Методическая статья

Быстрый

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 сентября 2015 г.

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает быстрый и упрощенный метод гибридизации in situ, идеально подходящий для мозга с префиксом параформальдегида, тем самым уменьшая потребность в длительных сложных этапах при использовании свежезамороженных тканей. Метод валидирован с использованием идентификации гена рецептора серотонина 5-HT2A htr2a у крыс.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Токсичность

3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА; экстази) может вызвать регионоспецифичные изменения экспрессии серотонинергической мРНК из-за синдрома острого серотонина (5-гидрокситриптамина; 5-HT). Эта гипотеза может быть проверена с помощью гибридизации in situ для обнаружения гена рецептора серотонина 5-HT2A htr2a. В прошлом такие процедуры с использованием радиоактивного рибозонда были затруднены из-за сложного рабочего процесса, который требовал нескольких дней, а также из-за того, что метод требовал использования свежих замороженных тканей, хранящихся в среде, свободной от РНКазы. В последнее время разработка коротких олигонуклеотидных зондов упростила процедуры гибридизации in situ и позволила использовать участки мозга с префиксом параформальдегида, которые более широко доступны в лабораториях. Здесь мы опишем подробный протокол с использованием нерадиоактивных олигонуклеотидных зондов на тканях мозга с префиксом. Гибридизационные зонды, используемые для этого исследования, включают dapB (бактериальный ген, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу), ppiB (бытовой ген, кодирующий пептидилпролилиизомеразу B) и htr2a (ген серотонина, кодирующий рецепторы 5-HT2A). Этот метод относительно прост, дешев, воспроизводим и требует менее двух дней для выполнения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синдром серотонина (5-гидрокситриптамина; 5-HT) - это острое неврологическое расстройство, вызванное препаратами, способствующими 5-HT, такими как антидепрессанты1, а также возникающее в ситуациях использования MDMA в рекреационных целях2. Молекулярные механизмы, ответственные за перепады настроения, дефицит обучения и памяти, возникающие в связи с острым синдромом, не совсем понятны3,4. Гибридизация in situ является мощным исследовательским инструментом, позволяющим обнаруживать и количественно оценивать специфические мРНК, потенциально экспрессируемые на уровне одной клетки. Традиционный способ проведения гибридизации in situ заключается в использовании радиоактивно меченного рибозонда, который специфически гибридизирует интересующий ген. Однако существенным недостатком метода является то, что метод требует сложных и трудоемких этапов подготовки зонда и гибридизации, а также доступа к свежезамороженным тканям, содержащимся в среде, свободной от РНКазы5,6.

Недавно были разработаны олигонуклеотидные зонды для гибридизации более коротких фрагментов РНК, чем те, которые требуются для рибозондов7. Кроме того, зонды выдают слабый фоновый сигнал без ущерба для специфичности8. Эта недавно разработанная технология зондов может быть использована для гибридизации in situ на тканях мозга с префиксом параформальдегида, обычно доступных в иммуноцитохимических лабораториях.

Здесь мы описываем протокол гибридизации in situ с использованием олигонуклеотидных зондов на мозге крысы с префиксом параформальдегида и сравниваем результаты с теми, которые были отмечены в свежезамороженном мозге5,6. Этот протокол используется для проверки гипотезы о том, что злоупотребление психоактивными веществами MDMA вызывает изменения в гене рецептора 5-HT2A htr2a в мозге. Мы начали процедуру с лечения MDMA с последующей перфузией параформальдегидной ткани животного, гибридизацией зонда thr2a in situ и анализом данных. Обратите внимание, что dapB (бактериальный ген, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу) используется в качестве отрицательного контроля, а ppiB (ген, кодирующий пептидилпролилиизомеразу B) — в качестве положительного контроля.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета институциональной животных (IACUC) в Росс школы Университета ветеринарной медицины и Florida Atlantic University мимо. Несмотря на то, стерильные методы и перчатки требуется, РНКазы среда не является необходимым при использовании этого протокола.

1. Подготовка

  1. Подготовка тканей и секционирования
    1. Связать крыс случайным образом на три группы: свежий / физиологического раствора (SAL; 0,9% NaCl), префикс / SAL и префиксом / 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА; подробнее см таблицу 1).
    2. Администрирование три дозы 1 мл / кг SAL и 10 мг / кг внутрибрюшинно МДМА, соответственно, к группам SAL и МДМА в 2 интервала ч. Разрешить животных, чтобы выжить лечение в течение 6 дней.
    3. На 7-й день, управлять 100 мг / кг кетамина в комбинации 5 мг / кг ксилазина внутрибрюшинно крысам для глубокой анестезии в (то есть, потеря роговицы мигают и таиль щепотку рефлексы).
    4. Для свежего / SAL группы, быстро обезглавить крыс и удалить мозг для испытания свежего мозга (подробности см в ссылке 5).
    5. Для префиксом / SAL и префиксом / МДМА групп, сделать разрез вдоль грудины около 10 -12 см, а затем подвергать конец грудины.
    6. Удерживая конец грудины с кровоостанавливающего и сократить диафрагму в поперечном направлении с обеих сторон острыми ножницами, а затем разрезать вверх по ребрам и параллельно легких.
    7. С одной стороны, держать брюшную кончик сердце с маленькими щипцами. С другой стороны, пробить в левый желудочек с 18 G иглой шприца (обратите внимание на адаптер сторону иглы, связанного с Y-образной силиконового шланга к ледяной SAL и параформальдегидом контейнеров и перистальтических насосов; см ссылка 9).
    8. Включите SAL насоса на среднем уровне расхода (~ 5 мл / мин) и проколоть правое предсердие с пинцетом, чтобы позволить утечку обратного CIRCавляет. Поддержание SAL перфузии в течение 30 мин.
    9. Включите параформальдегида насоса на среднем уровне и позволяет ледяной 4% параформальдегида заливать животное в течение 30 мин.
    10. Удалить перфузии инструмент и обезглавить животное. Сделайте заднепередний прорезать средней линии черепа, а затем махать череп, чтобы выставить череп полость 10.
    11. Удалить мозга с помощью шпателя из полости черепа и поместить в мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 4% параформальдегида. Держать мозг в пределах параформальдегида содержащие трубки на 4 ºC холодильником в течение 24 ч.
    12. Перемещение мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 30% раствора сахарозы при 4 ° С в течение 3 дней. Наконец, хранить мозг внутри пластиковых пакетов при -80 ° С до использования.
    13. Установите мозг на патроне при встраивании СМИ и заморозить вложения средств массовой информации, содержащие мозг в криостат при температуре -26 ° C. Разрежьте свежий замерп мозг в 20 мкм разделы и параформальдегиде префиксом мозг в 10 мкм разделов. Перенести раздел на предметное стекло микроскопа РТ, касаясь слайда в разделе.
    14. Воздух сухой при комнатной температуре в течение 4 часов. Храните раздел слайдов в плотно закрытой сумке при -80 ° С до использования.
  2. Обезвоживание
    1. Возьмите слайды из -80 ° C морозильника и назначить разделы в одну из трех испытаний: НТ2А, ppiB (положительный контроль) или dapB (отрицательный контроль); марка и секции этикетка с шариковой ручкой (не используйте карандаш). Submerge слайдов в 100% -ном спирте при комнатной температуре в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу.
  3. Предварительная обработка
    1. Внесите 20 мкл-1 Предварительная реагента (инактивация щелочной фосфатазы) в секциях на слайдах. Поместите слайды на направляющей стойки в лотке влаги (обратите внимание, что лоток закрывают крышкой, чтобы поддерживать высокую влажность для предотвращения испарения из реакционной SOLUTIOп).
    2. Осторожно встряхнуть лоток влаги на горизонтальном шейкере при низкой скорости в течение 10 мин. Вымойте слайды дважды бидистиллированной воды (DDH 2 O) в течение 2 мин. Погрузите слайд в 200 мл стакан, содержащий 150 мл Предварительная-2 реагента (преломлении поперечных связей, вызванных фиксацией параформальдегидом). Отварить слайды в общей сложности 5 мин при 100 ° С (тепловой индуцированных восстановление структуры РНК 11).
    3. Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин. Поместите слайды в 100% -ном спирте в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу. Используйте гидрофобный ручку, чтобы нарисовать круг вокруг выбранной области в разделе ткани (например, не-корковых структур, в том числе таламуса и гипоталамуса, как описанные в Рисунке 2).
    4. Внесите 10 мкл Предварительная-3 реагента (увеличивается в проникновения зонда) в каждой выбранной области, и покрыть лоток влаги с крышкой. Поместите лоток в гибридизации духовкеоснащен горизонтальной шейкере и установите температуру духовки на 40 ° С; встряхните поднос в течение 30 мин. Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин.

2. Гибридизация и усиления

  1. Внесите 10 мкл HTR2A, ppiB и dapB зонда реагентов, соответственно, на отдельных областях. Накройте лоток влаги с крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Слегка встряхните на горизонтальной шейкере при низкой скорости. Инкубируйте слайды на 40 ºC в духовке в течение 2 часов.
  2. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-1 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
  3. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-2 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
  4. Вымойте слайды в два раза WIth промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-3 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
  5. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-4 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
  6. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-5 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 30 мин.
  7. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-6 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 15 мин. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин.

3. Обнаружение сигналов

  1. Пипетка 10 мкл Красного реагента к каждой выбранной области (Обратите внимание, что реагент представляет собой смесь Red-B и красно-A в соотношении 1:60 и должен быть использован Immediately). Поместите слайд в лоток влаги на горизонтальном шейкере при комнатной температуре и слегка встряхнуть при низкой скорости в течение 10 мин.
  2. Промыть слайдов дважды (DDH 2 O) в течение 10 мин. Высушите слайды на 60 ºC в духовке в течение 15 мин. Поместите слайды в ксилоле при вытяжном шкафу в течение 5 мин. Внесите 20 мкл ксилола на основе монтажа СМИ на каждой выбранной области и накройте покровным.

4. Захват изображения

  1. Сделайте цифровые микрофотографии отдельных областях (например, гипоталамус, цифры 1 и 3) с увеличением 4 × 20 × и объективов. Сохраните файл изображения.

Анализ частиц 5. Изображение

  1. Перетащите файл изображения в главном окне ImageJ. Перейти к строке меню и выберите «образ», рядом выберите "Тип" из выпадающего меню, и выберите "8-бит".
  2. Выберите "Настройка", затем выберите "Threshold ", чтобы открыть диалоговое окно. Отрегулируйте значение нижнего бар в диалоговом окне, чтобы нежелательный фон удаляется. Перейти к строке меню и выберите «Анализ», затем выберите «Анализ частиц", чтобы открыть диалоговое окно второго.
  3. Установите размер частиц в 10, следующий выбор "Показать контуры" и выберите "Показать результаты" и "коробки" подвести итог. Наконец, нажмите кнопку "ОК", чтобы просмотреть данные частиц в диалоговых окнах.

6. Расчет таблиц

  1. Введите данные в лист Excel и в среднем число частиц в SAL группы в качестве базового. Рассчитать процент уровня каждой секции и сделать график соответственно (рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование олигонуклеотид РНК-зондов (<25 NT), гибридизация может быть обнаружен как красные точки в гипоталамических клеток, полученных из параформальдегида префиксом и свежезамороженных мозга. Молекулы мРНК HTR2A присутствуют в некоторых клетках (указанных сплошными стрелками), но не другие (открытые стрелки). Мы наблюдали, что нет никакой разницы между параформальдегида префиксом и свежие замороженные ткани (фиг.1). Успешная гибридизация может быть оценена сначала невооруженным глазом ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной из основных задач при проведении теста на гибридизацию in situ является выбор подходящих методов, используемых для сохранения РНК под действием ферментов РНКазы. Хорошо известно, что эти ферменты широко присутствуют в клетках и окружающей среде, что может повлиять на результаты. Однако активность фермента можно быстро определить, поместив ткань в раствор сухого льда/спирта5,12. Хотя быстрое сохранение имеет решающее значение для гибридизации с использованием рибозонда13, мало что изве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом NIH (R15DA029863), бакалавриата исследовательский грант Университет Florida Atlantic University (M30014) и Росс школы Университета ветеринарной медицины исследовательского гранта. Мы хотели бы поблагодарить Национальный институт по злоупотреблению наркотиками (Rockville, MD) для обеспечения (±) 3,4-метилендиоксиметамфетамина (± МДМА) для этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RNAscope Negative Control Probe-DapBAdvanced cell diagnostic, INC310098
RNAscope Pretreat 4Advanced cell diagnostic, INC320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - RedAdvanced клеточная диагностика, INC310036
RNAscope Probe - Rn-PpibAdvanced cell diagnostic, INC313921
Rat Htr2aРасширенная клеточная диагностика, ИНК300031
CryostatLeicaCM 1850
Горизонтальный шейкерVWR88032-088
Печь для гибридизацииThermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus микроскоп предметное стеклоFisher Scientific12-550-15
Гидрофобная ручкаVectorH-4000
МикроскопOlympusProvis AX70

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HTR2AFast RedImage J

Похожие статьи