Раскрытие Энтропическое Оценить ускорение, растворителем Dynamics в мембранных ферментов

Краткое содержание

Каналы для транспортировки молекул воды в ферментов влиять активное сольватацию сайта и катализ. В этом мы приводим протокол для техники этих дополнительных каталитических мотивов, основанных на в силикомарганца компьютерного моделирования и экспериментов. Это позволит повысить наше понимание влияния динамики растворителя на ферментативного катализа.

Аннотация

Ферментный катализ развивался в водной среде. Влияние динамики растворителей на катализ, однако, в настоящее время плохо изучено и обычно игнорируется. Изучение динамики воды в ферментах и связанных с ней термодинамических последствий является очень сложным и включает в себя компьютерное моделирование, эксперименты с ядерным магнитным резонансом (ЯМР) и калориметрию. Водные туннели, которые соединяют активный центр с окружающим растворителем, играют ключевую роль в вытеснении и динамике растворителя. Приведенный в настоящем документе протокол позволяет спроектировать эти мотивы для водного транспорта, что влияет на специфичность, активность и термодинамику. Обеспечивая биофизическую основу, основанную на теории и экспериментах, представленный здесь метод может быть использован исследователями, не имеющими опыта в компьютерном моделировании или биофизической химии. Этот метод углубит наше понимание ферментативного катализа на молекулярном уровне путем измерения энтальпических и энтропийных изменений, связанных с катализом вариантами ферментов с заблокированными водными туннелями. Протокол может быть использован для исследования мембраносвязанных ферментов и других сложных систем. Это улучшит наше понимание важности реорганизации растворителей в катализе, а также обеспечит новые каталитические стратегии в проектировании и проектировании белков.

Введение

Вода является краеугольным камнем для химии жизни ^1. Водные узоры и сольватации ферментных активных сайтах влиять как на энтальпии и энтропии связывания лиганда ^1,2 и катализ ³ в весьма сложным образом, выходящих за пределы гидрофобного эффекта ^2,3. ЯМР ^{4, 2 и} калориметрии молекулярное моделирование белков сольватированными были использованы, чтобы пролить свет на роль явных молекул воды в предоставлении движущей силой для лиганда ассоциации ^5-8, специфичности и активности ^2,9,10. В этом мы представляем уникальную методику для экспериментальной оценки термодинамической воздействия перемещения растворителя на ферментативного катализа (рис 1). Наша объединенная стратегия основана на использовании компьютерного моделирования совместно с ферментом техники и термодинамического анализа (рисунок 1). Это позволяет пролить дополнительный свет на воздействие динамики растворителя на CATAлизис, который в настоящее время мало изучены.

Стабилизация энтальпической взаимодействия, предусмотренные воды опосредованной водородных связей в сольватированы ферментных активных сайтах, может быть компенсировано энтропийных штрафов ^1. Эти энтропийные затраты связаны с уменьшением степени свободы, отображаемого молекул воды заключены в белковых полостей, по сравнению с водой в объеме ^5. Релиз молекул воды могут упорядоченных таким образом, обеспечить энтропийную движущую силу для лиганда ассоциации ¹ и катализа ^3. Одним из ключевых аспектов динамики растворитель представляет собой смещение молекул воды между внутренней и белков внешней растворителя ^4. Прилагаемые изменения в энергии активации, энтальпия, энтропия и ¹¹ полностью не поняты на молекулярном уровне. По воспрепятствование отдельные тоннели, ответственных за транспорт воды в ферментов, значение динамики растворителей и его вклад в активациюэнергия может быть оценена (рисунок 1). Кроме того, путем выполнения в одном реакторе кинетические опыты при разных температурах, относительные термодинамические параметры активации нескольких подложек могут быть извлечены из уменьшенного количества экспериментов (фиг.1, справа). Наша междисциплинарная метод утверждена для сложных мембраносвязанных ферментов тритерпеновый циклазу, которые генерируют полициклические терпены высокой важности для жизни ^12. Протокол позволяет для восстановления больших количеств белка (мембраны 10-20 мг / л) с использованием стандартного центрифуги.

Хотя ферменты развивались в воде, роль растворителя в продвижении катализ, как правило, пренебрегают. В дополнение к динамике белка ^13,14, что форма предварительно организованных активных сайтов с электростатическим взаимодополняемости в переходном состоянии ^15, динамика воды может быть большое значение для эффективного ферментативного катализа. По ковки несколько междисциплинарных методов, нашЦель заключается в содействии весьма комплексное изучение динамики водных и термодинамики. Внесение этих инструменты более доступными для научного сообщества приведет к разработке новых стратегий в фермента инженерии и белкового дизайна для измененных деятельности и специфики.

Протокол

1. В Silico Компьютерное моделирование

1. Скачать структуру PDB белка интереса из банка данных белка (PDB). Подготовьте структуру путем удаления избыточных подразделений, а затем добавить недостающие атомы водорода и явное растворителя, используя "Cell Обезвреживание и р K _{предсказание"} эксперимент в YASARA ^16. Для мембраносвязанных тритерпеновых циклаз, подходящие размеры коробки воды 91x67x77 Å. Отрегулируйте протонированию состояние каталитически активных аминокислот вручную.
   Примечание: При необходимости, аналог субстрата в PDB файла может быть изменен в режиме реального субстрата с помощью "Edit | Обмен | Atom" команды.
2. Минимизировать структуру с помощью команды «Энергия Минимизация", используя AMBER силовое поле набор ^17. Используйте сетки частиц Эвальда подход (PME) ¹⁸ для учета дальних электростатических взаимодействий. Установите отсечку для ван-дер-Ваальса, согласнов стандартных настройках.
   Примечание: Команда "Энергия Минимизация" удаляет конформационные стресс короткий крутой минимизации происхождения, то имитация отжига (TimeStep 2 фс, атом скорости уменьшено на 0,9 каждый ^10-й этап) проводится до тех пор, сближение не будет достигнуто (то есть, улучшение энергии менее чем 0,012 ккал / моль на атом в течение 200 шагов).

2. Модель Активный сайта сольватации и доступ к воде

1. После имитации отжига, запустить 20 нсек молекулярной динамики (МД) траектории и генерировать по меньшей мере 10 снимков "Файл | Моделирование Снимок | Сохранить как" команду с последующим "Моделирование On". Запуск моделирования на стандартный компьютер с периодическими граничными условиями при каноническом ансамбле. Поддерживайте температуру в 298 K, используя термостат Berendsen.
2. Подготовка снимки, полученные с 2,1 удалив все молекулы воды и возможные лигандов / субстраты с помощью4; Редактировать | Удалить | Остатки "Команда накладывать друг снимок отдельно от оригинальной PDB-структуры в." Накладывать | команды Объект ", чтобы убедиться, что все структуры и тот же пространственное положение Сохраните каждый снимок, полученный таким образом, в качестве нового PDB. -file (с помощью "Файл | Сохранить как | PDB" команды).
   Примечание: Для опытных моделистов: Написать сценарий для автоматизации этого процесса в соответствии с шаблоном, приведенной в Дополнительный код файла 1.
3. Используйте готовые снимки (PDB) с 2,2, которые были выровнены в 3D-пространстве в качестве вклада в программное обеспечение спелеолога 3.0 ^19. Для анализа ограниченного числа снимков, запускать кейвер на стандартном компьютере. Используйте радиус зонда 0,7 Å ^19, чтобы обеспечить обнаружение туннелей, которые являются специфическими для перевозки молекул воды.
4. Представьте туннели, генерируемые спелеолога 3.0 в молекулярной программного обеспечения графики. Для удобства визуализации тоннелей, используйте макрос, показанный в дополнительном код Filе 2.

3. В Silico инженерной энзимологии Изменение воды узоры и воды Динамика

1. Определить самый высокий рейтинг туннели в соответствии с заголовка "ID", перечисленные в выходной файл "Summary.txt" генерируется из программного обеспечения спелеолога 3.0.
2. Определить аминокислоты, выстилающие самый высокий рейтинг тоннели (3,1), и что дисплей небольшой боковой цепи, указывая внутрь канала путем визуального осмотра (с использованием модели, полученной из 2,4). Определить отдельные аминокислотные замены, которые будут блокировать тоннель по увеличению стерических препятствий, используя команду "Swap остаток". Убедитесь, что тоннель мешает путем визуального осмотра, а затем, повторяя шаги 1.2-3.1 протокола.

4. Выражение Mutated генов

1. Введение мутации в гене дикого типа путем мутагенеза с помощью ПЦР неперекрывающиеся праймеров ^20.
2. Добавить плазмидной ДНК, содержащей ген интереса к трубес с компетентные клетки штамма соответствующего клонирования и инкубировать на льду в течение 30 мин. Выполнение теплового шока преобразование в течение 45 секунд на водяной бане с температурой, установленной на 42 ° С. Добавить 500 мкл свежей обогащенной средой (2 х УТ, 16 г / л триптона, 10 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl) и инкубируют при 37 ° С, 200 мин в течение 45 мин. Сделайте выбор путем посева трансформированных клеток на чашках с агаром с добавлением соответствующих антибиотиков.
3. После проверки последовательности ДНК мутированного гена, трансформации плазмидной ДНК в штамм экспрессии с помощью теплового шока, как описано выше. Для выражения мембраносвязанных тритерпеновых циклаз, использовать BL21 (DE3).
4. Начало 5 мл o / n культуры при 37 ° С штамма экспрессии в 2 YT-среде с соответствующими антибиотиками.
5. Инокуляции 2 л с толку вибрирующей колбе, содержащую 300 мл 2 х УТ-среде с добавлением соответствующих антибиотиков, до конечной оптической плотности 0,05-0,09 (измеренная при 600 нм). После индукции в оптической плотности 0.6-0.8 и экспрессии белка, заморозить осадок клеток и хранят при -80 ° С.
   1. Мембраносвязанные тритерпеновых циклаз в векторе pD861, индуцируют с 0,5 до 2 мм и рамноза 4 ч экспрессии при 37 ° С, чтобы достичь высоких выходов белка ^21.

5. Мембрана Добыча используя обычный Центрифуга и белка Очистка

1. Подготовьте следующие буферы: ресуспендирующего буфера (100 мМ фосфат калия, рН 7,5 с добавлением ингибитора протеазы таблетки), моющих средств буфера (1% (об / об) Тритон Х-100, 50 мМ фосфат калия, рН 7,5) и реакционный буфер (0,2 % Тритон Х-100, 50 мМ фосфат калия, рН 7,5).
   1. Для сквален-hopene циклаз или других мембраносвязанных ферментов с более низкой рН оптимум, заменить фосфат калия в буфере для ресуспендирования с цитратом. Для таких ферментов используют следующие буферы на: моющее средство буфер (1% Тритон Х-100, 60 мМ цитрата, рН 6,0) и реакционный буфер (0,2% Тритон Х-100, 60 мМ цитрата, рН 6,0).
      Примечание: Если His-метка используется для очистки, в дополнение буфер ресуспендирования 20 мМ имидазола (конечная концентрация).
2. Взвешивание замороженного осадок клеток в стеклянном стакане. Ресуспендируют клеток в буфере для ресуспендирования с использованием гомогенизатора до конечной концентрации 0,3 г клеток / мл. Лизировать клетки ресуспендировали в ультразвуком с амплитудой 80% и импульса 1 сек на 1 сек и выключения. Используйте три повторяющиеся циклы 50 сек каждый.
3. Добавить моющего буфера до конечной концентрации 0,2% (объем / объем) моющего средства. Равновесие на конец над концом смесительного-при 4 ° С в течение 1 часа. Восстановление фракции белка мембраны за счет экономии супернатант после одной стадии центрифугирования при 39000 х г в течение 50 мин при 4 ° С.
   Примечание: Если используется для очистки His-метка, добавить приблизительно 1,5 мл Ni-NTA агарозы / г клеток и инкубируют в течение 1 часа.
4. Выполните первый очищениешаг либо ионного обмена или His-тэга очистки ^21. Дополнение к уравновешивани и элюировани буферами с 0,2% Triton X-100. Концентрат очищенный белок пять раз, используя центробежный фильтр устройства с отсечкой 10 кДа.
   Примечание: размер Тритон Х-100 мицеллы приводит к концентрации моющего средства до конечной концентрации примерно 1%.
5. Завершение очистки от полировки стадии фильтрации с использованием геля концентрированный белок и матрицу, совместимую с фракционирования диапазона для глобулярных белков в 2 × 10 ⁴ -8 × ¹⁰ 6. Используйте буфер реакции, как работает буфер. Измерить количество очищенного белка с использованием набора Ультра Bradford соответствии с протоколом производителя.

6. Кинетика

1. Сделать свежий 5 мМ исходного раствора субстрата в буфере для реакции. Получить гомогенной эмульсии ультразвуком при амплитуде 30% в течение 2-5 мин.
2. Равновесие термомиксерепри желаемой температуре реакции. Проверьте температуру внутри стеклянной ампулы, содержащей воду от внешнего термометра.
3. Для одного субстрата кинетики, разбавить эмульгированной субстрата в, по меньшей мере пяти стеклянных флаконах до той же конечной концентрации субстрата.
   1. Для одного горшка относительно кинетики с несколькими субстратов, подготовить по крайней мере, пять одинаковых стеклянные флаконы путем смешивания всех субстратов в каждом флаконе. Для гидрофобных тритерпеноидов, использовать Конечные концентрации субстрата в диапазоне 10-200 мкМ на.
4. Preincubate стеклянные флаконы в термосмеситель в течение 10 мин. Начало реакции добавлением фермента. Общий объем реакции 1 мл подходит. Используйте скорость встряхивания, по крайней мере 1200 оборотов в минуту.
5. Остановка реакции в различные моменты времени при добавлении 500 мкл этилацетата с шипами 100 мкМ деканола в качестве стандарта интеграции.

7. Добыча и термодинамического анализа

1. Извлеките реакционных смесейвортексе и вручную встряхивая стеклянные флаконы энергично в течение 1 мин. Центрифуга стеклянные флаконы на 9600 мкг в настольную центрифугу в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача верхний слой (органической фазе) в пустой трубке. Добавить дополнительные 500 мкл экстракционного растворителя с реакционных труб и повторить процедуру экстракции.
2. Высушите извлеченные реакционных смесей с Na _{2 SO 4.} Вихревые в течение 5 сек, и пусть трубы отдых в течение 10 мин. Выполните последний шаг центрифугирования в 9600 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре с использованием настольную центрифугу. Передача извлеченных образцов газовой хроматографии (ГХ) флаконах.
3. Повторите этапы под 6.1-7.2 для каждого фермента варианта интерес, с использованием по меньшей мере четыре различных начальную концентрацию субстрата (для одно кинетики субстрата) и четыре различных температурах (как одной подложке и конкурентных кинетики).
4. Выполнение GC-анализа, как описано ранее ^3. Используйте неполярный колонку для анализа гидрофобIC пентациклические продукции. Установка начального температуру печи до 120 ° С и использовать температурный градиент 5 ° С / мин, в зависимости от продуктов и колонну.
5. Интеграция пиков продукта (ов) и преобразовать пиковые продукт области в соответствующих концентрациях продукции с использованием площадь стандарта интеграции (что соответствует 100 мкм). Участок концентрации каждого продукта ([P]) в зависимости от времени реакции (т). Выполнения линейной регрессии точек данных, соответствующих конверсии менее 10%. Начальная скорость реакции (V ₀₎ задается наклон подобранной линии в соответствии с:
   
   Примечание: в одном сосуде относительно кинетики с несколькими субстратами, V ₀ является начальная скорость конкретного субстрата под действием других субстратов.
6. Для одиноких кинетики субстрата, участок V ₀ / [E] против соответствующих концентраций субстрата. Параметр / значение очевидно к _{кошка К} М задается наклон линейной части графика в соответствии с:
   
   [S] обозначает концентрацию субстрата и [E] концентрация фермента, используемого в трансформации. К _кошки / _К М приравнивается к каталитической константы над константы Михаэлиса. Повторите анализ для каждой температуры и каждого фермента варианта.
7. Для одиноких кинетики субстрата, выполнить термодинамический анализ в соответствии с переходной теории государственного ²²
   
   К _Ь постоянная Больцмана, ч постоянная Планка, Т температура в градусах Кельвина, и R газовая постоянная. Выполнение линейного регрессионного анализа сюжета LN ((K _{кошка / К М) / ((к B * T) / ч))) от 1 / T. Энтальпия активации (Δ H ^‡) дается (-slope) * R и энтропия активации (Δ S ^‡) дается (перехвата) * R.
   Примечание: Кроме того, анализ в соответствии с насыщающей концентрации субстрата может быть выполнена с помощью K кошку, как константы скорости в уравнении 3.}
8. Для одного горшка относительно кинетики с несколькими субстратов, получить относительное очевидно
   К _кошка / К _M значения за ^23:
   (К _{кат / К} М) _{А /} (к _{кат / К} М) = V _{B 0, A / V 0, В *} [B] / [A] (4)
   для которых _{V 0, А,} относится к начальной скорости для подложки А в конкурсе с подложки В.
9. Для одного горшка относительной киматикой с несколькими субстратами, получить относительные термодинамические параметры активации для B, по сравнению с в качестве эталона, по нелинейной регрессии:
   
10. Рассчитать абсолютные параметры активации для подложки В от энтальпии и энтропии активации опорного соединения А:
    

Результаты

Важность динамики вод в ферментативной polycyclization катализа вовлечен в анализ по силикомарганца и последующей визуализации обнаруженных туннелей (с помощью скрипта в дополнительном файле кода 2). После раздела 3 протокола, S168 оказывается остаток "горячей точкой" аминокислота подкладка один из туннелей в тритерпенового циклазы фермента из Alicyclobacillus acidocaldarius (Рисунок 1, средний левый). Вводя мутации S168F в кремнии, тоннель мешает, как видно при визуальном осмотре (рис 1, нижняя левая).

Скорость реакции для образования продуктов полициклических отображаемых тритерпеновых циклазы фермента очень чувствителен к температуре (фиг.2А). После протокола (раздел 4-7), он обнаружил, что на кажущуюся к _{CAT /} K _{М отображается фермента дикого типа для формирования пентациклических продуктов увеличивает пятидесятикратном при повышении температуры от 25 ° С (фиг.2А). Блокирование отдельных туннелей путем введения единого точечную мутацию оказывает существенное влияние на экспериментально определенных значений абсолютной / очевидными к кошачьих К М, а также на их температурной зависимости (фиг.2А).}

Из экспериментально определенных кинетических параметров, линейные термодинамические участки создаются с помощью уравнения 3 и следующем разделе 6-7 протокола для одиноких кинетики субстрата (рис 2b). Очень большие изменения энтропии и энтальпии активации наблюдаемые для вариантов несущих заблокированные туннели подразумевает ключевую роль в динамике вод в продвижении polycyclization каскад (рис 2С, расчеты на основе рис 2B). более того, Варианты с измененными тоннели воды отображать измененный свободной энергии Гиббса активации (Δ G = Δ ^{‡ ‡} Н - Т * Δ S ^‡, 2В-С). Например, при 303 K туннель вариант S168F отображает свободную энергию Гиббса активации 14 ккал / моль по сравнению с 16 ккал / моль для фермента дикого типа.

После протокола в разделе 7, уравнение 4 позволяет для расчета _{CAT /} значений очевидно K K _M для дополнительных субстратов из одного горшка кинетических экспериментов (рис 3а). Кроме того, линейный участок термодинамического (3В) могут быть построены путем запуска конкурса эссе при различных температурах (уравнение 5). По аналогии с одиночными кинетики субстрата, относительная энтальпия активации и энтропии в дополнительных субстратов по сравнению с эталонной соединения являются readilу добраться от перехвата и наклон линейной подходит для экспериментальных данных. Абсолютные значения термодинамических параметров активации может быть оценена из арифметического сложения с помощью термодинамических данных, связанных с эталонного соединения (уравнение 6). Использование протокола в данном описании, генерируется результаты ясно показывают, что мембрана фермент варианты с заблокированные туннели воды отображать принципиально разные термодинамические параметры активации для подложек разных размеров (рис 3C).

Рисунок 1. Протокол Резюме:. В силикомарганца компьютерного моделирования в концерте с экспериментального проектирования белка и термодинамического анализа позволяет более глубокое понимание влияния растворителей на динамике ферментативного катализа Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Термодинамические параметры активации вариантов дикого типа и туннельных из одиночных кинетики субстрата. (A) Полная K _{кошка /} значения К _М, полученные из экспериментальных данных и с помощью уравнений 1 и 2 (B) Термодинамический анализ с использованием теории переходного состояния и линейной аппроксимации экспериментальных данных уравнения 3. (C) термодинамические параметры активации, рассчитанные из участков в (В). Сложенные сквален субстрат показано с облигациями сформирован / сломана пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фигура 3. термодинамические параметры активации вариантов дикого типа и туннель для различных подложках. (А) относительно K _{кат / К} М значения, полученные из одного горшка кинетики путем использования уравнения 4. (B) Термодинамические участки кинетических данных на разные температура использованием уравнения 5. (C) Абсолютная термодинамические параметры активации, рассчитанные по уравнению 6, и с использованием подложки сквален на рисунке 2 в качестве ссылки. Облигации формируется / разбивал субстратов показаны пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Наиболее важные шаги в достижении высокого качества экспериментальных термодинамических данных для дикого типа мембраны ферментов и туннельных вариантов: 1) генерация компьютерной модели; 2) равномерно очищенные белки; 3) эмульсию запасы субстрата; 4) контроль температуры во время кинетики; 5) добыча реакционных смесей с использованием внутреннего стандарта.

Поколение компьютерной модели значительно облегчается при использовании программного обеспечения с дружественным интерфейсом, который поддерживает различные платформы. Следовательно, этот протокол основывается на YASARA Modeling Suite ^16, чтобы наша стратегия доступна даже к моделированию неспециалистов. Компьютерная модель для идентификации вода туннеля в идеале должна быть основана на кристаллической структуре интерес фермента ^24. Для этой цели богатый кристаллическими структурами доступны в банке данных белков является очень полезным. По нашему опыту, ключевой аспект в успешной подготовке ТЕАПластины для идентификации туннеля, чтобы сохранить кристаллографических воды. Это не менее важно, чтобы использовать сольватированную фермента окно при выполнении молекулярного моделирования динамики, которые могут быть запущены на обычный компьютер. Тритерпеновые циклаза от Alicyclobacillus acidocaldarius стабилен в воде в течение МД ^3. Тем не менее, сохраняя кристаллографических моющие средства и / или с использованием клеточной мембраны имитирует бы, возможно, потребуется для потенциально нестабильных ферментов, чтобы в течение длительного МД. Предполагается, что минимизируется кристаллическая структура высоко сложных целей может предоставить важную механистическую представление с использованием протокола, хотя это не будет захватывать динамических аспектов туннельного организации.

Спелеолог ¹⁹ в базовом режиме, с одной или ограниченного числа снимков в качестве вклада, могут быть использованы неспециалистами на стандартном ноутбуке. Основываясь на нашем опыте ^3, тоннелей с радиусом узкого (т.е., радиусна самом узком месте) меньше, чем 1 А может быть весьма актуальны для воды, особенно если кристаллографические молекулы воды находятся в пределах предсказанного туннеля (рис 1, средний левый). С другой стороны, больший радиус узким может означать туннель для транспортировки подложки в и из активного сайта ^10. Сценарий в дополнительном файле кода 2 может быть использован лицами, не являющимися специалистами для визуализации предсказанных туннелей. Дальнейшие эксперименты покажут, будет ли модели гомологии быть достаточно высоким разрешением, чтобы позволить атомистической исследования водных сетей и динамики. Пролить свет на выполнении моделирования молекулярной динамики, с и без лиганда в активном центре, влияет на процесс идентификации туннеля будет иметь значение также.

Кинетика мембранных белков может представлять собой сложную задачу ^25. Протокол в данном документе основана на протоколе экстракции простым мембраныдля получения мембранного фермента без использования дорогостоящего оборудования, такого как ультрацентрифуге. Применение гель-фильтрации в качестве конечной стадии полировки удаляет частицы остаточного потенциальных мембраны и обеспечивает определении соответствующей среды моющего ^25.

Ключевым аспектом в достижении воспроизводимые результаты кинетических от протокола является эмульсию субстрата маточного раствора ультразвуком. Простой вортексе гидрофобных субстратов разбавленных в реакционном буфере дает неоднородные субстрат-моющих смесей. Пипетирующем не-эмульгированных решений субстрата приводит к невоспроизводимых концентрациях (подтвержденных количественного GC), что предотвращает точное определение начальных ставок. В противоположность этому, пипетки надлежащим эмульгированных растворов должно привести к линейной регрессии начальных скоростей с ^R 2 в диапазоне 0.98-0.99. Еще один важный аспект гидрофобных субстратов является очевидным растворимость субстратаи наличие в субстрат-моющих смесей. На самом деле, это не было возможно, чтобы насытить тритерпеновых циклазу со ссылкой подложки сквалена. По этой причине очевидно, К _кот / значения К _М представлены здесь, которые могут содержать вклады от обоих связывания и химии. Тем не менее, было показано, что химия ограничение скорости для к _кошке / _К М для polycyclization каскада, проведенного тритерпеновых циклаз ^3.

Это имеет большое значение для проверки фактической температуры внутри реакция стеклянном флаконе с внешним термометром. Тем не менее, линейные подходит может быть беднее для вариантов с необходимым постоянных очевидно K _{CAT /} значений К _{м при} различных температурах. Это подчеркнуто для варианта S168F в данном документе (фиг.2А) с энтальпией активации, близкой к нулю (рис 2В и 2С). Очень Смальл в зависимости от температуры изменения в видимой К _кошки / _К М, может вызвать неопределенность в наблюдаемой энтропии активации Δ S ^‡ (т.е. перехват в линейных участков на рисунке 2B). В принципе, наблюдаемый энтропии активации может также зависеть от другого обилие активных ферментов для различных вариантов, которые не будут обнаружены путем измерения концентрации белка. Ожидается, что экспериментальные ошибки уменьшаются при смешивании несколько подложек в одном горшке. Это потому, что все различные субстраты взаимодействуют с таким же количеством фермента в этих условиях (уравнение 4). Использование экстракционным растворителем с шипами внутренний стандарт важно для учета различий в процессе экстракции и / или GC-инъекции.

Государственная теория Переход был успешно использован в энзимологии ^26. Это важное теоретическое основа была изначально детых для мономолекулярных реакций в газовой фазе. Тем не менее, было показано, что ферменты в основном работают за счет снижения классического активации энергетический барьер ^26. Коэффициент передачи считать один насто щем описании может повлиять на измеряемую энтальпии активации и / или энтропии. Вклад туннелирования, и другие неклассические эффекты, такие как повторного пересечения переходного состояния, может способствовать примерно в 1000 раз катализа ²⁶ соответствует примерно 4 ккал / моль энергии. Видно, что энтропия активации отображается на ферментом дикого типа (16 ккал / моль при 328 К, рис 2С) гораздо больше, чем таких неклассических эффектов, вызванных неоднородным коэффициентом пропускания. Влияние коэффициента передачи должна уменьшаться при сравнении термодинамических параметров активации для дикого типа и туннельных вариантов, использующих протокол.

Свободная энергия Гиббса активации (Δ G ^‡) является компоSed обоих в энтальпической (Δ H ^‡) и энтропийных (- Т * Δ S ^‡) срок. Растворитель реорганизация ферментов во катализа может влиять на оба параметра. Настоящий Протокол, как ожидается, облегчить изучение этих явлений путем сборки соответствующих инструментов и удобный в кремнии вычислительных средств с необходимой биофизической экспериментальной базы. Способ предусмотрено полезными при изучении множество ферментативных процессов, в том числе катализе мембраносвязанных ферментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Программа молекулярного моделирования и симуляции
КАВЕР	CaverSoft	http://caver.cz/	Инструмент для анализа туннелей в белках, свободная лицензия для академического использования
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Количественное определение белка в растворах, содержащих до 1% моющего средства
Гомогенизатор Potter-Elvehjem	VWR	432-0205, 432-0217	Гомогенизация замороженных клеточных гранул
Ингибитор протеазы Коктейль в таблетках	Roche	4693159001	Ингибитор протеазы
Центробежные фильтрующие установки	Millipore	UFC901008	Центробежные фильтрующие установки для концентрации белков, MWCO 10 кДа
Термомиксер	Eppendorf	5382000015	Термомиксер для инкубации проб