Методическая статья

Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

DOI:

10.3791/53164

⸱

29 декабря 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол для создания инфекционной бактериальной искусственной хромосомы, содержащей полноразмерную кДНК геномной РНК с положительной цепью вируса японского энцефалита. Этот протокол может быть использован для создания функциональной кДНК других вирусов с положительной цепью РНК, что делает его мощным геномным инструментом для изучения биологии вирусов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обратная генетика, подход к спасению инфекционного вируса полностью из клонированной кДНК, произвел революцию в области вирусов с положительной цепью РНК, чьи геномы имеют ту же полярность, что и клеточная мРНК. Система обратной генетики на основе кДНК является основополагающим методом, который позволяет напрямую манипулировать вирусной геномной РНК, тем самым создавая рекомбинантные вирусы для молекулярных и генетических исследований как элементов вирусной РНК, так и продуктов генов в вирусной репликации и патогенезе. Он также предоставляет ценную платформу, которая позволяет разрабатывать генетически определенные вакцины и вирусные векторы для доставки чужеродных генов. Однако для многих вирусов с положительной цепью РНК, таких как вирус японского энцефалита (ЯЭ), клонированные кДНК нестабильны, что представляет собой серьезное препятствие для построения и размножения функциональной кДНК. В настоящем отчете описываются стратегические соображения по созданию и амплификации генетически стабильной полноразмерной инфекционной кЭГ ЯЭ в виде бактериальной искусственной хромосомы (БАК) с использованием следующих общих экспериментальных процедур: выделение вирусной РНК, синтез кДНК, субклонирование и модификация кДНК, сборка полноразмерной кДНК, линеаризация кДНК, in vitro Синтез РНК и восстановление вирусов. В настоящем протоколе изложена общая методология, применимая к клонированию полноразмерной кДНК для ряда вирусов с положительной цепью РНК, особенно с длиной генома >10 тыс. т..н., в вектор BAC, из которого инфекционные РНК могут быть транскрибированы in vitro с помощью бактериофагической РНК-полимеразы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК вирусологи, появление технологии рекомбинантной ДНК в конце 1970-х годов стало возможным преобразовать вирусной РНК геномы в кДНК-клонов, которые затем могут быть размножены в плазмид в бактерии для генетической манипуляции РНК-содержащих вирусов. 1 Первый РНК-вирус, чтобы быть молекулярно клонировали был бактериофага Qβ, положительно нити РНК вируса, который заражает кишечной палочки. Плазмиду, содержащую полную копию кДНК геномной РНК Qβ привело к инфекционным фагов Qβ, когда вводят его в Е. палочка. 2 Вскоре после этого, этот метод был применен к полиовируса, положительно нити РНК вируса человека и животных. Плазмида несущий полноразмерной кДНК полиовируса геномной РНК инфекционное при трансфекции в клетки млекопитающих и способны производить инфекционных вирионов 3 В этом "ДНК-запущен" подход, клонированные кДНК следует транскрипции внутри клетки, чтобы инициировать репликацию вируса РНК.Однако неясно, насколько транскрипция инициируется и как транскрипты обработаны для правильной последовательности вирусной. Эта проблема привела к развитию альтернативы "РНК-запущен" подход, при котором полная копия кДНК вирусного генома РНК клонируют под промотором распознается Е. палочка или РНК-полимераза фага для производства синтетических РНК в пробирке с определенной 5 'и 3' концах, которые подвергаются полный цикл репликации вируса при введении в клетки-хозяева. 4,5 Первый успех с этим подходом было сообщено для костра вируса мозаики , 6,7-положительная нить РНК вируса растений. С тех пор, РНК-запущен подход был разработан для широкого круга положительной цепь РНК вирусов, в том числе, калицивирусов альфавирусов, флавивирусов, arteriviruses и коронавирусов. 1,4,5,8

В обоих ДНК- и РНК-запустила систем обратного генетики, строительство FULL-кДНК клона является ключом к генерации инфекционного ДНК или РНК из положительной нити РНК-содержащих вирусов, но становится значительным технической задачей, так как размер вирусных геномных увеличивается. 9-17 В частности, большое РНК генома ~ 10 -32 кб представлены три основные препятствия на пути клонирования полноразмерной кДНК функциональной. 18 Первая трудность является синтез верный кДНК копировать, так как верность RT-PCR обратно пропорциональна длине вирусной РНК. Второе препятствие является наличие потенциально токсичных последовательностей, так как длинные молекулы РНК, скорее всего, содержит неожиданные последовательности, способные сделать фрагмент кДНК в плазмидах нестабильных в E. палочка. Третий и наиболее важным вопросом является наличие подходящего вектора, поскольку трудно найти клонирования вектор, который может доме вирусной кДНК вставку> 10 кб. За последние три десятилетия, эти барьеры были преодолены несколько достижений в энзимологии, методология, А.Н.д vectorology. 1,4,5,8 Из них наиболее перспективным и инновационное развитие является клонирование больших положительно цепь РНК вирусов, как инфекционных бактериальных хромосом (искусственные Бач). Вектор ВАС является низкой копию клонирование плазмиду (1-2 копий / клетку) на основе Е. палочка фактором фертильности, со средним размером вставки ДНК ~ 120-350 кб 19-21 Фрагмент ДНК встраивали в вектор BAC в аналогично клонирования в общих векторов клонирования. в результате ВАС клоны стабильно на протяжении многих поколений в E. палочка. 22,23 На сегодняшний день, технология ВАС были использованы для создания инфекционных клонов кДНК для> 10 членов трех положительно нити РНК вируса семей, т.е. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 и Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32

Использование японской энцефалита (Jev) в качестве примера, данная работа сообщает подробные процедуры, которые могут бытьиспользуется для построения стабильного генетически полнометражный инфекционного BAC для различных положительной нити РНК-вирусов. JEV является зоонозных флавивирус 33, который передается в природе между птицами, свиньями и другими позвоночных хозяев по комарами-переносчиками. 34,35 В людях, JEV инфекция может вызвать суровый часто роковую неврологические заболевания японский энцефалит (ЯЭ), 36 который происходит в Азия и части западной части Тихого океана, 37,38 по оценкам ежегодной заболеваемости ~ 50,000-175,000 клинических случаев. 39,40 В геноме JEV является ~ 11 т.п.н., одноцепочечной, положительным смысле молекулы РНК и состоит из один открытая рамка считывания (ORF), в окружении двух некодирующих областей (NCRs) на 5 'и 3' концы. 41,42 ОРС кодирует полипротеин, который расщепляется хостом и вирусных протеаз, чтобы генерировать 10 отдельных белков, обозначенный С PRM, Е, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5 в N- к С-концевой направлении. 34,43,44 Кроме того, электроннаяXtended форма NS1 (NS1 ") выражается -1 рибосомальной frameshifting на кодонов 8-9 из NS2A. 45,46 Из этих 11 белков, три структурные белки (С, PRM и E) имеют важное значение для формирования инфекционного вирионы, 47,48 и остальные восемь неструктурные белки (NS1, чтобы NS5, и NS1 ") имеют решающее значение для репликации вируса РНК, сборку 49-51 частиц, 52-56 и врожденной уклонения иммунитета. 57-59 Оба 5'- и 3' "NCRs содержат сохраняется первичных последовательностей и форма РНК вторичных / третичных структур, 60-62, которые важны для модуляции вирусной репликации РНК. 63,64

Этот протокол описывает инструменты, методы и стратегии для создания полной длины инфекционное ВАС от JEV SA 14 -14-2. 28 Этот функциональный ВАС-клон содержит полную копию кДНК геномной РНК JEV, 65, который охватывается промоутер для SP6 РНК-полимеразы передвирусного 5'-конце и уникальный Xba I сайта рестрикции вниз по течению от вирусной 3'-конце для в пробирке стоки транскрипции. Эта технология ВАС применимо к построения полнофункциональной кДНК клона молекул для массива положительно нити РНК-вирусов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: На рисунке 1 представлена ​​стратегия строительства полной длины инфекционное JEV кДНК как BAC 28 Таблица 1 содержит список олигонуклеотидов, используемых в этом протоколе 28..

1. Выписка вирусную РНК из JEV частиц в надосадочной жидкости культуры клеток

  1. Начните с сотового культуральной среде, содержащей Jev SA 14 -14-2, живой вирус вакцины JE, который требует уровень биобезопасности 2 сдерживания.
    Примечание: Титр вируса приблизительно 1-3 × 10 6 бляшкообразующих единиц / мл.
  2. Возьмите необходимую подготовку в области биобезопасности для всех стандартных микробиологических методов, техники безопасности и лабораторного оборудования до работы с JEV SA 14 -14-2.
  3. Очищают вирусную РНК из аликвоты вируса, содержащего клеточной культуральной среды с использованием монофазный раствор фенола и гуанидинизотиоцианата 66 (фиг.1А).
    1. Объявлениеd 600 мкл реагента однофазной к 200 мкл супернатанта культуры в 1,7 мл микропробирки. Гомогенизации смеси путем рукопожатий трубку энергично в течение 30 сек и инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Добавить 160 мкл хлороформа в гомогенизированной пробы. Тщательно перемешать с помощью рукопожатий трубку энергично в течение 15 сек и оставить его в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
    3. Центрифуга общее лизата на 13400 х г в течение 15 мин при 4 ° С, что приводит к разделению двух жидких фаз, т.е. нижней органическую фазу и верхнюю водную фазу. Передача верхнюю водную фазу (менее 200 мкл), содержащий РНК к новому микропробирки.
    4. Осадок РНК добавлением 1 мкл 5 мкг / мкл гликогена и 400 мкл 100% изопропанола и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Центрифуга смеси при 13400 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и мыть гранул РНК в 1 мл 75% этанола импульсного встряхиванием трех до пятираза и центрифугированием при 13400 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    6. Высушите РНК гранул в течение 10 мин и растворить его в 40 мкл ЦТ 2 O. Сохранить извлеченный РНК при температуре -80 ° С до использования.

2. Обобщить набор из четырех перекрывающихся фрагментов кДНК (F1-F4), охватывающий всю геномной РНК вируса путем обратной транскрипции (ОТ) -PCR

  1. Выполнение реакции 20 мкл RT с 10 мкл аликвоты очищенного вирусной РНК в качестве матрицы и модифицированной формы вируса мышиного лейкоза Молони обратной транскриптазы. 67
    1. Настройка 13 мкл смеси, содержащей 10 мкл очищенного РНК, 1 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 4 пмоль / мкл праймера и 1 мкл дН 2 O. Используйте грунтовку фрагмент конкретных для каждой реакции РТ: 1RT для F1, F2 для 2RT, 3RT для F3, и 4RT для F4.
    2. Выдержите смесь при температуре 65 ° С в течение 5 мин, место на льду в течение 1 мин, а затем быстро собирать спин КонтеНТС в нижней части трубы.
    3. Добавить 4 мкл 5 × RT буфера, 1 мкл 0,1 М DTT, 1 мкл 40 ед / мкл РНКазы ингибитор, и 1 мкл 200 U / мкл обратной транскриптазы. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз три-пять раз.
    4. Пусть реакция протекает при 50 ° С в течение 1 ч, затем термически инактивации образца при 70 ° С в течение 15 мин. Хранить синтезированного первого нити кДНК при температуре -20 ° С до использования.
  2. Выполнение реакции 100 мкл ПЦР с 5 мкл аликвоты инактивированной нагреванием реакции RT в качестве матрицы и с высокой точностью полимеразы термостабильных ДНК-68 (Фиг.1В).
    1. Настройка 100 мкл ПЦР-реакцию на льду в, содержащий 5 мкл реакционной RT, 20 мкл 5 х буфер для ПЦР, 4 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 5 мкл 10 мкМ прямого праймера, 5 мкл 10 мкМ обратного праймера, 1 мкл 2 U / мкл ДНК-полимераза, и 60 мкл дН 2 О. Используйте пару праймеров фрагментов конкретных для каждого ПЦР reactioн: 1F + 1R для F1 (2573 б.п.), 2F + 2R для F2 (4171 б.п.), 3F + 3R для F3 (3922 б.п.) и 4F + 4R по F4 (1798 б.п.).
    2. Осторожно перемешать с помощью пальцев, щелкая трубки трех до пяти раз и центрифуги кратко собрать содержимое на дне.
    3. Начало термоциклирования с начальной стадии денатурации 30 секунд при 98 ° С, с последующим 25-30 циклов со следующими профиль ПЦР: 10 сек при 98 ° С, 30 сек при 60 ° С, и 1-2 мин (30 сек / кб) при 72 ° С. Хранить продукты ПЦР при 4 ° С до анализа.
  3. Запуск 2-5 мкл аликвоты каждой реакции ПЦР в 0,8% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг / мл этидий бромид (EtBr) (рисунок 2).
    ВНИМАНИЕ: EtBr является мощным мутагенным и требует халатах, защитные очки и перчатки, чтобы носиться и крайнюю осторожность необходимо соблюдать при его использовании, хранении и утилизации.

3. субклон Каждый из четырех фрагментов кДНК (F1-F4) в ВАС Вектор Создать PBAC / F1 до F4 PBAC / бМетоды у Молекулярное клонирование

  1. Дайджест вектор и ДНК-вставки с двумя соответствующими эндонуклеазами рестрикции, а именно:
    1. Выполните последовательный пищеварение PBAC / РРСС / FL (вектор), 30 производное плазмиды pBeloBAC11 (7507 б.п., GenBank, инвентарный номер U51113), с PME I и я не в общем объеме 60 мкл (содержащий ~ 500 нг ДНК , 10 ед фермента, 1x буфера пищеварения, и 1 × БСА) при 37 ° С в течение 12-15 ч, что дает в 15426-фрагмент вектора.
    2. Выполнение последовательного переваривания каждого из четырех ампликонов кДНК (вставка) с Sma I и Not I в общем объеме 60 мкл (содержащих ~ 1 мкг ДНК, 20 U фермент, 1 × пищеварения буфера и 1 × БСА) при 25 ° С (Sma I) или 37 ° C (не я) на 12-15 ч, что дает следующие вставки фрагменты нужного размера: F1 (2559 п.н.), F2 (4157 п.н.), F3 (3908 п.н.), и F4 (1784 б.п.).
  2. Очиститьжелаемый вектор и вставки фрагментов ДНК путем экстракции геля.
    1. Отдельные дважды переваренные продукты на 1% низкой температурой плавления агарозном геле, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr. Вырезать полосу нужного фрагмента ДНК с минимальным количеством агарозы (как правило, ~ 200 мкл) при длинноволновом ультрафиолетовом свете.
    2. Добавить равный объем буфера ТЕА (10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, и 10 мМ MgCl 2) в агарозном вырезали в 1,7 мл микропробирки. Инкубируйте образца при 72 ° С в течение 10-15 мин, с вихревым каждые 2-3 мин, пока агарозном полностью не растает.
    3. Добавить равный объем подогретого буферного насыщенный фенолом, вихрь энергично в течение 1 мин, и центрифуге при 13400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Смесь разделяется на более низком органическую фазу и верхнюю водную фазу. Передача верхнюю водную фазу, содержащую ДНК в новую микропробирки.
    4. Добавить равный объем смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24: 1), вихревую в течение 1 мин, и центрифугируют при 13,400 × г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача верхнюю водную фазу на новый микропробирок.
    5. Добавить 0,5 мкл 10 мкг / мкл дрожжевой тРНК, 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объемов 100% этанола. Смесь необходимо хранить на льду в течение 20 мин.
    6. Центрифуга смеси при 13400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и мыть ДНК гранул с 1 мл 70% этанола путем широтно-вортексе трех до пяти раз и центрифугированием при 13400 × г в течение 10 мин.
    7. Высушите ДНК гранул в течение 10 мин и растворить его в 20 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-Cl и 1 мМ ЭДТА [рН 7,6]).
  3. Лигировать нужный вектор и вставки фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы Т4.
    1. Настройка лигирования 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50-100 нг векторной ДНК, а ~ 3-кратный молярный избыток ДНК-вставки, 400 ед ДНК-лигазы Т4 и 1 × буфера для лигирования. Выдержите реакцию лигирования при 16 ° С в течение 12-15 ч.
      Примечание: Включите негативное CONTRРеакция ол, т.е. вектор только без вставки, параллельно.
    2. Выполните четыре отдельных перевязку, каждый вступления в 15426 п.н. Pme I- я не фрагмент PBAC / РРСС / FL с 2559-BP (для F1), 4157-BP (для F2), 3908-BP (для F3), или 1784 п.о. (по F4) Sma I-Not I фрагмента одного из четырех ампликонов кДНК, чтобы генерировать субклоны PBAC / F1, чтобы PBAC / F4.
  4. Преобразование сшита ДНК в E. палочка DH10B по -heat методом ударной CaCl 2.
    1. Возьмем 100 мкл аликвоты CaCl 2 -обработанной компетентным клеткам DH10B 69 хранили при -80 ° С и оттаивать их на льду.
      Примечание: Используйте 100 мкл клеток на преобразования.
    2. Добавить 10 мкл аликвоты реакции лигирования ДНК к 100 мкл размороженных клеток в 1,7 в микропробирки мл, осторожно перемешать, нажав на трубку, и держать на льду в течение 30 мин.
    3. Теплового шока смесь ДНК-клеток в течение 45 сек в 42 ° C ватер ванна, место на льду в течение 2 мин, а затем добавить 900 мкл LB бульоне подогретого до комнатной температуры.
    4. Инкубируйте тепловому шоку клеток при 35 ° С в течение 1 ч, при встряхивании при 225-250 оборотов в минуту.
    5. Распространение от 50 до 200 мкл аликвоты культивируемых клеток на чашках с агаром LB, содержащих 10 мкг / мл хлорамфеникола (CML). Держите пластин при комнатной температуре, правой стороной вверх, пока они не высохнут.
    6. Включите пластины вверх дном и инкубируют при 35 ° С в течение 15 ч.
  5. Восстановление клонированный ВАС-ДНК из клеток-хозяев колоночной основе способа очистки (рис 1С).
    1. Выбор шести до восьми бактериальные колонии от агара LB-CML и инокуляции их в 3 мл 2xYT среды, содержащей 10 мкг / мл CML. Инкубируйте культур при 35 ° С в течение 10 ч при интенсивном помешивании (225-250 оборотов в минуту).
    2. Изолировать рекомбинантный ВАС ДНК из 1-1,5 мл бактериальных культур с использованием спиновых столбцы, как указано производителем. 70 Элюировать извлеченный ДНК (typiски 100-200 нг) в 20 мкл ТЕ-буфера.
    3. Выполнение двух аналитических ограничение ферментами изолированного БАС для ~ 6 ч при общем объеме 10 мкл, один для идентификации присутствия вектора с правильной вставки с использованием тех же ферментов, используемых для клонирования (см протокол 3,1), а другой проверить целостность клонированных БАС с соответствующим ферментом (например, Bgl II, Ncol, или Pst I), которое генерирует уникальный шаблон рестрикционных фрагментов.
    4. Распространить правильно клонированы БАС путем инокуляции 500 мкл положительных бактериальных культур (из протокола 3.5.1) в 500 мл 2xYT-CML среды и культивирование инокулята в течение 6 ч при 35 ° С при встряхивании при 225-250 оборотов в минуту. Очищают ВАС-ДНК (обычно 10-20 мкг) из культуры 500 мл с помощью колонки фильтра, как это рекомендовано производителем. 71
      Примечание: Начальные четыре ВАС субклоны, каждая из которых содержит фрагмент кДНК JEV геномной РНК, может доказать, что имеет наэлектронной или более нежелательных мутаций (ы) по сравнению с консенсусной последовательности вирусного генома (42, которая служит эталонной последовательности). Любая такая мутация должна быть исправлена ​​путем ПЦР-сайт-направленного мутагенеза до сборки полноразмерного JEV кДНК. 27

4. Создайте полнометражных JEV кДНК с 5 'SP6 промоутер и 3' стоки сайт

  1. Сделайте три генетические изменения (см ниже протоколов 4.1.1-4.1.3) в клонированных кДНК, чтобы в пробирке стекающей транскрипцию генома РНК длиной с подлинным 5 'и 3' концах вирусного генома.
    1. Введем SP6 промотора непосредственно перед 5'-концом вирусного генома путем расширения перекрытия ПЦР (рис 1D, PBAC / F1 SP6).
      1. Amplify два перекрывающихся фрагментов ДНК с помощью первого стандартного ПЦР PBAC / F1 с двумя парами праймеров SP6F + SP6R (размер продукта, 173 б.п.) и F1F + F1R (продукт сIZE, 676 п.н.), каждый в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл матричной ДНК (~ 200 пг / мкл), 10 мкл 5 х буфер для ПЦР, 2 мкл 10 мМ дНТФ, 2,5 мкл каждого из 10 мкМ прямого и обратного праймеров, 0,5 мкл 2 Е / мкл ДНК-полимераза, 68 и 31,5 мкл дН 2 О. Выполните ПЦР с использованием следующей профиль велоспорт: 98 ° C в течение 30 сек и 25 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 20 сек.
      2. Гель-очистить два ПЦР-амплифицированных фрагментов ДНК после запуска каждого из двух продуктов ПЦР в 1,5% низкой температурой плавления агарозном геле, как описано в протоколе 3.2.
      3. Предохранитель два фрагмента ДНК очищали на геле с помощью второго синтеза ПЦР с использованием наиболее удаленный праймеров SP6F + F1R (размер продукта, 821 п.н.) в реакции 100 мкл в том числе 1 мкл каждого из двух очищенных фрагментов ДНК (~ 100 пг / мкл), 20 мкл 5 х буфер для ПЦР, 4 мкл 10 мМ дНТФ, 5 мкл каждого из 10 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл2 U / мкл ДНК-полимеразы, 68 и 63 мкл дН 2 О. Используйте следующую тепловой профиль велоспорт: 98 ° C в течение 30 сек, и 25 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек, и 72 ° С в течение 30 сек.
      4. Гель-очистить слитый ПЦР ампликона с 1% низкой температурой плавления агарозном геле, как описано в протоколе 3.2.
      5. Выполните клонирование процедуру пять шагов, описанных в 3,1-3,5 протоколов для лигирования 760 б.п. Pac I-Bsi WI фрагмент геля очищали слитый ПЦР ампликона с 9532-б.п. Pac I-Bsi WI фрагмента PBAC / F1 для получения PBAC / F1 SP6.
    2. Снимите уже существующие, внутренний сайт Xba I в 9131 нуклеотидов путем введения тихий точечную мутацию (A 9134 → T) с помощью расширения перекрытия ПЦР (рис 1D, PBAC / F3 KO).
      1. Amplify два перекрывающихся фрагментов ДНК по первой стандартной ПЦР PBAC / F3 с двумя парами праймеров x1f + X1R(размер продукта, 746 б.п.) и X2F + x2r (размер продукта, 316 б.п.), в реакции 50 мкл при экспериментальных условиях, описанных в Протоколе 4.1.1.1.
      2. Гель-очистить два ПЦР-амплифицированных фрагментов ДНК после электрофоретического разделения на 1,5% агарозном низкой температурой плавления агарозы, как описано в протоколе 3.2.
      3. Предохранитель два фрагмента ДНК очищали на геле с помощью второго слияния ПЦР с использованием праймеров x1f внешние + x2r (размер продукта, 1033 б.п.) в 100 мкл реакции в экспериментальных условиях, описанных в Протоколе 4.1.1.3.
      4. Гель-очистить слитый ПЦР ампликона с 1% низкой температурой плавления агарозном геле, как описано в протоколе 3.2.
      5. Выполните клонирование процедуру пять шагов, описанных в 3.1-3.5 протоколов для лигирования 949 п.н. Avr II-я не фрагмент геля очищали слитый ПЦР ампликона с 16245 п.н. Не I- BSI WI и 2141-BP BSI W I - фрагменты Avr II из PBAC / F3, чтобы произвести PBAC / F3 KO.
    3. Инженер новый искусственный Xba I стоки сайт непосредственно ниже 3'-конца вирусного генома с помощью ПЦР на основе сайт-направленного мутагенеза (рис 1D, PBAC / F4 RO).
      1. Создать один фрагмент ДНК с помощью ПЦР из PBAC / F4 с праймеров ROF + ROR (размер продукта, 324 б.п.) в реакции 100 мкл, содержащих 1 мкл матричной ДНК (~ 200 пг / мкл), 20 мкл 5 × ПЦР буфера, 4 мкл 10 мМ дНТФ, 5 мкл каждого из 10 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл 2 Е / мкл ДНК-полимеразы, 68 и 64 мкл DH 2 О. Выполните ПЦР с использованием следующей профиль велосипедный: 98 ° C в течение 30 сек, и 25 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 15 сек.
      2. Гель-очистить ПЦР-амплифицированного ДНК-фрагмента с 1% низкой температурой плавления агарозном геле, как описано в протоколе 3.2.
      3. Выполните клонирование процедуру пять шагов, описанных в 3,1-3,5 протоколов для лигирования 283-BP SFI I- NOT-фрагмент из геля очищали PCR ампликона с 16933 п.н. Sfi I- я не фрагмент PBAC / F4 для создания PBAC / F4 RO.
  2. Соберите набор из четырех модифицированных, перекрытия кДНК в одну полную длину SA 14 -14-2 ВАС (PBAC / С.А. 14 -14-2) путем присоединения на трех участках естественное ограничение (BSR Г.И., Bam HI, и Ava I ) в последовательном порядке, используя пять шаг клонирования изложенными в 3,1-3,5 протоколов (рис 1E): F1 SP6 → F1 F2 SP6 (путем замены Bsr G I-я не фрагмент PBAC / F1 SP6 с тем из PBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 нокаутом (путем замены Бам Н I-я не фрагмент PBAC / F1 F2 SP6 с тем из PBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (путем замены Ава I- я не фрагмент PBAC / F1 F2 SP6F3 КО с тем из PBAC / F4 RO).

5. Подготовить высокой чистоты Maxi-приготовительные в полнометражном SA 14 -14-2 ВАС

  1. Вырастить одного колонию E. палочка DH10B проведении PBAC / SA 14 -14-2 в 3 мл 2xYT среды, содержащей 10 мкг / мл CML в течение 10 ч при 35 ° С при встряхивании при 225-250 оборотов в минуту, а затем наращивать путем инокуляции 500 мкл 10 ч бактериальная культура в 500 мл 2xYT-CML среды и культивирование инокулята в течение 6 ч при 35 ° С при интенсивном помешивании.
  2. Центрифуга бактериальную культуру в двух 250-мл флаконах в 3,107 × г в течение 15 мин при 4 ° С. Ресуспендируют осадок в каждой 30 мл раствора ГТД (50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-Cl, и 10 мМ ЭДТА [рН 8,0]), а затем добавить 500 мкл 60 мг / мл лизоцима. Инкубируйте два клеточных суспензий на льду в течение 10 мин.
  3. Добавить 60 мл свежеприготовленного раствора для лизиса (0,2 N NaOH и 1% SDS), чтобы каждой клеточной суспензии, также не ясно, перемешать до, и держать лизатовпри комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Добавить 45 мл раствора нейтрализации (100 мл, состоящий из 60 мл 5 М ацетата калия, 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и 28,5 мл дН 2 O) в каждую бутылку, тщательно перемешать путем обращения бутылки, и инкубируют нейтрализованных лизатов на льду в течение 10 мин.
  5. Центрифуга нейтрализованного лизаты в 18,566 г × в течение 20 мин при 4 ° С. Перенести супернатант обеих бутылок в двух новых 250 мл бутылки; добавить 0,6 объема 100% изопропанола друг, и держать их на льду в течение 20 мин.
  6. Спин вниз осадок на 18,566 х г в течение 20 мин при 4 ° С. Растворите каждый шарик в 5 мл ТЕ буфера, объединить их в 50 мл пробирку (всего 10 мл), и осадить РНК добавлением равного объема 5 М хлорида лития. Выдержите смесь на льду в течение 10 мин.
  7. Центрифуга РНК осадок на 14,636 × г в течение 20 мин при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку 250 мл и осаждают ДНК добавлением 2 объемов 100% изопропанола.Выдержите смесь на льду в течение 20 мин.
  8. Спин вниз осадок ДНК в 18,566 г × в течение 20 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант, ресуспендируют осадок ДНК в 9,5 мл ТЕ-буфера (рН 7,6), и добавить 10 г хлорида цезия (CsCl) и 390 мкл 10 мг / мл EtBr.
  9. Загрузите решение ДНК-CsCl-EtBr в 16 × 76 мм герметичный полипропиленовую трубку с помощью шприца, снабженного 18 G иглы. Спин запечатанный CsCl градиент в ультрацентрифуге на 401,700 × г в течение 16 ч при 20 ° С (рис 3).
  10. Собирают группу ДНК плазмиды ВАС от градиента CsCl с использованием 18 г иглу, чтобы создать воздушный клапан в верхней части градиента и 20 г иглы оборудованный шприц для извлечения ДНК ВАС со стороны градиента.
  11. Добавить 2,5 объемами дН 2 O насыщенный бутанол в EtBr окрашенных ВАС образца ДНК и перемешать встряхиванием. Центрифуга смеси при 13400 х г в течение 1 мин и передачи Нижнюю водную фазу к новой 1,7 мл микрофонrotube. Повторите эту процедуру шесть раз.
  12. Осаждения EtBr-свободного ВАС-ДНК путем добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объемов 100% этанола в бутанол экстрагируют ВАС-ДНК и инкубации в течение 10 мин на льду. Центрифуга осадок на 13400 х г в течение 10 мин, промыть осадок ДНК с 1 мл 70% этанола, и снова осадить его центрифугированием.
  13. Высушите ДНК гранул в течение 10 мин и растворить его в 200 мкл ТЕ-буфера (рН 7,6).
    Примечание: На рисунке 4 показан обзор системы обратной генетики для JEV SA 14 -14-2.

6. Расшифруйте Синтетические РНК в пробирке из линеаризованной Полноразмерные JEV ВАС ДНК

  1. Выполните масштабную рестрикции пищеварение PBAC / С.А. 14 -14-2 с Xba I в общем объеме 100 мкл (содержащих 3 мкг ДНК, 60 U фермент, 1 × пищеварения буфера и 1 × BSA) при 37 ° С 12-15 ч. Осмотрите 3 мкл аликвоты DРеакция igestion на 0,8% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr.
  2. Инкубируйте реакции переваривания далее с 25 ед маш-нуклеазы (MBN) при 30 ° С в течение 2 часов (рис 4а).
  3. Принесите объем Xba I расщепленной, MBN-обработанного образца до 300 мкл с дН 2 O. Добавить равный объем фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25: 24: 1) с разведенной пробы вихревые энергично в течение 1 мин, вращение на 13400 х г в течение 10 мин, а затем перенести верхнюю водную фазу на новый 1,7 мл микропробирка. Добавить равный объем хлороформа, и повторить процедуру экстракции.
  4. Восстановление фенол / хлороформ экстрагируют, линеаризованной BAC осаждением этанолом: Добавить 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объемов 100% этанола, и инкубируют на льду в течение 20 мин. Центрифуга осадок на 13400 х г в течение 10 мин, промыть осадок ДНК с 1 мл 70% этанола, а затем вращать ее вниз с помощью повторной центрифугированием.
  5. Высушите ДНК Pelleт в течение 10 мин и растворить его в 30 мкл дН 2 O. Изучить с 1 мкл аликвоты восстановленного BAC на 0,8% агарозном геле с 0,5 мкг / мл EtBr (фиг.5А).
  6. Выполните стоки транскрипции линеаризованной ДНК ВАС в общем объеме 25 мкл (содержащих ~ 200 нг матричной ДНК, 0,8 мм крышка аналоговый [м 7 г (5 ') ррр (5') А], 1 мМ рНТФ, 40 U РНКазы ингибитора, 20 ед SP6 РНК-полимеразы, 72 и 1 × буфера транскрипции) при 37 ° С в течение 1 ч (фиг.4В). Включить 0,5 мкм [3 Н] UTP для количественного определения РНК на основе [3 H] UTP включения, а контроль путем адсорбции на DE-81 фильтровальной бумаги. 69
  7. Запуск 1-2 мкл аликвоты сточной реакции транскрипции на 0,6% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr (рис 5б).

7. Определить РНК инфекционность и выход вируса

  1. Развивайте Клетки ВНК-21 в 150 мм cultuRe блюд при плотности 3 × 10 6 клеток / блюдо для 24 ч при 37 ° С с 5% СО 2.
    Примечание: ведение Клетки ВНК-21 в альфа-минимальной поддерживающей среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, витаминов и пенициллин / стрептомицин.
  2. Промыть клеточный монослой с 10 мл холодного раствора А (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 8,1 мМ Na 2 HPO 4, 1,5 мМ и КН 2 РО 4). Открепления клеток с посуды путем обработки 4 мл трипсина-ЭДТА (0,25%), и собрать их центрифугированием при 270 х г в в настольном центрифуги в течение 2 мин.
  3. Ресуспендируют осадок клеток с 50 мл холодного раствора А в 50 мл коническую пробирку и центрифугируют суспензию клеток при 270 х г в течение 2 мин. Повторите эту процедуру промывания три раза; После последней промывки ресуспендируют осадок клеток при плотности 2 × 10 7 клеток / мл в Соль А.
  4. Смешайте 400 мкл аликвоты суспензии клеток с 2 мкмг синтетической РНК в 2-мм зазор кювету, и оперативно электропорации смесь с электропоратора при оптимальных условиях электропорации: длина 980 В, 99 мкс импульса и 5 импульсов (фиг.4С).
    Примечание: Используйте H-меченой РНК синтезируется в 3 Протокола 6.5 непосредственно для электропорации без дополнительной очистки.
  5. Оставьте электропорации клетки при комнатной температуре в течение 10 мин и переносят в 1,7 мл микропробирки, содержащей 600 мкл полной культуральной среде.
  6. Подготовка 10-кратное серийное разведение электропорации клетки в 1 мл полной культуральной среде и пластины 100 мкл аликвоты каждого разведения на монослоев unelectroporated Клетки ВНК-21 (5 × 10 5) в 6-луночный планшет.
  7. Через 4-6 ч инкубации, наложение клеток с 0,5% агарозы в минимальной поддерживающей среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Инкубируйте пластин в течение 4 дней при 37 ° С с 5% СО 2.
  8. Представьте себе инфекционную центрс (таблички) по фиксации с 7% формальдегида и окрашивания 1% кристаллическим фиолетовым в 5% этанола (27 6А).
    1. Дополнительно: Изучить РНК-электропорации клетки на 18-20 ч после трансфекции для экспрессии белка JEV иммунофлюоресценции анализы 27,73 (рис 6В), и урожай супернатантами из РНК-электропорации клеток в 22 и 40 ч после трансфекции для вируса титрование по налета анализов 27,63 (рис 6в).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для всех положительных нити РНК-содержащих вирусов, надежность и эффективность системы обратной генетики зависит от генетической стабильности клонированного кДНК полной длины, последовательность которого эквивалентна консенсусной последовательности геномной РНК вируса. 27 На рисунке 1 показана пяти- шаг стратегия для строительства полноразмерной кДНК инфекционного как BAC для JEV SA 14 -14-2 28: Шаг 1, очистка вирусной РНК из клеточной культуры супернатанта JEV-инфицированных ВНК-21 клеток (рис 1А); Шаг 2, синтез четырех перекрывающихся ампликонов кДНК (F1-F4), охватывающих весь вирусного генома (рис 1B); Шаг 3, субклонирование каждого из четырех смежных фрагментов кДНК в вектор BAC, создавая PBAC / F1 до F4 PBAC / (рис 1в); Шаг 4, модификация клонированных кДНК для в пробирке стоки транскрипции с РНК-полимеразы SP6, т.е., размещение SP6промоутер последовательности непосредственно перед вирусной 5'-конце (PBAC / F1 SP6), устраняя уже существующие внутренний сайт Xba I в 9131 нуклеотидов путем введения тихий точечную мутацию, А 9134 → T (PBAC / F3 КО) и вставки новый искусственный Xba I стоки сайт непосредственно ниже вирусной 3'-конце (PBAC / F4 RO) (рис 1D); и Шаг 5, сборка полной длины SA 14 -14-2 кДНК ВАС, PBAC / С.А. 14 -14-2 (рис 1E). В таблице 1 приведены олигонуклеотиды, используемые в этой процедуре клонирования. 28

Для строительства функционального JEV кДНК, первым важным шагом является синтез четырех перекрывающихся фрагментов кДНК с использованием очищенного вируса РНК в качестве матрицы для RT-PCR. Рисунок 2 обеспечивает представительство результат для четырех продуктов ОТ-ПЦР, которые электрофорезу на 0,8%агарозном геле. Этот гель наглядно демонстрирует, что полнометражный JEV кДНК усиливается в четырех перекрывающихся фрагментов кДНК. Иногда ОТ-ПЦР реакции может дать один или более дополнительных вирус-специфических или неспецифических продуктов, которые в основном меньше, чем ожидаемого продукта, из-за неспецифического отжига праймеров в течение синтеза кДНК / амплификации. С другой стороны, мало или не ожидается, продукт ОТ-ПЦР будут усилены из-за случайного загрязнения РНКазы при выделении вирусной РНК или ненадлежащее выполнение RT-PCR.

Следующим шагом ключ клонирование и изменение парциальных или полной длины кДНК JEV в BAC, которая является относительно простой процедурой, что использует стандартные технологии рекомбинантной ДНК. 69 Рисунок 3 представляет репрезентативную исход для очистки клона ВАС, содержащей полнометражный кДНК JEV SA 14 -14-2 от полосы в градиенте CsCl-EtBr.В этом эксперименте, после центрифугирования в течение 16 ч при 401,700 × г, два отдельные полосы, то есть, Е. палочка хромосомной ДНК выше и суперспирализована ВАС плазмидной ДНК ниже, видны в середине трубки при длинноволновом ультрафиолетовом свете. Минимальном объеме (~ 400 мкл) нижней полосы ВАС-ДНК была тщательно собирали, тыкая отверстие с помощью шприца на стороне трубки. Впоследствии EtBr экстрагировали из ДНК ВАС экстракцией бутанолом и EtBr свободной ВАС-ДНК концентрировали осаждением этанолом.

Последним шагом является определение конкретного инфекционности синтетических РНК транскрибируется в пробирке с полной длины SA 14 -14-2 ВАС (PBAC / SA 14 -14-2) после трансфекции РНК в клетках разрешительных (рисунок 4). Этот шаг включает в себя три последовательные стадии: Шаг 1, линеаризацию полной длины SA 14 -14-2 кДНК на 3 '-end вирусного генома (фиг.4А); Шаг 2, производство синтетических РНК из линеаризованной кДНК по стекания транскрипции (рис 4В); и шаг 3, спасательных рекомбинантных вирусов в Клетки ВНК-21, трансфицированных синтетическим РНК (фиг.4С). Экспериментально два независимых клонов PBAC / SA 14 -14-2 линеаризовали с Xba I пищеварения и обрабатывают MBN удалить четыре базы 5 'выступ сгенерированный Xba I пищеварения. Линеаризованные ВАС были очищены путем экстракции фенол-хлороформ, а затем осаждали этанолом. Линеаризации двух очищенных БАС была продемонстрирована на 0,8% агарозном геле (фиг.5А). Извлечение фенол-хлороформ, необходимо тщательно, чтобы обеспечить линеаризованные ВАС являются РНКазы. Каждый из двух линеаризованных БАС служил в качестве шаблона кДНК стекания транскрипции с использованием полимеразы SP6 в РНК присутствии м 7 г (5 ') ППС (5') Колпачок аналоговый. Целостность синтетических РНК было показано, выполнив аликвоты двух реакционных транскрипции смесей на 0,6% агарозном геле, а также ссылка 1 кб ДНК лестницы (фиг.5В). В этом простом анализе, главным группа заметным РНК всегда мигрировали просто ниже 3 кб ссылки полосу ДНК и, казалось, быть резким. Тем не менее, деградировали РНК бы размытый вид на тот же гель.

Инфекционное центр анализа является золотым стандартом для определения конкретных инфекционности синтетических РНК. Этот анализ был сделан электропорации Клетки ВНК-21 с образцами РНК, посев равные аликвоты в 10 раз серийно разведенными электропорации клеток в 6-луночные планшеты, содержащие наивные Клетки ВНК-21 (3 × 10 5 клеток / лунку), и наложения агарозы на монослои клеток. После инкубации в течение 4 дней, выжившие клетки фиксировали и окрашивали формальдегида с кристаллическим фиолетовым сспособность по количественно число центров инфекционных (бляшки), что соответствует числу инфекционных молекул РНК, доставленного в клетки (фиг.6А). Поскольку матрицы кДНК для транскрипции в пробирке было доказано, чтобы быть неинфекционного, 27 аликвоту реакционной смеси транскрипции непосредственно использовали для электропорации. Электропорация является предпочтительным методом для РНК трансфекции; В качестве альтернативы, РНК могут быть трансфицированы с помощью других методов, использующих DEAE-декстрана и катионных липосом. РНК электропорации является очень эффективным, но "дуги" от электрического импульса происходит редко, если соли присутствуют в реакции электропорации или если электропорации кюветы повторно. Выражение вирусных белков в РНК-трансфецированных клеток исследовали с помощью иммунофлуоресценции с использованием анализов анти-NS1 кроличьей антисыворотки (фиг.6В). Производство вирусных частиц, накопленных в супернатантах РНК-трансфицированных клеток былаalyzed бляшкой анализа (рис 6в). Результаты этих экспериментов ясно показывают, что кДНК-производные синтетические РНК являются инфекционные в разрешающих Клетки ВНК-21, генерируя высокий титр рекомбинантных вирусов.

Олигонуклеотидов Последовательность а (5 'к 3') Положение B Полярность
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Антисмысловая
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Смысл
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Антисмысловая
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 Муравейя чувствую
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Смысл
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Антисмысловая
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Антисмысловая
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Смысл
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Антисмысловая
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10952-10977 Антисмысловая
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Смысл
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10956-10977 Антисмысловая
SP6F cataccccgcgtattcccac
та 		Смысл
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Антисмысловая
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Смысл
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Антисмысловая
X1f CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Смысл
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Антисмысловая
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Смысл
X2r cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Антисмысловая
РОФ CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670-10694 Смысл
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10954-10977 Антисмысловая
а Jev последовательности показаны заглавными буквами, и последовательности ВАС указаны строчными буквами.
Положение б нуклеотидов относится к полной последовательности генома JEV SA 14 -14-2 (GenBank инвентарный номер JN604986).

Таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые для синтеза кДНК, ПЦР-амплификации и BAC мутагенеза.

Диаграмма синтеза и модификации кДНК; Показано выделение вирусной РНК, субклонирование, процесс сборки.
Рисунок 1.0; Стратегия для строительства полноразмерной кДНК JEV SA 14 -14-2 как BAC (А) Выделение вирусной РНК из JEV частиц.. Показана принципиальная схема геномной РНК JEV SA 14 -14-2. (В) Синтез четырех перекрывающихся фрагментов кДНК (от F1 до F4) охватывает весь вирусный геном. (С) Субклонирование четырех перекрывающихся фрагментов кДНК в вектор BAC, создавая PBAC / F1, чтобы PBAC / F4. (D) Модификация клонированных кДНК для стекания транскрипции в пробирке. PBAC / F1 SP6 является производным PBAC / f1, который содержит промотор SP6 выше по потоку последовательности вирусного 5'-конце. PBAC / F3 КО является производным PBAC / F3, который содержит тихую точечную мутацию (A 9134 → T, звездочка). PBAC / F4 RO представляет собой производное PBAC / F4, который содержит искусственное Xba I стоки сайт ниже по потоку от вирусной 3'-конце. (Е сильный>) Ассамблея полной длины SA 14 -14-2 ВАС (PBAC / С.А. 14 -14-2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Результаты ДНК-электрофореза; гель, показывающий разделение фрагментов ДНК по размеру в килооснованиях; молекулярные маркеры.
Рисунок 2. Синтез из четырех перекрывающихся фрагментов кДНК (F1-F4), охватывающих всю длину геномной РНК JEV SA 14 -14-2. Четырем продуктам ПЦР-оцениваются с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. М, 1 кб ДНК лестницы. Ожидаемые размеры четырех фрагментов кДНК указаны в нижней части изображения геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Очистка BAC, содержащей полнометражный кДНК JEV SA 14 -14-2. ВАС плазмиды выделяют из Е. палочка DH10B методом лизиса SDS-щелочной и дополнительно очищают полосы в градиенте CsCl-EtBr. Представлен пример градиента CsCl-EtBr использованием 16 × 76 мм герметичные полипропиленовую трубу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

диаграмма линеаризации кДНК и синтеза РНК; Восстановление вируса путем трансфекции РНК в клетках BHK-21.
Рисунок 4. Обзор восстановления инфекционных вирусов из полной длины JEV SA 14 -14-2 кДНК собранном в BAC. (А) Линеаризация матрицы кДНК. Полнометражный JEV ВАС сократить сXba I и обрабатывали MBN. (В) Синтез РНК-транскриптов. КДНК Линеаризованная транскрибируется SP6 РНК-полимеразы в присутствии м 7 г (5 ') PPP (5') колпачком аналога. (С) Восстановление синтетического Jevs. В пробирке транскрибируемых РНК трансфецировали в ВНК-21 клеток путем электропорации, который генерирует высокий титр вируса синтетического. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Электрофорез в агарозном геле транскриптов кДНК и РНК; Размеры полос ДНК; молекулярный маркер.
Рисунок 5. Синтез РНК с помощью транскрипции в пробирке с использованием полной длины Jev BAC в качестве шаблона кДНК. (А) Генерация линеаризованной полной длины JEV ВАС, PBAC / SA 14 -14-2. Два независимых клонов PBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 и Cl.2) линеаризуют путем гидролиза с помощью XbaI и последующей обработки MBN. Линеаризованные ВАС рассматриваются с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. (Б) Производство синтетических РНК по стекания транскрипции. Каждый из двух линеаризованных ВАС используется в качестве шаблона для SP6 РНК-полимеразы стоки транскрипции. Аликвоты двух реакций транскрипции будут работать на 0,6% агарозном геле. М, 1 кб ДНК лестницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

инфекционность РНК и выход вирусов в клеточных культурах; гистограммы, анализы бляшек, результаты микроскопии.
Рисунок 6. Удельный инфекционность синтетических РНК транскрибируется с полной длины JEV BAC и восстановления синтетического вируса. ВНК-21 клетки макет электропорации (Мок) или электропорации с РНК-транскриптов, полученных FRом каждого из двух независимых клонов полной длины JEV BAC (Cl.1 и Cl.2). (А) РНК инфекционности. Клетки покрывали агарозой и окрашивали кристаллическим фиолетовым через 4 дня после трансфекции. РНК инфекционность определяется инфекционных анализах центра для оценки количества инфекционных РНК электропорации в клетки (слева). Кроме того, представитель образы инфекционных центров приведены (правая панель). (Б) Экспрессия белка. Клетки культивировали на слайдах камеры 4-луночных. Вирусный экспрессии белка РНК-электропорации клеток при 20 ч после трансфекции (ТВД) анализировали с помощью иммунофлуоресценции с использованием анализов первичный анти-кроличьей антисыворотки NS1 и вторичный Cy-3 конъюгированный козьих антител против кроличьего IgG (красный). Ядра контрастно 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (синий). В иммунофлуоресцентные изображения накладываются на их соответствующих дифференциальных помех контрастных изображений. (С) Вирус выход. Клетки культивировали в 150 мм культуры блюда. Производство инфекционных вирионов, накопленных в супернатантах культуры РНК-электропорации клеток в 22 и 40 HPT проверяется налета анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время протокол был успешно использован для создания полнометражных инфекционных клонов кДНК для двух различных штаммов (CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28) JEV, в флавивируса, функциональная кДНК оказалась по сути трудно построить и распространяются из клетки-хозяина токсичности и генетической нестабильности клонированной кДНК 8,74-76 Этот протокол включает в себя три основных компонента:. первых, максимизации синтеза / амплификацию кДНК точную копию вирусной РНК с помощью высококачественного воспроизведения обратной транскриптазы / ДНК-полимераза; во-вторых, клонирование вирусной PRM-E кодирующую область, содержащую токсичные последовательности (неопубликованные данные) 74,77,78 в очень низкой копирования номер вектора BAC от начальной кДНК Субклонирование к конечным полнометражных этапов сборки кДНК; в-третьих, используя клонирующий вектор BAC, которые могут вместить чужеродной ДНК со средним размером 120-350 т.п.н., 19-21, по-видимому терпит больший INSE ДНКРТС, чем другие векторы для клонирования. Это клонирование подход широко применяться в многих других положительных нити РНК вирусов, особенно тех, с большим РНК генома ~ 10 до 32 кб. Генерация инфекционного клона кДНК является ключевым шагом в развитии системы обратного генетики для РНК-содержащих вирусов, особенно для положительных нити РНК-вирусов, потому что его геном выступает в качестве вирусной мРНК, которая транслируется в белков клетки-хозяина рибосом. Таким образом, вирусная репликация может быть инициировано путем введения кДНК, полученных генома длиной молекулы РНК в восприимчивого клетке-хозяине. Наличие инфекционного клона кДНК JEV, в сочетании с технологией рекомбинантной ДНК, возросла наше понимание различных аспектов жизненного цикла вируса на молекулярном уровне, такие как экспрессии генов 73,79 и геномной репликации. 63,64 Кроме того, полнометражный JEV клон кДНК оказалась ценным инструментом для развития антивирусных вакцин и векторов 28 доставки генов. 80,81

Как и со всеми положительными нити РНК-содержащих вирусов, существует множество критических этапов построения надежного функционального кДНК JEV, из которого очень заразным РНК могут быть синтезированы в пробирке. В идеале, последовательности синтетической РНК транскрибируется с клона кДНК полной длины должны быть идентичны, что из геномной РНК вируса, в частности последовательностей 5'- и 3'-концевых которые необходимы для инициирования вирусной репликации РНК . 60-62 В текущем протоколе, подлинный 5'- и 3'-концы были обеспечены путем размещения последовательность SP6 промотора перед первым аденин нуклеотидов вирусного генома и позиционирование уникальный искусственный сайт рестрикции Xba I на выходе последнего тимин нуклеотидов вирусного генома, соответственно. Игрок национальной сборной синтетических РНК с подлинным 5 'и 3' концах были произведены стекания транскрипцию Xba I-линеаризованной и MBN обработанной кДНК тэmplate помощью SP6 РНК-полимеразы загрунтовать с м 7 г (5 ') PPP (5') колпачок аналог. Этот протокол может быть изменен несколькими способами. Для транскрипции в пробирке, другой бактериофага РНК-полимеразы (например, Т3 или Т7) может быть использован в сочетании с его четко определенной последовательностью промотора. 27 В стекания сайта, другой сайт рестрикции могут быть использованы, если его нет в вирусный геном, и если синтетические РНК из линеаризованной концов кДНК с аутентичным 3'-конце. Важность нуклеотидной последовательности 3'-концевого была продемонстрирована в ~ 10-кратному уменьшению РНК инфекционности при синтетической РНК содержит три или четыре вирусом связаны нуклеотидов на ее 3'-конце. 27 В пробирке реакции транскрипции в оба М 7 г (5 ') ррр (5') А и м 7 г (5 ') ррр (5') G Крышка аналогового может быть использован в равной степени, хотя последний местах неродственного дополнительное G нуклеотид перед вирусный 5 "-end, ноДобавление не изменяет инфекционность или репликации синтетической РНК. 27 Более того, удаление матрицы кДНК из РНК-транскриптов ДНКазой I пищеварения не является необходимым для РНК инфекционности испытаний, так как шаблон кДНК само по себе не инфекционное. 27

Технология ВАС в настоящее время применяется для построения инфекционных клонов кДНК для горстки положительно цепь РНК вирусов, а именно, двух Jevs, CNU / LP2 27 и SA 14 -14-2 28 (размер генома, ~ 11 Кб); два денге вирусы, БР / 90 26 и NGC 29 (~ 11 кб); вирус бычьей вирусной диареи, SD1 (~ 12 кб); 25 двухместных классических вирусов чумы свиней, C и Падерборн (~ 12 кб), 24 вирус пограничной болезни, Gifhorn (~ 12 кб), 24 свиной вирус репродуктивного и респираторного синдрома , PL97-1 / LP1 (~ 15 кб); 30 передающийся вирус гастроэнтерита, PUR46-MAD (~ 29 кб), 16 кошачий вирус инфекционного перитонита,DF-2 (~ 29 кб); 32 тяжелого острого респираторного синдрома коронавирус, Урбани (~ 30 кб); 9 респираторный синдром коронавируса Ближний Восток, EMC / 2012 (~ 30 кб); 17 и человека коронавирус, OC43 (~ 31 Кб) 31 Основным преимуществом использования БАС для строительства кДНК высокой генетической стабильности крупных, 1- или 2-копии плазмид ВАС. Однако, внутренняя природа его количества чрезвычайно низкой копирования также большим недостатком, из-за очень низких выходов ДНК ВАС и последующим снижением чистоты ДНК ВАС, в отношении хромосомной ДНК хозяина. В текущем протоколе, выход ВАС-ДНК максимизируется путем выращивания E. палочка DH10B трансформировали инфекционного BAC PBAC / SA 14 -14-2 в питательной среде, 2xYT. Несмотря на это усилий, средняя урожайность составляет всего ~ 15 мкг ВАС-ДНК из 500 мл бульона 2xYT. Кроме того, чистота ВАС-ДНК лучше всего достигается с помощью CsCl-EtBr центрифугирования в градиенте плотности для очисткиВместо обычно используемого столбца на основе выделения плазмид. Тем не менее, важно иметь в виду, что ВАС-трансформированную E. палочка не должны зарастать, потому что это может поставить под угрозу генетической стабильности клонированной кДНК, и более высокие темпы роста не обязательно приведет к повышению урожайности или BAC ДНК выше чистоты.

Протокол, описанный здесь, это оптимизированная, эффективный и рациональный способ построения и распространения генетически стабильной полнометражного инфекционное кДНК клона как BAC для JEV, процедура когда-то думали практически невозможно. Та же самая стратегия клонирования может быть применено ко многим другим положительным прядь РНК-вирусов. В целом, инфекционные кДНК-клоны позволяют ввести различные мутации (например, делеции, вставки, и точечные мутации) в вирусный геном РНК, чтобы изучить их биологические функции в репликации вируса и патогенеза. Это кДНК-система обратной генетики позволяет разрабатывать и ТЭСт вакцину и терапевтические кандидаты ориентирована на фактор (ы) вирулентности конкретного положительного нити РНК-вируса, представляющего интерес. Кроме того, эта технология инфекционное кДНК может быть также использован в качестве вирусного вектора, способного экспрессировать чужеродный ген (ы) интерес для многих приложений в биомедицинских исследований.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Фонду научных технологий и исследований штата Юта за поддержку YML и грантам Корейского национального исследовательского фонда (2009-0069679 и 2010-0010154) за поддержку SIY. Это исследование было поддержано Сельскохозяйственной экспериментальной станцией штата Юта Университета штата Юта и утверждено в качестве журнальной статьи под номером UAES #8753. Кроме того, авторы благодарят доктора Дебору Макклеллан за помощь в редактировании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>1. Молекулярное клонирование
2xYT БульонSigma-AldrichY2377
[3H]UTPPerkinElmerNET380250UCРадиоактивный
50 мл ТубаThermo Scientific (Nalgene)3114-0050
250 мл БутылкаBeckman Coulter356011
агарозеLonza50004
Агароза (низкая температура плавления)Life Technologies (Invitrogen)16520-100
AvaINew England BioLabsR0152S
AvrIINew England BioLabsR0174S
BamHINew England BioLabsR0136S
BsiWINew England BioLabsR0553S
BsrGIНовый Англия БиоЛабсR0575S
БутанолФишер СайентификА399-1 
Хлорид цезияFisher ScientificBP1595-1
ХлорамфениколSigma-AldrichC0378
ХлороформSigma-AldrichC2432Канцерогенная
фильтровальная бумага DE-81 GEHealthcare Life Sciences3658-023
dNTP mixLife Technologies (Invitrogen)18427-088
E. coli DH10B Life Technologies (Invitrogen)18297-010
EDTASigma-AldrichE5134
Этанол Sigma-AldrichE7023
Бромид этидияSigma-AldrichE7637Токсичная и высокомутагенная
фильтрующая колонка (Plasmid Maxiprep Kit)Life Technologies (Invitrogen)K2100-26
Ледяная уксусная кислотаSigma-AldrichA6283Раздражающая
глюкозаSigma-AldrichG5400
Гликоген Roche10901393001
высокоточная ДНК-полимеразаNew England BioLabsM0491S
Изоамиловый спиртSigma-AldrichI9392Легковоспламеняющийся
изопропанол Amresco0918Легковоспламеняющийся
LB BrothLife Technologies (Invitrogen)12795-027
Хлорид литияSigma-AldrichL9650
ЛизоцимAmresco0663
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
M-MLV Обратная транскриптазаLife Technologies (Invitrogen)18080-044
Нуклеаза бобов мунгNew England BioLabsM0250S
Игла (18G, 20G)BD305196, 305175биологически опасный (отходы острых предметов)
NotINew England BioLabsR0189S
ОлигонуклеотидИнтегрированные технологии ДНКПользовательский синтез
PacINew England BioLabsR0547S
pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
Фенол (буферно-насыщенный)Life Technologies (Invitrogen)15513-039Токсичный и высококоррозионный
фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт LifeTechnologies (Invitrogen)15593-031Токсичный и высококоррозионный
фенол:Гуанидин ИзотиоцианатLife Technologies (Ambion)10296-010Токсичный, коррозионный и раздражающий
Pme INew England BioLabsR0560S
Ацетат калияAmresco0698
Ингибитор РНКазыLife Technologies (Invitrogen)10777-019
Набор rNTPGE Healthcare Life Sciences27-2025-01
Герметичная полипропиленовая трубка (16 & 76 мм) НБСП;Beckman Coulter342413
SfiINew England BioLabsR0123S
Sma INew England BioLabsR0141S
Ацетат натрияSigma-AldrichS2889
Додецилсульфат натрияAmresco0227
Гидроксид натрияSigma-AldrichS5881
SP6 РНК-полимеразаEngland BioLabsM0207S
(набор для мини-подготовки плазмиды)Life Technologies (Invitrogen)K2100-11
ШприцHSW NORM-JECT4200.000V0
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
TrisAmresco0826
тРНК (дрожжи)Life Technologies (Invitrogen)15401-011
XbaI New England BioLabsR0145S
Название<>CompanyНомер в каталогеКомментарии
2. Клеточная культура
Альфа Минимал Эссенциал MediumLife Technologies (Gibco)12561-049
Коническая трубка (50 мл)VWR21008-242
Кристалл фиолетовый Сигма-ОлдричC0775
Чашка для культуры (150 мм) ТЭС93150 
Кювета (зазор 2 мм)Гарвардский аппарат450125 
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота Life Technologies (Gibco)16000-044
ФормальдегидSigma-AldrichF1635Токсичный и канцерогенный
глютаминLife Technologies (Gibco)25030-081
Minimal Essential MediumLife Technologies (Gibco)61100-061
Пенициллин/стрептомицинLife Technologies (Gibco)15070-063
Хлорид калияSigma-AldrichP3911
Фосфат калия одноосновнойSigma-AldrichP9791
Шестилуночная пластинаTPP92006
Хлорид натрияSigma-AldrichS3014
Двухосновной фосфат натрияSigma-AldrichS3264
Трипсин-ЭДТА (0.25%)Life Technologies ( Gibco)25200-056
ВитаминыСигма-ОлдричM6895
НазваниеCompanyКаталожный номерКомментарии
3. Оборудование
Система электрофореза в агарозном гелеMupidMPDEXU-01
CO2 инкубаторThermo ScientificHeracell 150i
Настольная центрифуга Электропоратор Thermo ScientificST16R
Гарвардский аппаратECM 830
Длинноволновые ультрафиолетовые лампы (ручные)UVPUVGL-58
Beckman Coulter368826
ThermocyclerLife Technologies (прикладные биосистемы)GeneAmp PCR System 9700
VortexerScientific IndustriesG-560
Водяная баняJeio TechWB-10E
олигонуклеотидов Спиновая колонка New strongНастольная центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290(2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14(2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248(2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318(2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Reverse GeneticsJapanese Encephalitis VirusViral RNA IsolationcDNA SynthesisPlasmid LinearizationIn Vitro TranscriptionVirus RecoveryCesium Chloride Gradient

Похожие статьи