Методическая статья

Высокая пропускная способность Скрининг непокорности Вариации в лигноцеллюлозной биомассы: Total лигнина, лигнин мономеров и ферментативной сахара версии

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

15 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Структура клеточной стенки растений и химические свойства оцениваются для определения идеального сырья для биотоплива и биоматериалов. Стандартные методы имеют ограничения при применении к большим наборам данных. Эти высокопроизводительные методы предварительной обработки, осахаривания ферментов и пиролизно-молекулярно-лучевой масс-спектрометрии сравнивают большое количество образцов биомассы с сокращением времени и стоимости эксперимента.

Аннотация

Преобразование лигноцеллюлозной биомассы в топливо, химикаты и другие товары было исследовано как один из возможных путей сокращения использования невозобновляемых источников энергии. Для того чтобы определить, какие растения из разнообразного пула обладают желаемыми химическими свойствами для последующего применения, необходимо сравнить такие характеристики, как содержание целлюлозы и лигнина или высвобождение мономерного сахара после ферментативного осахаривания. Протоколы экспериментов и анализа данных стандартных методов анализа могут занимать много времени, что ограничивает количество образцов, которые могут быть измерены. Методы с высокой пропускной способностью (HTP) устраняют недостатки стандартных методов и позволяют проводить быстрый скрининг имеющихся образцов для выделения тех, которые обладают желаемыми признаками. Это исследование иллюстрирует высвобождение сахара HTP и пиролизно-молекулярно-лучевые масс-спектрометрические конвейеры, используемые в Национальной лаборатории возобновляемых источников энергии. Эти трубопроводы позволили эффективно оценить тысячи установок при одновременном сокращении времени и затрат на эксперименты за счет сокращения трудозатрат и расходных материалов.

Введение

Как мировой поставку невозобновляемых видов топлива и связанных с ними продуктов снижается, ученые были оспорены, чтобы создать аналогичные виды топлива и химических веществ из растительного происхождения источников 1. Ключевым аспектом этой работы является определение, какие виды растений могут быть пригодны для производства биотоплива и биоматериалов 2,3. Как правило, эти исходные материалы оценивают по лигнина, целлюлозы, гемицеллюлозы и содержания; а также их восприимчивости к деконструкции (непокорности) через тепловой, механической и / или химической обработки с или без последующей фермента осахаривания. Более детальный анализ используется для определения конкретного состава лигнина и гемицеллюлозы фракций, а также оптимальные активность ферментов, необходимых. Трансгенные модификации растений, которые не обладают внутренне идеальные черты для биохимического или термохимической конверсии к желаемым товаров обеспечили исследователям значительно расширил источника горшокциальных сырье 4. Стандартные аналитические методы для количественного химические черты завода, в то время как весьма полезным для небольших наборов образцов, не подходят для быстрого скрининга сотен или тысяч образцов 5-7. Методы, описанные здесь, ПВТ были разработаны быстро и эффективно оценить большое количество вариантов биомассы изменений в клеточной стенки непокорности в термохимической и / или ферментативного расщепления.

Очень важно понимать, что ПВТ методы скрининга, описанные выше, не был разработан, чтобы максимально преобразование или выход. Целью является определить относительные различия в сопротивляемости разрушению образцов связанных биомассы. В результате, многие из шагов анализа отличаются от "типичных" конверсии биомассы анализов, где целью является получить максимальную скорость преобразования или степень. Например, более низкие уровни важности предварительной обработки и более короткие времена ферментативного гидролиза используют, чтобы максимизировать отличаютсятывает между образцами. В большинстве случаев, относительно высокие нагрузки ферментов используются для уменьшения различий из-за различий в экспериментальной активности фермента, которые могли бы существенно исказить результаты.

Быстрые методы для определения состава клеточных стенок растений и мономерных сахаров освобождаю- следующие ферментные осахаривания включают робототехнику, индивидуальные, термохимически совместимые 96-луночные планшеты и модификации стандартных лабораторных методов и инструментальных 8-11 протоколы, такие как колебательной спектроскопии (ИК (ИК), ближнем инфракрасном (БИК), или комбинационное) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР) 12-17. Эти методики являются ключом к изоляции сырья с высоким целлюлозы или низким содержанием лигнина, или те, ожидается выход высокий глюкозы, ксилозы, этанол и т.д. Эти методы позволили с уменьшенным анализы, которые используют меньшее количество биомассы и расходных материалов, что приводит к снижению экспериментальная Расходы 18 . Еще одной особенностью этого подхода является то, методической, что различные экспериментальные условия могут быть быстро и одновременно в некоторых случаях, оценили. Например, множество различных стратегий для предварительной обработки или фермента коктейли могут быть проверены, что позволяет наиболее оптимальные параметры эксперимента, которые будут быстро определить и работу. Популярная сырье, такие как кукурузные стебли 9, тополь 8,10, сахарный тростник жома 8 и просо 8 были успешно оценены с помощью этих методов HTP.

Всего лигнин и лигнин мономерный состав также обычно количественно черты биомассы. Снижение содержания лигнина было показано для повышения ферментативной усвояемость полисахаридов 19,20. Роль, которую лигнин мономерный отношение (часто сообщается в сирингиловых / guaiacyl (S / G) содержание) играет в деконструкции завод клеточной стенки находится в стадии расследования. В некоторых докладах указывается, что сокращение S / GОтношение привело к увеличению урожайности глюкозы следующих гидролиза 21, в то время как другие исследования представит противоположную тенденцию 19,22. Высокие методы оценки пропускной лигнина и его мономеров включают колебательной спектроскопии (ИК, БИК, и комбинационного 23-26) в сочетании с многомерного анализа и пиролиза молекулярно-пучковой масс-спектрометрии (pyMBMS) 27,28.

При разработке методов ПВТ для скрининга биомассы, несколько интегральных соображения должны иметь в виду,. Одним из ключевых аспектов является сложность способа. Что необходимый уровень знаний для техники? Хемометрические анализы, например, требуют специальных навыков для построения, оценки и поддержания прогнозных моделей. Стандартные методы демонстрируют нежелательные действия подготовительного или анализа данных, или использовать токсичные реагенты. Разработка моделей представляет собой непрерывный процесс, где новые данные включены модели с течением времени, чтобы увеличить устойчивость модели. Еще considчества является экономия средств и снижение экспериментальные раз анализ предложенных методов с высокой пропускной. Если метод достаточно быстрый, но очень дорого, она не может быть целесообразным методом для многих лабораторий принять. Методы, представленные в этой рукописи варианты стандартных методов, модифицированных для усиления возможности производительности. Эти протоколы количественного измерения биомассы черты интерес, без необходимости разработки прогнозных моделей. Это является ключевым атрибутом этих методов, так как методы прогнозирования, в то время как выставляется сильные корреляции со стандартной анализ используется для разработки модели, не так точны, как на самом деле измерения количества интерес для образцов. В то время как методы, используемые в основном сократили версии стандартных ходе лабораторных аналитических методов, точность и точность торгуются на скорость и пропускную способность. Главным образом, этот результат за счет более высоких ошибок в малом объеме пипетки и взвешивания; а также увеличение сдостаточно неоднородность как размер выборки уменьшается. В то время как большие наборы образцов могут быть подвергнуты скринингу и по сравнению, большое внимание должно быть осуществлено при сравнении между отдельными кампаниями и в ходе лабораторных результатов.

Самые трудоемкие шаги включают физические манипуляции биомассы. Шлифовальные образцы может занять несколько минут за образец, в том числе очистки из мельницы между пробами. Вручную погрузка, разгрузка, и моющие Дозаторы и наполнения и опорожнения чайные пакетики и примеры сумки тоже очень трудоемкий. Хотя каждый шаг может занять минуту или больше, делая тысячи образцов может занять несколько часов или даже дней. Роботы могут загрузить типичный реактор тарелку с биомассой в 3 до 4 часов или от 6 до 8 пластин день -1 -1 робота. Эта ситуация зависит от параметров, используемых точности, а также от типа и количества биомассы для тестирования. Заполнение реактора пластины водой, разбавленной кислотой, или фермент быстро сделано с использованием жидкого обслуживание робота. РРегенерация стека пластины (от 1 до 20 реакторов пластин) занимает от 1 до 3 ч, когда монтаж, охладить и демонтаж входит в стоимость. Фермент гидролиза занимает 3 дня и анализ сахара требует около 1 часа времени подготовительной плюс 10 мин на пластины реактора для завершения анализа и чтения результатов. Еженедельный график, установленных предварительной обработки и анализа дней вмещает разумный график работы, сводя к минимуму нечетным час и в выходные дни усилия для человеческого компонента анализа и позволяет для обработки ~ 800 до 1000 проб в неделю на постоянной основе. Максимальная пропускная зависит от нескольких факторов, в основном, сколько аппаратных средств (роботы, реакторы плиты и т.д.) и сколько "обеспечение" (т.е., штатное расписание) доступны, чтобы сделать ручной работы. Практическое верхний предел от 2500 до 3000 выборок / неделю; однако, что выход требует 7 дней в неделю операции и несколько студентов-стажеров и технических специалистов. Для сравнения, 3000 образцов по ВЭЖХ потребует примерно 125 дней СэмаPLE анализ плюс дополнительная рабочая вручную весом образцы в реакторах и образцов фильтрующих до анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Определение 1. Высокая пропускная способность глюкозы и ксилозы Доходность следующие ферментные осахаривания 9,29

  1. Подготовка образцов (шлифовка, Де-крахмальные, Добыча, предварительная обработка)
    1. Измельчите по крайней мере, 300 мг каждого образца биомассы с использованием мельницы Wiley, так что частицы проходят через 20 меш (850 мкм). Трансфер в антистатические молнии топ сумки (обычно со штрих-кодом) и запись выборочная информация в базе данных штрих-кода.
    2. Добавьте примерно 250 мг или больше первом биомассы из антистатический пакет для пронумерованной (с карандашом, не использовать чернила или маркера) чай-мешок, тщательно свернуть пакетики, будучи уверенным, чтобы сложить концы на биомассе для предотвращения потери при де-крахмальные и добычи.
    3. Оберните пакетик закрыт с помощью олова покрытием медного провода. Запишите номер чайного пакетика для каждого Barcoded образца.
    4. Приготовьте де-крахмаления энзимного раствора с коммерческими ферментов (обычно 0,25% (об / об) глюкоамилазы (~ 1600 AGU / л) и1,5% (об / об) альфа-амилаза (~ 2,900 КНУ-S / L) в 0,1 М ацетата натрия (рН 5,0)). Подготовка 16 мл на г биомассы объемной или 500 мл на 120 выборок пакетик. Примечание: Нагрузки, способные удалять крахмала из подземной биомассы должны быть определены эмпирически путем проверки на крахмале после расщепления с диапазоном ферментных нагрузок и коэффициентов.
    5. В пластиковом контейнере, добавить 16 мл раствора де-крахмаления фермента на 1 г биомассы объемной земли. Для протокола де-крахмальные пакетном добавить 120 пакетики к 500 мл буферного раствора фермента-.
    6. Инкубируют в шейкере при 55 ° С в течение 24 (± 4) ч при 120 оборотах в минуту, чтобы удалить возможные крахмал.
    7. После де-подкрахмаливания инкубации, промыть и замочить биомассы в нескольких литров деионизированной воды в течение 30 мин. Повторите этот процесс еще два раза, чтобы удалить буферные соли, которые могут вызвать натыкаясь (образование пузырьков газа в растворе, которые могут привести к внезапной и жестокой повышением уровня раствора, в результате чего горячая жидкость этанол в каскадиз реакционного сосуда) во время экстракции.
    8. После исчерпывающего промывания биомассы де-накрахмаленные, разместить пакетики в колонке Сокслета для извлечения. Нет наперсток не требуется для этого шага.
    9. Настройка рефлюкс Сокслета, используя 95% этанола и извлечь образцы в течение 24 часов.
    10. Удалить пакетики из реактора Сокслета и распространено в один слой на плоской пластине.
    11. Разрешить образцы высохнуть в течение ночи при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
    12. Разверните пакетики и вернуться высушенного биомассы с оригинальными со штрих антистатические пакеты.
      Примечание: антистатические пакеты работоспособны при снижении статического электричества в биомассе, улучшению характеристики управляемости. При использовании других вариантов хранения, дополнительное биомассы могут быть необходимы в связи с биомассы цепляется за сторону контейнера для хранения.
    13. Передача по меньшей мере, 50 мг высушенного биомассы в бункер Barcoded (с использованием большего количества материала лучше для точного дозирования). Sможет штрих анти-мешках и приемного бункера, чтобы обеспечить точное отслеживание образца.
    14. Загрузка бункеров на твердые весом робота, обращая особое внимание на порядок образцов в стойках. Загрузите достаточно реакторных пластин содержат все образцы и выбрать протокол для выдачи в зависимости от количества пластин, используемых.
    15. Робота весят 5 мг высушенных образцов (± 0,3 мг) в нержавеющей стали 96-луночных планшетах кислотостойких. Взвесить 3 повтора каждого образца, распределенных вокруг пластины, чтобы минимизировать любые локальные вариации.
    16. Включите 8 контрольных образцов биомассы хорошо характеризуется стандартного материала биомассы в целях отслеживания производительности анализа. Для нескольких пластин, использование нескольких стандартных бункеров биомассы позволит свести к минимуму смещение размера частиц, вызванное просеивания в бункерах в течение многократных циклов дозирования.
      Примечание: В каждой пластине, должно быть 24 образцов с 3 повторами, 4 заготовок, состоящих из деионизированной воды и фермента, а также 8 ControLs, с использованием ранее характеризуется стандартной биомассы. В 3 угловые скважин каждого из 4-х углов пластины зарезервированы для стандартов сахара.
    17. Проверьте пустые и сахара стандартных скважин для странствующих частиц биомассы и удалить, если присутствует.
    18. Добавить 250 мкл деионизованной воды в каждую лунку, и запечатать пластины с силиконовый клей покрытием политетрафторэтилен (ПТФЭ) лентой.
    19. Использование "наконечник 1/8 паяльник, проколоть PTFE ленты в каждом порту пара (117 всего) для каждой пластины. Используйте пустую тарелку друг на закрытой реактора пластины в качестве направляющей и ограничить движение PTFE пленки.
    20. Зажмите пластины плотно с 0,031 "толстых стеклянных ПТФЭ прокладки (предварительно пробитыми отверстиями для пара портов) между пластинами и пустые тарелки на верхней и нижней части стека. Предварительной обработки образцов с помощью паровой реактор установлен на 180 ° C в течение 17,5 мин, или других комбинаций температуры / времени на основе желаемой степени тяжести.
    21. Охлаждение реактора пластины до 50 °С наводнением с деионизированной водой.
  2. Ферментативный Осахаривание
    1. Подготовка ферментативной осахаривания раствор, состоящий из 8% (об / об) раствора фермента в 1,0 М цитрат натрия, рН 5,0. Подготовка 5 мл на пластину реактора. Примечание: Разбавление необходимо должны быть определены на основе активности и белкового содержимого конкретного решения Stock фермента.
    2. Когда пластины прохладно, центрифуги их в роторе ковша поворотной в 1500 мкг в течение 20 мин. Удалить уплотнение фильм. Примечание: Эти пластины тяжелые и характеристики центрифуги должны быть проверены на совместимость.
    3. Добавить 40 мкл 8% раствора фермента в каждую лунку (70 мг фермента на г биомассы).
    4. Reseal с новым PTFE ленты. Поместите запечатанный пластину в магнитном зажиме пластины.
    5. Осторожно смешивать образцы от инверсии (по крайней мере, в 15 раз), и инкубируют при 50 ° С в течение 70 ч.
    6. Когда осахаривания заключил, перемешать инверсии и центрифуги пластины на 1500 хг в течение 20 мин.
  3. Сахар Анализ
    1. Подготовка комплекта 6 глюкозы и ксилозы в сочетании калибровочных стандартов в 0,014 М цитратном буфере (рН 5,0) в диапазоне от 0 до 0,750 мг / мл (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 и 0,75 мг / мл рекомендуется) и от 0 до 0,600 мг / мл (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 и 0,6 мг / мл рекомендуется) для глюкозы и ксилозы, соответственно.
    2. Подготовка глюкозооксидазного / пероксидазы (GOPOD) и ксилоза дегидрогеназы (XDH) реагенты в соответствии с инструкциями в комплекте.
    3. С помощью пипетки, удалить 200 мкл жидкости из угловых скважин 4 и краевых скважин, примыкающих к угловых скважин (12 Всего скважины) реактора пластины.
    4. С помощью пипетки, обойтись 180 мкл деионизированной воды на каждую лунку 96-луночного полистирольного плоским дном разбавления пластины. Не добавляйте воду в 12 сахарных стандартных и угловых скважин (удалить эти советы при использовании голову 96-канальный).
    5. С помощью пипетки, обойтись 180 мкл реагента GOPOD в каждую лунку анализа глюкозы плел.
    6. С помощью пипетки, обойтись 180 мкл реагента XDH в каждую лунку в планшете для анализа ксилозы.
    7. С помощью пипетки, передавать 20 мкл аликвоты гидролизата из реактора 96-луночного планшета в смесительный пластины. Пипеткой с верхнего участка скважин, чтобы избежать твердых частиц биомассы и остаточную жидкость угловых скважин. Смешайте растиранием в течение не менее 10 циклов.
    8. С помощью пипетки, передавать 110 мкл стандартов сахара, в двух экземплярах, на угловых скважин разбавления пластины.
    9. С помощью пипетки, передавать 20 мкл аликвоты из разведения пластины к глюкозы и ксилозы анализа пластин. Смешайте растиранием.
    10. Инкубируйте глюкозы и ксилозы Планшеты при комнатной температуре в течение 30 мин. Осторожно разорвать любые поверхностные пузыри, прежде чем читать. Тепловой пистолет кратко прошел по поверхности пластины хорошо работает.
    11. Использование ультрафиолетового / видимый 96-а планшетов, установите измеренное волны 510 нм, чтобы записать и абсорбцию против холостой пробы.Это измерение контролирует образование quinonimine, которое пропорционально концентрации глюкозы. Концентрацию глюкозы рассчитывается по калибровочной кривой, основанной на стандартах калибровки, полученных в 1.3.1.
    12. Использование ультрафиолетового / видимый 96-луночный планшет-ридер, установить измеренную длину волны 340 нм и записать поглощение. Это измерение контролирует снижение NAD + к NADH, которое пропорционально концентрации ксилозы. Концентрация ксилозы рассчитывают по калибровочной кривой на основе калибровочных стандартов, подготовленных в 1.3.1.

Определение 2. Высокая пропускная способность Общая лигнина и лигнина мономерных звеньев, используя pyMBMS 28

  1. Базовые приготовления
    1. Измельчить и извлечь биомассы, используя методы, описанные в шагах 1.1.1, 1.1.6-1.1.8 и. Это включает в себя измельчение и извлечение из набора стандартов для использования в качестве экспериментальных управления.
      Примечание: pyMBMS измЗЛЫ не размера частиц зависит, так что если только с помощью протокола pyMBMS, подготовка биомассы должны проводиться, чтобы образец, чтобы соответствовать в держатель образца, <4 мм.
    2. С помощью небольшой лопаточки Отказаться примерно 4 мг (3 до 5 мг предпочтительнее) подготовленной биомассы в 80 мкл чашки из нержавеющей стали предназначен для автоматического пробоотборника.
    3. Убедитесь, что по крайней мере 10% из анализируемых образцов стандарты управления, такие как те, которые доступны из Национального института стандартов и технологий (сахарного тростника жома-8491; тополя 8492; сосна 8493, или пшеничной соломы, 8494). Стандарт также может быть любой вид, аналогичные анализируемых образцов, которые уже были охарактеризованы с помощью стандартных методов.
    4. Случайно загрузить образцы в авто-сэмплер чашках, с использованием пинцет, чтобы избежать ошибок, связанных с возможным спектрометра дрейфа с течением времени. Примечание: Типичный рандомизации проб будет включать измерение всех образцов один раз, а затем повторного рандомизациипорядка образцов для измерения дубликата. Рандомизации программы доступны в Интернете.
    5. Используя стандартный перфорации, вручную производят диски стеклянный фильтр с типа А / Д стекловолокна листов, без связующего. Держите круглый стекловолокна фильтр с помощью пинцета, центр его на чашку для образца, и нажмите на образце с помощью 3.5 мм Allen ключ, чтобы ограничить материал в каждой чашке во время эксперимента.
  2. Инструментальная протокол
    1. Калибровка масс-спектрометра с использованием известного стандарт, интенсивности пиков во всем диапазоне соединений, которые могут существовать для экспериментальных образцов. Для типичных образцов биомассы, использовать перфтортрибутиламин (PFTBA).
    2. Установите расход газа гелия несущей к 0,9 л / мин, используя газовый расходомер.
    3. Установка автоматического пробоотборника печи до температуры пиролиза 500 ° С и температурой интерфейса до 350 ° С с использованием программного обеспечения автоматического пробоотборника. Примечание: 1/8 "из нержавеющей стали нагревалилинии передачи, завернутые в нагревательной ленты, которая соединяет автоматической пипетки на масс-спектрометре управляется с помощью контроллера тепла при 250 ° С.
    4. Начните сбор данных на масс-спектрометре и подождите не менее 60 секунд, чтобы получить достаточные данные для сбора фоне спектров.
    5. Начните автоматизированный метод автоматического сэмплера с спецификациями 2.2.2. Примечание: На авто-сэмплер падает каждый образец индивидуально в авто-сэмплер печи. Общее время сбора данных примерно 1,5 мин; Однако, пиролиз типичного 4 мг образца завершается через 30 сек.
    6. Запись общее содержание ионов (TIC) каждого образца с использованием средств массовой программное обеспечение спектрометра при скорости сканирования 0,5 сек. Запись интенсивности между м / г от 30 до 450.
      Примечание: Типичные соединения биомассы использовать мягкую ионизацию на 17 эВ. Прибор может записывать большие интервалы из м / г от 1 до 1000; Однако, скорость сканирования будет ограничена мощностью процессора компьютера.
    7. Удалить фон из спектров с помощью маNual повышения функцию в программном обеспечении. Примечание: Часть 60 сканирование базовой в начале сбора данных используется для расчета среднего значения фона. Это среднее спектры фон удаляется из экспериментальных спектров образца автоматически программным обеспечением масс-спектрометра.
    8. Импорт единый текстовый файл, созданный столбец массовой программного обеспечения спектрометра, содержащей спектральные данные для каждого образца, в базе данных программы и объединить все образцы в одной базе данных. Добавить применимое метаданные таблицы. Импорт данных в формате с (таблица / CSV-файл) в статистическом пакете программного обеспечения и означает нормализации спектров для учета изменения в пиролизованного массы образцов.
    9. Использование статистического пакета программного обеспечения для выполнения анализа главных компонент (РСА) с использованием спектральных данных для анализа группировку реплицированных стандартных образцов, используемых при измерениях, а также оценить какие пики являются неотъемлемой частью классификации химическихсоединения в нагрузках участок 28.
      Примечание: PCA группы образцов, основанных на сходстве их спектров, и позволяет проверка стандартов для оценки погрешности эксперимента из-за приборной дрейфа во время бега.
    10. Для расчета лигнина сирингиловых (S) / guaiacyl (G) отношение, суммировать районах S пиков (м / Z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 и 210) и разделить на сумму G пиков при 124, 137, 138, 150, 164, 178 и.
    11. Чтобы вычислить общее содержание лигнина, сумма лигнина пики с м / Z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 210 и.
    12. Рассчитать поправочный коэффициент для масштабирования измерения pyMBMS стандартному способу для оценки общего лигнин, таких как Класона лигнина. Разделите значение лигнина Класона индивидуального стандарта на общее содержание лигнина, измеренного для этого стандартного образца с использованием pyMBMS.
    13. Примените этот поправочный коэффициент для всех видов как-в наборе данных. Повторите для каждого вида биомассы анализируемого. NOTE: Поправочный коэффициент может существенно различаться в зависимости от S / G биомассы анализируемого.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Комбинированный эффект термохимической предварительной обработки и последующего ферментативного осахаривания измеряется как функция массы глюкозы и ксилозы, опубликованном в конце анализа. Результаты представлены в терминах мг глюкозы и ксилозы, опубликованным на грамм биомассы. Это резко контрастирует с данными из ходе лабораторных анализов, которые, как правило, сообщается как процент теоретического на основе анализа состава исходного материала. Как это еще не практично, чтобы провести анализ состава на тысячи образцо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ключевые шаги пробоподготовки для получения точной и воспроизводимых данных при проведении высокой пропускной скрининг экспериментов таковы:

Сахар-релиз анализа:

В общем, Образцы готовят в большом диапазоне от нескольких десятков до нескольких тысяч одновременно. Каждый крупный шаг, как правило, осуществляется для всех образцов перед движется вперед с целью минимизации вариаций в подготовке между образцами. Де-крахмальные изначально не было частью протокола и мог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить стажера Эвелин фон Нейда, которая предоставила первостепенные идеи относительно подготовки образцов биомассы для обоих высокопроизводительных трубопроводов, обсуждаемых в этой рукописи. Поддержку в разработке данной работы и рукописи оказал Научный центр биоэнергетики. Научный центр биоэнергетики — это исследовательский центр биоэнергетики Министерства энергетики США, поддерживаемый Управлением биологических и экологических исследований Управления науки Министерства энергетики США. Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии (NREL) является национальной лабораторией Управления по энергоэффективности и возобновляемым источникам энергии Министерства энергетики США, управляемой для Министерства энергетики США Альянсом за устойчивую энергетику, LLC. Эта работа была поддержана Министерством энергетики США по контракту No. DE-AC36-08-GO28308 с Национальной лабораторией возобновляемых источников энергии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Автоматизированная рабочая станция Biomek FXBeckman CoulterBiomek FXАвтоматизированный обработчик жидкостей
Wiley millThomas Scientific3375E15 (модель 4), или 3383L20 (мини-мельница)
антистатические мешкиMinigrip*MGST4P025032,5x3", несколько поставщиков доступны
медная проволока с луженым покрытиемMcMaster-Carr8871K84диаметр 0,016", пакетики
чаяHerbcopress n' brew3,5x5 дюймов
глюкоамилазаNovozymesSpirizyme Fuel 
альфа-амилазаNovozymesLiquozyme SC DS
ацетат натрия тригидратлюбой поставщикреагентов класс
уксусной кислотылюбой поставщикреагент класс
190 proof (95%) этаноллюбой поставщикреагент класс
бункерыFreeslate
96- well C-276 Пластины Hastelloy AspenMachining (Лафайетт, Колорадо)Н/Д (изготовлен по индивидуальному заказу)
1/8" жало паяльникаSears
силиконовая клейкая тефлоновая лента3M51803" ширина (36 ярдов рулонов)
ферментный растворNovozymesCellic CTec2
моногидрат лимонной кислотылюбой поставщик
тринатрия цитрат дигидратлюбой химический поставщик
одноразовый, полистирольный 96-луночный планшетGreiner Bio-One655101или эквивалент; доступно несколько поставщиков
глюкозооксидазы/пероксидазы MegazymeK-GlucMegazyme D-глюкоза набор для анализа
ксилозы дегидрогеназаMegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose набор для
анализа глюкозы стандартный растворMegazymeK-GlucMegazyme D-глюкозный набор
стандартный раствор для ксилозыK-XyloseMegazyme D-xylose набор
для анализа образцов из нержавеющей сталиFrontier LaboratoriesPY1-EC80F
листы стекловолокнаPall662278x10 дюймов; круги перфорированы стандартным дыроколом
Сахарный тростник Багассе Цельная биомасса СырьеNIST8491
Восточное хлопковое дерево (тополь) Цельная биомасса СырьеNIST8492
Сосна Монтерей Цельная биомасса СырьеNIST8493
Пшеница Сырье для цельной биомассы соломыNIST8494
для химиката химикатов химикатов

Ссылки

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи