов.

Введение

Во раннего эмбрионального развития, клетки постепенно стремится следовать конкретные клоны дифференциации: это означает группу Тотипотентных (или плюрипотентных клеток) становятся постепенно ограничивается установления популяции клеток-предшественников определенных для возникновения одного типа клеток. Сигнализация межклеточных занимает центральное место в регуляции спецификации клонов во время эмбрионального развития. Манипулирование этих сигналов будет необходимо направить стволовые клетки к тем или иным судьбы поддерживать новые лечебные процедуры.

Относительно небольшое количество сигнальных путей повторяются в процессе развития, в том числе путей, отвечающих на надсемейства TGF (nodals и БМП) 1-2, FGFs 3 Wnts 4 и 5 Ежики. Эти секретируемые белки связываются рецепторы, присутствующие на клеточной мембране, чтобы активировать передачу сигнала таким образом изменяя экспрессию генов и / или поведение клеток. Тесная регулирование клеточной знакAlling имеет важное значение для спецификации клеточных клонов и нормального развития. В то время как перекрестные помехи между этими путей имеет важное значение при определении судьбы клеток, один лиганд может сам вызывать различные реакции при различных концентрациях. Морфогена градиенты были описаны более 100 лет назад в качестве теории, чтобы объяснить, как различные типы клеток можно получить из поля ячеек 6. Сигнальные молекулы, производимые одной группы клеток могут диффундировать в течение определенного диапазона, уменьшая концентрации с большего расстояния от источника. Клетки подвергаются сигнала будет реагировать на локальной концентрации в их положении в области клеток, с клетками в различных позициях в ответ другому к различным уровням сигнала. Доказательства существования морфогенов из исследований раннего эмбриона дрозофилы 7 и 8 диска крыла, а также позвоночных конечности 9 и нервной трубки 10.

Методы необходимы вvestigate как морфогеном градиенты устанавливаются и определить другие молекулы, важные для регулирования этих градиентов. Элегантные эксперименты с использованием иммуногистохимии для визуализации эндогенных белков в естественных условиях в контексте различных генетических фоны были использованы для расследования морфогена градиенты 11-12. Тем не менее, хорошие антитела и специфические мутанты не всегда доступны, поэтому мы здесь описывать протокол, используя избыточную экспрессию люминесцентных лигандов в Xenopus, чтобы обеспечить альтернативу, простой метод препарировать, как экзогенные генных продуктов может влиять на распределение лигандов по полю клеток. Xenopus Laevis обеспечивает отличную систему для выполнения этих типов экспериментов, их эмбрионы развиваются внешне так что они доступны на самых ранних стадиях. Их большой размер (1-1.5мм в диаметре) упрощает микроинъекции и хирургических манипуляций и бластула стадии клетки легко изображения, как они все еще относительно большой (около 2081; м в поперечнике). Избыточной экспрессии исследования в Xenopus являются просто сделать: мРНК вводят в начале эмбриона могут быть направлены на конкретных клеток и эффективно перевести.

Флуоресцентно меченые Wnt8a / Wnt11b-ГА-EGFP конструкций были получены с использованием PCS2 Wnt8a-HA 13, PCS2 Wnt11b-HA 14 и EGFP. НА, пептид важно включить не только для обеспечения дополнительного молекулярного тег, но и потому, что, как полагают, действуют как распорки, разделяющей белки Wnt и EGFP позволяет как генные продукты функционировать. Конструкция используется для визуализации Shh ранее был использован для генерации трансгенных мышей, экспрессирующих Тс-EGFP гибридный белок 15; это было любезно предоставлено Энди Мак-Магон. Важно отметить, что метка GFP для всех конструкций, клонируют 3 'сигнальной последовательности таким образом, что сохраняется после обработки. Важно также, чтобы гарантировать, что окончательный белок включает в себя последовательности, необходимые для модификации, такие в сложения ип липидов, как и в случае Shh и Wnt ligands.The кДНК субклонировали в PCS2 + вектор экспрессии, который оптимизирован для снятые с производства синтетического мРНК; она включает в себя промотор SP6 и сигнал полиаденилирования (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Работа описано здесь обеспечивает простой протокол для сравнения секрецию и распространение флуоресцентно помечены Wnt и Тс помечены лигандов. Вводя определенные суммы синтетического мРНК, протокол circumnavigates любые проблемы, связанные с переменным выражения из разных векторов, использующих различные промоторы. Эти методы были недавно применены для исследования последствий гепарансульфат endosulfatase Sulf1 на Тсс-EGFP и Wnt8a / секреции Wnt11b-ГА-EGFP и диффузии в Xenopus 16-17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика заявление: Эксперименты на животных были проведены в соответствии с лицензией внутренних дел Великобритании МООС и эксперименты, проведенные была одобрена университет Йорка комитета по этике в соответствии с приехать (Animal Research: Представление в естественных условиях экспериментов) руководящих принципов. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Стратегия для генерации флуоресцентно Tagged Лигандов

Ниже приведен пример протокол субклонированием Wnt8a-HA и EGFP в PCS2, для того, чтобы производить в рамке слияния построить Wnta-HA-EGFP:

  1. Установить и запустить ПЦР для Wnt8a-HA и EGFP. Использование праймера информации, отображаемой таблицы1 и реакцию ПЦР Пример Пример ПЦР и условий представлены в таблице 2. Примечание: ДНК шаблона будет изменяться в зависимости от конструкции производится, в этом примере, Wnt8a-HA используется в качестве матричной ДНК.
  2. Очистка ПЦР реакции с использованием набора для экстракции геля, выполните окончательную элюирование в 30μl воды молекулярной класса.
  3. Проверка 2 мкл продукта ПЦР на 1% агарозном геле в ТАЕ подготовленной.
  4. Дайджест Wnt8a-HA и продукты ПЦР и EGFP шт.2 с использованием соответствующих рестриктаз (таблица 1), настроить реакции, как описано в таблице 2 (Пример ПЦР-продукт дайджеста).
  5. Инкубируйте реакции в течение 3 ч при 37 ° С, а затем хранить Wnt8a-HA и GFP продуктов ПЦР на льду.
  6. Добавить 1 мкл теленка щелочной фосфатазы кишечника (CAIP), чтобы шт.2 дайджеста и инкубируют в течение 6 мин при 37 ° С.
  7. Тепло инактивации CAIP путем инкубации в течение 15 мин при 65 ° С.
  8. Выполнить PCS2 и ПЦР переваривает на 1% агарозном геле сверхчистых подготовлен в TAE.
  9. Экстракт гель и очистить PCS2 и продуктов ПЦР с использованием набора для экстракции геля, выполните окончательную элюирование в 30 мкл воды молекулярной класса.
  10. Настройка лигирование, как описано в таблице 2 (пример Т4 лигирования) и инкубируют при 12 ° С в течение 16 ч.

2. Синтез мРНК: Генерация Template

  1. Продукция шаблоны, используя рестриктазой из следующих плазмид (все в векторном PCS2 выражение): мембрана-Лазурная (memCerulean), мембрана-ЗП (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP.
    1. Установите ограничение дайджесты, как описано в таблице 2 (Пример шаблона переварить).
    2. Тщательно перемешать и инкубировать реакции в течение 2 ч при 37 ° С.
  2. Запустите 2,5 мкл переваренной плазмидой на 1% агарозном геле (TAE), чтобы проверить, что реакция сократить до завершения.
  3. Убирать сборников, используя набора для экстракции гелей, выполните окончательную элюирование в 50 мкл воды молекулярной класса.

3. Синтез мРНК: In Vitro транскрипции

  1. Обобщить функциональные мРНК, используя набор транскрипции SP6 мРНК. Соберите реакции в 1,5 мл ДНКазы / РНКазы микропробирок.
  2. Настройка реакции транскрипции мРНК, как описано в таблице 2 (Пример синтеза мРНК).
  3. СмешайтеРеакции осторожно пипеткой а затем инкубируют при 37 ° С в течение 4 ч.
  4. Проверьте 1 мкл реакции на 2% агарозном геле (TAE).
  5. Добавить 1 мкл ДНКазы в реакции, осторожно перемешать с P20 и инкубируют реакцию в течение еще 15 мин при 37 ° С.
  6. Добавить 340 мкл воды молекулярной класса 40 мкл ацетата аммония и 400 мкл фенолхлороформом к реакции. Vortex реакции в течение 30 сек.
  7. Спин мРНК в течение 5 мин, 14000 XG, 4 ° C.
  8. Внесите верхнюю (водный) слой из каждой реакции переместить его на свежих 1,5 мл завинчивающейся крышкой микроцентрифужную трубку.
  9. Добавить равный объем хлороформа, чтобы каждый из декантируют реакций. Vortex образцы в течение 30 сек.
  10. Спин мРНК в течение 5 мин, 14000 х г, 4 ° С
  11. Пипетировать верхнюю водную фазу из каждой реакции перемещает его в свежем 1,5 мл завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных.
  12. Добавить равный объем изопропанола, каждой из реакций и осаждают МРН.А. при -80 ° С в течение 30 мин.
  13. Спин каждой из реакций в течение 15 мин при 14000 х г, 4 ° С для осаждения мРНК
  14. Удалить надосадочную заботиться, чтобы не нарушить гранулированный мРНК
  15. Добавить 200 мкл 70% этанола, чтобы каждой из реакций, смешивать реакции, а затем вращаться в течение 10 мин при 14000 х г, 4 ° С.
  16. Удалить этанола, стараясь не нарушить мРНК, сухой осадок при комнатной температуре, используя вакуум-эксикаторе или скорость-VAC.
  17. Повторное приостановить мРНК в 10-20 мкл воды молекулярной класса. Кратко спина и сохранить образцы на льду. Примечание: Нагрев образца до 80 ° С в течение 1 мин может помочь ему раствориться.
  18. Запуск 1 мкл мРНК на 2% агарозном геле (ТАЕ) и анализировать 1,2 мкл на спектрофотометре, чтобы получить точный отсчет концентрации.
    ВАЖНЫЙ ШАГ: Концентрация 400 нг / мкл синтетического мРНК требуется проводить следующие эксперименты.
    Важным шагом: Если отношение 260/280 являетсяза пределами диапазона 2,00-2,20, или общего количества мРНК превышает 12 мкг, провести осаждение хлорида лития.
  19. Магазин мРНК в 1 мкл аликвотах при -80 ° С. Используйте аликвоты, а затем выбросить; не повторно заморозить мРНК.

4. Создание Xenopus Laevis Эмбрионы

  1. Премьер-Xenopus Laevis женщин путем подкожной инъекции 50 единиц хорионического гонадотропина (ХГЧ гормон; Chorulon) за неделю до эксперимента.
  2. Вызвать у Xenopus Laevis самок ночь перед экспериментом путем введения 250 единиц ХГЧ и инкубации их в темноте, O / N на 19 ° C.
  3. Рассеките из яичек из эвтаназии мужской лягушки и в магазине в 1xNAM при 4 ° С. Примечание: Мужской лягушка эвтаназии терминалом анестезии в соответствии с Приложением 1 Животные (Научные Процедуры) закон 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Массаж женщина Xenopus Laevis, чтобы вызвать овуляцию, собирать ЛаID яйца в диаметре 55 мм круглые чашки Петри.
  5. Продукция суспензии сперматозоидов путем дробления на ¼ Xenopus Laevis яичка в 1 мл деионизированной воды.
  6. Кисть Xenopus ооцитов с измельченной суспензии сперматозоидов с помощью пипетки Пастера и пипетки лампы Важным шагом:. Выполните оплодотворение реакции примерно в 4:30 вечера в день эксперимента.
  7. Эмбрионы Культура в 21 ° C в ДН / 10 (таблица 3) для решения в 55 мм чашках Петри, покрытых 1% агарозы, разведенного в воде (воды).
  8. Эмбрионы Де-желе Через 45 мин с помощью цистеина / HCl (таблица 3). Примечание: при 21 ° С, эмбрионы достигают стадии 2 клеток после 90 мин и прилепится каждые 20 мин после этого.

5. Microinjecting Xenopus эмбрионов

  1. Использование 1 х 90 мм стеклянных капилляров и Narishige ПК-10 двухступенчатый стекло микропипетки съемник, потяните микропипетки для инъекций. Настройка параметров эмпирически для достижения тонкой кончик (менее одного микрона диатер).
  2. Приложить микропипетки (игла) в газовой microinjector (например, Harvard Appartaus PLI-100 Pico-инжектор), чтобы многократно доставить точные объемы жидкости с применением регулируемое давление на цифровом установленного периода времени. Отрегулируйте пневматическое давление, чтобы доставить объем от 1,25 до 10 nanolitres как определено с помощью сетки нитей или калибровки слайд.
  3. Шерсть 55 мм чашки Петри с 5 мл 1% агарозном (воды). Вырезать 35-35 мм квадрат агарозы из тарелки, то это обеспечит стабильную поверхность microinject эмбрионов.
  4. Передача эмбрионы в ДН / 3 + Ficoll (Таблица 3) и перейти к инъекции блюдо.
  5. Вводите эмбрионов в животном полушарии как только они достигают необходимой предпосылки для эксперимента.
    1. Чтобы проанализировать распределение GFP меченых лигандов на поверхности клеток, вводят эмбрионов на двусторонней основе в два этапа клеток, 10nl на клетку. Пример мРНК разведения показанные ниже Wnt8a-HA-EGFP. Важным шагом: Убедитесь, что все мРНК концентраций улискусство в 400 нг / мкл.
      Примечание: Количество мРНК, который будет введен должна быть определена эмпирически путем тестирования концентрации и поиск минимального количества, необходимого для визуализации флуоресцентного лиганда. Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-HA является важным шагом для определения того, что мРНК, пересчитываются в подобных уровнях в целях выполнения сравнения двух различных флуоресцентно меченых лигандов; мы сделали это для Wnt8a-HA-EGFP и Wnt11b-HA-EGFP в Fellgett и др., 2015.
      Примечание: При оценке влияния инъецированного мРНК (таких, как одной кодировки для регулятора кандидата), типичный управления, чтобы ввести неактивный РНК, например, LacZ, в двойников эмбрионов в целях контроля за любые последствия в дополнительный транскриптов в эмбрионе.
      1. Развести memRFP мРНК 1 в 4 (1 мкл 3 мкл дН + 2 O) с водой молекулярной класса снизить концентрацию до 100 нг / мкл.
      2. Развести Wnt8a-HA-EGFP мРНК 1 в 4 (1 мкл 3 мкл дН +2 O) с водой молекулярной класса снизить концентрацию до 100 нг / мкл.
      3. Смешайте memRFP мРНК в соотношении 1: 1 с Wnt8a-ГА-EGFP мРНК.
      4. Смешайте мРНК из 5.5.1.3 в соотношении 1: 1 либо с контролем мРНК LacZ или модулятора таких как Sulf1.
      5. Вводите эмбрионов на двусторонней основе на стадии 2 клеток с 10nl мРНК в клетке (в общей сложности 20nl). Примечание: В результате в 250 пг м эм ППП, 250 пг Wnt8a-ГА ВГП электронной GFP, 500 пг Wnt11b-HA- электронной GFP и 2 нг LacZ или Sulf1 мРНК впрыскивается в каждой ячейке.
    2. Для анализа диффузии GFP помечены лиганды, вводят мРНК, кодирующую лиганд-GFP вместе с клонов маркер, такой как memRFP на стадии 16-32 клеток, 1.25 NL на клетку.
    3. Для анализа последствий любого потенциального модулятора лиганда диффузии, совместно вводят мРНК, кодирующей модулятора вместе с лиганда и рода индикатора. Кроме того, вводят соседние клетки: одна с мРНК, кодирующих GFP-тегами ligand и линия Tracer (memRFP), а другой с мРНК, кодирующих модулятора и другой клонов метки (memCerulean).
  6. Эмбрионы передачи в 12,5 ° C инкубатора и культуры до следующего дня, Nieuwkoop и Фабер (НФ) этап 8.

6. иссечения животных Cap Экспланты

  1. Эмбрионы перевод на 55 мм чашках Петри, покрытых 5 мл 1% агарозы (воды). Заполните блюдо с ДН / 2 (таблица 3).
  2. Возьмите круговой шапки животных, используя вольфрама иглы важный шаг:. Возьмите большие шапки на данном этапе, как они будут лечить лучше и легче изображения, сохранить контроль крышки, чтобы убедиться в отсутствии расширение сходится не происходит.
  3. Перевести эксплантов животных до 55 мм чашки Петри, покрытые 1% агарозы (воды) и эмбрионов культуры при 21 ° С в течение 4 ч важный шаг:. 4 ч инкубации требуется, чтобы флуоресцентные белки, чтобы созреть.
  4. Создать помощи слайдов, придерживаясь вниз два слоя ПВХ insulatioп ленты на предметных стеклах. Отрежьте 14 мм на 10 мм прямоугольника из ленты, чтобы оставить камеру для монтажа крышек животных важный шаг:. Свести оба слоя ленты тщательно на слайде до резки прямоугольник.
  5. Внесите 2 капли отдельных ДН / 2 (Таблица 3) в рельеф слайд, примерно 30 мкл на каплю.
  6. Перевести эксплантов животных к слайдам по оказанию помощи с использованием отсечения кончика P20 и ориентироваться так, чтобы верхушечная сторона обращена вверх. Примечание: Каждый слайд может содержать 10-15 колпачки животных важный шаг:. На этом этапе шапки животных должны частично исцелиться, это означает, что они менее деликатный и может быть ориентирована с помощью щипцов.
  7. Осторожно опустите стеклянной крышкой скольжения на слайде помощи и позволить покровное высохнуть в течение 20 мин важный шаг: Размер животного крышки имеет решающее значение;. обеспечить крышка является достаточно большим, что, когда стекло покровное опускается на слайде помощи он сжимает верхушечный слой животных клеток капитализации достаточно, чтобы прoduce плоскую поверхность к изображению. Если колпачки животных слишком малы еще тогда уменьшить ПВХ ленты с одним слоем.
  8. Уплотнение слайд, используя лак для ногтей важный шаг:. Не используйте слишком много лака для ногтей, чтобы запечатать слайды облегчение, потому что, если лента ПВХ становится слишком влажной она будет поднимать и разрушить слайд.
  9. Сухие горки для сброса в течение 20 мин в темноте и они готовы к изображению, как правило, шапки животных будет оставаться здоровым в течение 4-6 ч раз запечатанной на слайде.

7. изображений

Примечание: изображений проводили с использованием инвертированного конфокальной микроскопии. Режим Лямбда была выбрана для визуализации, как это позволило несколько флуорофоры с перекрытием подписей, которые будут использоваться, и снял проблему потенциального движения образца между проверками.

  1. Найти эксплантов использованием низкой кратности цель затем переключиться на 63x / 1.4 нефтяной цели высшего изображений разрешением.
  2. Включите необходимые лазеров; для данного примера 405лазер используется для возбуждения memCerulean, 488 лазера для возбуждения GFP и 561 лазерных возбудить memRFP помощью 405 и 488/561 дихроичных зеркал.
  3. Используйте режим лямбда (В дзен 2011, выберите режим лямбда - 32 бункеров).
  4. Выберите 405nm, 488nm и 561nm lasers.To разрешить более широкое поле зрения, уменьшить изображение (до 0.6x).
  5. Установить размер кадра до требуемого размера изображения (1024 X 1024 с размерами пикселей 220 нм была использована для этого набора данных).
  6. Установка усреднения, как правило, от 4 до 8, чтобы увеличить отношение сигнал-шум.
  7. Оптимизация обскуры (1 воздушный блок в соответствии с лазером 561nm была использована для этого набора данных).
  8. Оптимизация лазерных полномочия важный шаг:. Баланс 405, 488 нм и 561nm лазеры такие, что все флуорофоры могут быть обнаружены с помощью массива 32 детектора, минимизируя количество напряжения и усиления требуется.
  9. Соберите свет, излучаемый от memCerulean, GFP и memRFP. Для этой работы были собраны света каждый ~10 нм от 415-720nm, хотя больших интервалах сбора также возможны (например., Каждый ~ 20 нм).

Анализ 8. Изображение

  1. Исследование действия модуляторов на клеточной поверхности экспрессию GFP-меченый лигандов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги подробное руководство о том, как анализ был проведен в нашей лаборатории. Конечный пользователь может хочу упростить процесс, написав сценарий ImageJ или Фиджи, чтобы удалить некоторые из ручных шагов.
    Важным шагом: Важно образцы конечных пользователей спектры ни флуорофорами, используемых в тех же условиях, что окончательное эксперимент проводится для того, чтобы перфорация ORM эффективной спектральной расслоении нескольких флуорофоров, используемых в конечном эксперимента.
    Существует два основных типа анализа производится в этом разделе:
    1. Расчет общего количества Wnt-HA-EGFP пикселей со-локализации с клеточной мембраной.
      1. Unmix зеленый,красные и Лазурная каналов с использованием спектров выборочные от отдельных инъекций этих флуорофоров в ZEN программного обеспечения. Сохраните эти изображения как отдельные документы LSM использовать во всех следующих шагов.
      2. Открыть LSM файлы непосредственно в программу редактирования изображений. Примечание: Следующие инструкции предназначены для ФИДЖИ Image J.
      3. Сохранить LSM изображения в качестве документов последовательность изображений, это будет автоматически разделен изображения в отдельных каналах.
      4. Сохранить последовательность изображений в той же папке, сценарии для программного обеспечения анализа сценария, который будет использоваться для анализа данных (см дополнительные файлы кода для фактической сценария). Примечание: Следующие инструкции предназначены для Matlab.
      5. Откройте программное обеспечение для анализа сценария и открыть каталог, в котором написаны сценарии.
      6. Введите имя файла, под анализом Место, программное обеспечение будет имя файла и выполнить анализ.
        Примечание: Имена файлов будут читать ImageA0000 и ImageA0001 для каждого IMAGE. Программное обеспечение для анализа скрипт использовать изображение отмечены 0001 в качестве маски и анализировать процент пикселей в изображении 0000, что ко-локализуются с этой маской.
      7. Возьмите число процент совместной локализации (аннотированный, как клеточная мембрана населенном) и скопировать его в электронную таблицу. Примечание: Следующие инструкции предназначены для Excel.
      8. Участок номер процент совместной локализации на гистограмме либо в качестве абсолютной или относительной стоимости.
    2. Анализируя количество, размер и форму Wnt-ГА-EGFP Puncta.
      1. Открыть несмешанным LSM файлы непосредственно в программу редактирования изображений. Примечание: Следующие инструкции предназначены для ФИДЖИ Image J.
      2. Сплит каждое изображение на отдельные каналы (Image> Цветные> Сплит каналов).
      3. Порог как Wnt-ГА-EGFP и мембраны маркерные каналы (изображение> Adjust> Авто-порог) Важным шагом:. Попробуйте ряд порогов, чтобы увидеть, какой репрезентативного изображения, не передержатьканал.
      4. Преобразование канал маркера мембраны к маске (Process> Binary> Сделать маску).
      5. Обратить эту маску (Редактировать> Инвертировать).
      6. Преобразование Puncta Wnt-HA-EGFP в маску, как описано выше.
      7. Вычтите мембраны маркер маску от маски лиганд-GFP (процесса> калькулятор Image> Wnt маски в верхней коробке, мембрана маски в нижней коробке).
      8. Используйте функцию анализа частиц. Отсюда, выберите необходимые параметры и анализировать данные (Анализ> Проанализировать частиц).
      9. Копирование число частиц, средний размер частиц и данных округлости в таблицу, а затем построить графики на основе этих данных. Примечание: Для этого анализа, только частицы между 0.1-10μm 2 размер были проанализированы, никаких ограничений не были размещены на округлости частиц. Эта инструкция для Excel.
  2. Анализируя спектр лиганда диффузии
    1. Откройте все несмешанные изображения в конфокальной имстарения программного обеспечения, а затем экспортировать файлы в формате TIF, как исходные данные и как образ RGB. Примечание:. Данная инструкция для Zen Lite 2011 Важнейший шаг: Включить масштабную линейку, по меньшей мере одно из изображений, чтобы расстояние может быть рассчитывается в ходе анализа.
    2. Откройте изображения, которые будут проанализированы в программное обеспечение для анализа изображений. Примечание: Следующие инструкции предназначены для Photoshop 8.2.3) Щелкните правой кнопкой мыши на фоне изображения и выберите "слой от фонового, чтобы создать новый слой..
    3. Установите мембрану маркеров каналы 0, так что только лиганд-GFP канала видна (Слой> Новый слой настройки> канальный микшер) Важным шагом:. Клип новый корректирующий слой с изображением анализируются, возможность обрезать новый слой чтобы этого изображения доступен как сделать отметку после нажатия на опцию канальный микшер.
    4. Откройте новую рабочую область. Установите разрешение в 300 пикселей на дюйм и цветового режима к цвету RGB (File>Новый> Буфер обмена).
    5. Копировать все изображения анализируются в одной рабочей области (Нажмите на изображение, и это обрезается канал микшера, удерживая контроль затем, удерживая контроль и Alt и перетащите изображение в рабочую область).
    6. Ориентировать всех изображений таким образом, что максимальная длина диффузии для каждого изображения может быть измерена по горизонтальной оси, с клетками, экспрессирующими Wnt-HA-EGFP ориентирована влево.
    7. Сохранить рабочее пространство как TIF, а затем открыть это программное обеспечение для анализа изображений. Примечание: Следующие инструкции предназначены для ФИДЖИ Image J.
    8. Откройте окно менеджера ROI (Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI).
    9. Нарисуйте прямоугольник на первом изображении, точный размер прямоугольника могут быть заданы (Выберите инструмент прямоугольник и нарисовать любую прямоугольник> Изменить> Выбор> Укажите). Примечание: размер 650 х 100 пикселей длина х ширина была использована в данном исследовании.
    10. Расположите прямоугольник на самом краю области, выражающей Wnт-ГА-EGFP. Поместите прямоугольник на регион с максимальным расстоянием Wnt-ГА-EGFP диффузии. Важным шагом: Даже без мембраны маркера регионы, выражающие Wnt-HA- электронной GFP должна быть видна из-за фоновой флуоресценции; если нет, то обратитесь необработанных изображений.
    11. Сдвиг коробке 10 мкм вправо. Определить количество микрометров путем измерения длины от шкалы, включенного в одно из изображений (Нарисуйте линию трассировки масштабную линейку> Анализ> установить масштаб). Примечание: Это обеспечивает значение для 10 мкМ в пикселях.
    12. Добавить коробку с менеджером ROI, нажав на кнопку Добавить окне менеджера ROI.
    13. Переместить прямоугольник к следующему изображению, чтобы измерить, нажав обратно на инструмент прямоугольника, чтобы переместить прямоугольник. Повторите шаги 8.2.10-11.
    14. После того, как все панели были измерены, выберите Multiplot из меню менеджера ROI (ROI менеджера> Дополнительно> Multiplot> Список).
      Примечание: данные представляют Wnt пикселей Intensity (Y), с увеличением расстояния вдоль горизонтальной оси (X, измеряется в пикселях). Значение Y это средняя интенсивность сигнала лиганд-GFP в точке X и среднее значение рассчитывается из всех пикселей по оси Y. для каждого значения х. Следовательно, выше ящик, тем больше пикселей будут проанализированы, чтобы произвести это среднее. Небольшая коробка (по оси Y) будет шумнее; высокий ящик будет иметь очень низкую среднюю интенсивность пикселя.
    15. Скопируйте данные из коробки Multiplot в таблицу и повторно маркировать соответственно. Примечание: Следующие инструкции предназначены для Excel.
    16. Откажитесь от первого 10-20 мкм данных из каждого анализа, как это представляет фоновой флуоресценции от лиганд-GFP экспрессирующих клеток и искажает графики.
    17. Откройте научного анализа и графическое программное обеспечение и создать новый ноутбук. Примечание: Следующие инструкции предназначены для SigmaPlot 13.
    18. Добавьте необходимое количество колонок для данных двойным щелчком на горизонтальных чисел оп лист и маркировка им расстояние в мкм, Wnt8a-ГА-EGFP и Wnt11b-ГА-EGFP.
    19. Скопируйте данные из электронной таблицы в соответствующие столбцы в научный анализ и графическое программное обеспечение.
    20. Создать разброс граф (граф Создать> Точечная> Несколько разброс> Выберите X Y многие> Выберите столбец расстояние для X> Выбор Wnt8a-HA-EGFP и Wnt11b-HA-EGFP для значений Y> Finish).
    21. Выполните регрессионного анализа на Wnt8a-ГА-EGFP кривой левой кнопкой мыши на точке Wnt8a-ГА-EGFP на разброс графике. Все точки должны выделить. Нажмите на анализ> мастера регрессии.
    22. Выберите категорию уравнение кривой (экспоненциальное затухание) и имя уравнение (Single, 3 параметра), затем нажмите Далее.
    23. Выберите значения х и у, в которой кривая должна быть установлены (если была подчеркнута данные, ранее, это должно быть сделано автоматически), затем нажмите рядом.
    24. Продолжайте работу с мастером до числовой вариант выводаS Стр убедитесь, "Создать отчет" отмечена затем нажмите рядом. Примечание: Параметры для оборудованной кривой будет показано в отчете 1 *.
    25. На странице параметров Graph обеспечения "добавить уравнение для графического название" отмечена затем нажмите Готово. Примечание: Мастер создали отчет 1 * и график 1 * Вкладки в верхней части тетради. Кроме того будет добавлена ​​кривая на графике, полученного в (8.2.20).
    26. Повторите шаги 8.2.21-8.2.25, чтобы соответствовать кривой для Wnt11b-HA-EGFP Важным шагом:. Попробуйте подходящие несколько категорий уравнение и имен уравнение к данным. Примечание: Кривая с наилучшего должен производить самый высокий R 2 значения с низкой остаточной суммы квадратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Конфокальной анализ животных шапка эксплантов выражения флуоресцентно меченных белков обеспечивает эффективную систему для визуализации распределения лиганда в разных экспериментальных условиях. В одном примере распределение GFP помечены Тс показано (фиг.1). На этапе 2-клетки, эмбрионы Xenopus вводят в обеих клеток либо с контрольной мРНК или мРНК, кодирующей Sulf1, фермента, который изменяет клеточной поверхности сульфат гепаран и влияет на Shh градиент морфогена 16. Эти эмбрионы не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важной частью этого протокола генерирует биологически активные лиганды, которые обычно обрабатываются, секретируемые и способны вызывать ответ в приемной камере, несмотря на наличие флуоресцентного фрагмент, присоединенный. Очень важно установить, что флуоресцентно-меченый продукт гена является биологически активным использованием соответствующего анализа. Для Тсс-GFP, способность активировать экспрессию PTC1 было подтверждено 16. Wnt8a имеет удивительно мощным способностью индуцировать вторичный ось...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась BBSRC предоставить МООС (BB / H010297 / 1), аспирантуру квот BBSRC Сар, и студенчество MRC к SWF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаМелфордМБ 1200
Аммония ацетатАмбиониз Megascript SP6 Kit AM 1330
БикарбонатVWR InternationalRC-091
Нитрат кальцияSigmaC13961
Кап аналог (m7G(5'))AppliedBiosystemsAM 8050
ХлороформSigmaC 2432
L-цистеина гидрохлорид моногидратSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaO3690
ЭтанолVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J программное обеспечениеСкачать бесплатно http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
Ледяная уксусная кислотаFisher ScientificA/0400/PB17
Стеклянные покровные накладки, No.1.5 Принадлежности для научных лабораторий22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Стеклянный иглосъемникNarishigeNarishige PC -10
Стеклянные иглыDrummond Scientific3-000-203-G/X
Хронический гонадотропин человека (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Хлорид лития (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 и Программное обеспечение Zen (2008-2010)Программное обеспечение Carl Zeiss
Matlab Mathworkshttp://uk.mathworks.com/
Молекулярная вода Fisher ScientificBP 2819-10
Лак для ногтей BootsШтрих-код 3600530 373048
СпектрофотометрLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Чашка Петри (55 мм)VWR International391-0865
Фенол-хлороформSigmaP3803
Программное обеспечение PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
высокоточная ДНК-полимераза и Буферы БиолабсM0530S  Буфер - M0531S
Хлорид калия (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
Изоляционная лента из ПВХOnecallSH5006MPK
Набор для экстракции геля QiagenS28704
Буферы ферментов рестрикцииRocheSuRE/CUT Набор буферов 11082 035 001
РНКаза без РНКазы PromegaME10A
Стальные задние однолезвийные лезвияPersonna66-0403-0000
Хлорид натрия (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 набор для транскрипцииAmbionAM1330
Стеклянные горкиThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
Вольфрамовые иглысамодельные
Zen liteCarl ZeissСкачать бесплатно  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
программы

Ссылки

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Конфокальная микроскопиядиффузия лигандовфлуоресцентное мечениелиганды Wntлиганды Shhмикродиссекцияживотные каппыанализ изображений
Использование конфокальной Анализ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.