Методическая статья

Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS

DOI:

10.3791/53176

⸱

11 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrix-assisted laser desorbtion/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) и молекулярные методы (секвенирование гена 16S рРНК) позволяют идентифицировать редкие бактериальные патогены в рутинной диагностике. Цель этого протокола заключается в сочетании обоих методов, что приводит к получению более точных и надежных данных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть целый ряд редких и, следовательно, недостаточно описаны бактериальных патогенов, которые, как сообщается, вызывают тяжелые инфекции, особенно у пациентов с иммунодефицитом. В большинстве случаев лишь немногие данные, в основном опубликованы в виде сообщений о случаях, доступны, которые исследовать роль таких патогенов, как инфекционного агента. Поэтому для того, чтобы прояснить патогенный характер таких микроорганизмов, необходимо проводить эпидемиологические исследования, которые включают в себя большое количество этих бактерий. Методы, используемые в таком исследовании наблюдения должны соответствовать следующим критериям: идентификация штаммов должно быть точным в соответствии с действующей номенклатуре, они должны быть просты в обращении (надежность), экономичны в рутинной диагностике, и они должны генерировать сопоставимы результаты среди разных лабораторий. Как правило, существует три стратегии для идентификации бактериальных штаммов, в обычной обстановке: 1) идентификация фенотипический характеризующий Biochemicaл и метаболические свойства бактерий, 2) молекулярные методы, такие как 16S рРНК секвенирование гена и 3) масс-спектрометрии в качестве подхода, основанного на романе протеома. Поскольку масс-спектрометрии и молекулярные подходы являются наиболее перспективными инструментами для выявления большое разнообразие видов бактерий, эти два метода описаны. Авансы, ограничения и потенциальные проблемы при использовании этих методов обсуждаются.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Безопасная идентификация редких патогенов в рутинной диагностике мешает тот факт, что классические культурные и биохимические методы являются громоздкими и иногда сомнительна. Кроме того, диагностическая лаборатория микробиологии должен обрабатывать большое количество патогенных микроорганизмов, в пределах от нескольких сотен до нескольких тысяч, ежедневно, что требует использования автоматизированных систем. В дополнение к управлению большой суточной пропускной способности, точная идентификация видов бактерий необходим. Это оправдано , так как они отличаются по своей противомикробной шаблон восприимчивости и , следовательно , правильная идентификация обеспечивает клинициста с необходимой информацией , чтобы выбрать соответствующие антибиотики (например, Enterococcus SPP., Acinetobacter SPP.) 12,43.

Автоматизированные микробные системы идентификации (МАСС) применяются стандартные наборы ферментативных реакций охарактеризовать метаболические свойства бактериальных изолятов 13,15,16,26,27. Несмотря на то, что картриджи , используемые в этих системах используют большое количество различных биохимических реакций, например, 47 в GN карты МАСС , используемой в данном исследовании 52, это позволяет стратегии безопасной идентификации только для ограниченного набора бактерий. Кроме того, база данных, передовая экспертная система, четко сосредоточена на выявлении соответствующих и высоко соответствующих бактерий медицинского значения 13,15,16,36. Две другие системы, широко используемые в лабораториях, а также применять этот биохимический подход для идентификации бактерий. Недавние исследования демонстрируют сопоставимую точность идентификации между МАСС , используемых в данном исследовании , и один из конкурентов (93,7% и 93,0% соответственно), в то время как 3 - й МАСС имеет точность определения только 82,4% на уровне видов 35. Такие расхождения можно объяснить качеством основных ссылок идентификации данных, варианты комплектов и программного обеспечения, различия в MetaboЛМЗС и квалификация технического персонала 35,36.

в основном используются две автоматизированные системы MALDI-TOF MS (MALDI-TOF микробной системы идентификации, mMIS). Эти системы позволяют для обнаружения большого количества видов бактерий на основе их спектров отпечатку пальца белковой массы. Например, база данных содержит mMIS используемых 6000 эталонных спектров. Системы идентификации , основанные на масс - спектрометрии обеспечивают быстрое и надежное обнаружение самых разнообразных микроорганизмов , в том числе редких возбудителей 11,48,51. На сегодняшний день лишь несколько прямых сравнений доступны между mMIS , используемых в данном исследовании , и его конкурент 19,33. Согласно Dæk и др. Обе системы обеспечивают подобный высокий уровень точности идентификации, но mMIS , используемые в данном исследовании , представляется более надежным в идентификации видов 19.

Кроме того, молекулярные методы адресации хорошо законсервированные, но и отдельные гены ( например, 16S рДНК или гроВ) позволяют четко идентифицировать видовой 3,22,61. Среди них 16S рДНК является наиболее широко используется ген домашнего хозяйства из - за его присутствия во всех бактерий 34. Его функция остается неизменной и , наконец, с примерно 1500 пар оснований , достаточно долго , чтобы быть пригодным для биоинформатики 14,34. Многие исследователи считают анализ гена 16S рРНК в качестве "золотого стандарта" для идентификации бактерий 21. Это связано с тем , что немногие лаборатории используют методы ДНК-ДНК гибридизации на сегодняшний день для выявления редких или новых бактерий 14,34. Кроме того, все больше и больше баз данных, доступных , которые могут быть использованы для анализа 50 гена 16S рРНК. Тем не менее, следует принимать во внимание, что системы обнаружения, основанные 16S рРНК имеют ограниченную чувствительность по сравнению со стандартными протоколами ПЦР. Кроме того, молекулярный подход сложный, отнимает много времени и требует высококвалифицированного персонала, а такжеспециализированные лабораторные помещения и, следовательно, не легко реализуется в рутинной диагностике 55. Кроме того, было показано, что комбинация по крайней мере, двух различных методов идентификации бактерий приводит к высоко точной идентификации штамма. Сочетание MALDI-TOF MS и 16S-рДНК секвенирования позволяет идентифицировать большое число различных видов бактерий с высокой точностью. Недавно было представлено сочетание анализа генов MALDI-TOF MS и 16S рРНК для идентификации бактерий изучения эпидемиологических вопросов и редких патогенных микроорганизмов 56.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение ДНК микобактерий

  1. Приготовление раствора PBS
    1. Взвешивают 1,65 г Na 2 HPO 4 х 2H 2 O, 0,22 г NaH 2 PO 4 × 2H 2 O и 8,80 г NaCl в колбу и заполнить дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 7,4. Для конечного использования фильтрации раствора через бактерии-доказательства (0,22 мкм) фильтра.
  2. ДНК Выделение грамотрицательных бактерий
    1. Streak больной материал по соответствующей культуральной среде (например, Колумбийский кровяной агар), идентифицировать и изолировать потенциальных патогенов.
    2. Приготовьте чистую культуру и выполнять окрашивали по Граму, чтобы определить морфотип и подтвердить чистоту и культуры 49.
    3. Выбор одного бактериальной колонии и передать его с 1 мкл одиночного контура с посевом в стерильном 2,0 мл реакционную пробирку, которая содержит 1 мл раствора PBS.
    4. Выдержите эту суспензию в THERMOMIXэр при 95 ° С в течение 10 мин. После инкубации, пусть бактериальный экстракт (содержащий растворенный ДНК) , охлаждают до комнатной температуры и либо использовать его непосредственно для усиления или хранить при -20 ° C для дальнейшего использования (рисунок 1а).
  3. ДНК Выделение грамположительных бактерий
    1. Streak больной материал по соответствующей культуральной среде (например, Колумбийский кровяной агар), идентифицировать и изолировать потенциальных патогенов. Выполните окрашивали по Граму, чтобы подтвердить морфотип культуры.
    2. Приготовьте чистую культуру и выполнять окрашивали по Граму, чтобы определить морфотип и подтвердить чистоту культуры.
    3. Выберите одну колонию бактерий с помощью стерильного 1 мкл петли для инокуляции и приостановить его в 500 мкл раствора PBS в 2,0 мл реакционной трубки.
    4. Добавить 500 мкл стеклянные бусы и передать трубку в колебательный гомогенизатор, работающий при максимальной частоте и амплитуде (50 Гц), в течение 5 мин. Используйте стеклянные бусы диаметром 1,0 ммчтобы разрушить бактериальные клеточные стенки.
    5. Выдержите эту трубку в течение 10 мин при 95 ° С и охлаждают до комнатной температуры. Использование экстракта либо непосредственно для ПЦР-реакции или хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

2. 16S рДНК ПЦР

  1. Получение праймеров для амплификации
    1. С помощью праймеров TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) в качестве прямого праймера и RTU4 (5'-TAC CAG ГГТ ATC ТАА ТСС TGT T-3') в качестве обратного праймера 25. Готовят грунтовку маточного раствора ДНКазой и РНКазы свободной воды, имеющий концентрацию 100 пмоль / мкл (100 мкМ) и разбавить его дальше к рабочему раствору при 10 пмоль / мкл. Хранить грунтовки запас и рабочего раствора при температуре -20 ° C или использовать непосредственно.
  2. Приготовление реакционной смеси для ПЦР
    1. Пипетка по 1 мкл каждого праймера, 1 мкл дНТФ-смеси (100 мМ), 2,5 мкл экстракта ДНК, 5 мкл 10х ПЦР-буфера (содержащего 25 мМ MgCl 2), 0,25 мкл Taq-полимеразы (5 единиц / мкл) и 39,25 мкл DNAse- и РНКазы ПЦР воды в стерильную 200 мкл реакционной трубки.
  3. ПЦР-протокол
    1. Запуск программы PCR построен следующим образом: Во-первых, начальный этап инкубации при 95 ° С в течение 5 мин, который необходим для активации Taq-полимеразы. Во-вторых, 35 циклов амплификации, содержащий 1 мин. денатурация при 95 ° С, 1 мин. Грунтовка стадию отжига при 50 ° С и 1,5 мин праймера стадия удлинения при 72 ° C. В-третьих, окончательное удлинение в течение 10 мин при 72 ° С. И, наконец, ПЦР-реакции охлаждают до 4 & deg; С.
      Примечание: золотистый стафилококк и H 2 O служат в качестве положительного и отрицательного контроля (рис 1b).
    2. Поместите пробирку, содержащую реакционную смесь ПЦР в амплификатор и запустить программу.
  4. После очистки продукта ПЦР
    Примечание: Для очистки ПЦР-продукта, несколько протоколов либоможет быть использован фермент на основе или с адсорбционной матрицы оксида кремния. Одностадийной ПЦР очистки, используемый здесь используются два гидролитических ферментативных реакций. В то время как экзонуклеаза I (Exo I) удаляет одноцепочечной ДНК, креветки щелочной фосфатазы (SAP) гидролизует некорпоративные дНТФ. Вторая процедура основана на кремнезем мембранной методом адсорбции с высокой солью быстро связывания - мыть - низким содержанием соли элюирование цикла.
    1. Добавить 1,5 мкл ферментной смеси, содержащей как Exo I и SAP в 25 мкл ПЦР-продукта, тщательно перемешать и передать в амплификаторе применения простого протокола первые 15 мин при 37 ° С, а затем 15 мин при 80 ° C. Хранить очищенный продукт ПЦР либо при -20 ° С или использовать его непосредственно в качестве мишени для маркировки ПЦР.

3. ДНК Электрофорез в агарозном геле

  1. Подготовка буфера (электрофорез КЭ-буфер)
    1. Титрование 54,0 г (445 мМ) Трис-основание, 27,5 г (445 мМ) борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (10мМ) раствор при рН 8,0 с помощью NaOH в колбу и заполнить его дистиллированной водой до общего объема 1000 мл. Затем разбавляют этот 5х буфер 1:10 дистиллированной водой (0.5x КЭ) для электрофореза.
  2. Подготовка буфера для загрузки
    1. Смешайте 250 мг бромфеноловый синий, 250 мг ксилолцианола FF и 15 г polysucrose (Материалы таблицы) в колбу. Затем залейте его 0.5x TBE буфере до общего объема 100 мл. Алиготе красителем до 1 мл порции и хранят при -20 ° C для дальнейшего использования.
  3. Литье изделий из агарозного геля
    1. Взвесить 6 г стандартного электрофореза в агарозном до 300 мл 0.5x TBE буфере (смотри раздел 3.1.1), в колбе, чтобы подготовить 2% (вес / объем) агарозном геле. Затем поместите агарозном смесь в микроволновой печи, нагреть его точку кипения почти до агарозном полностью не растворится и раствор становится ясно.
    2. Пусть расплавленный агарозы достаточно остыть и добавить 10 мкл 1% (вес / объем) этидий бромида акций Солуции. Налейте раствор в гипсе и поместите гель гребень (с учетом 30 скважин) в гипсе. Удалите гребенку, когда гель полностью затвердевший и поместить гель в электрофорез камеру, содержащую 0.5x TBE буфер.
      Примечание: этидий бромид является токсичным и мутагенными свойствами. Поэтому с ним следует обращаться с осторожностью. Целесообразно использовать нитриловые перчатки. Существуют альтернативные пятна интеркалирующий нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в качестве нетоксичного альтернативы.
  4. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР
    Примечание: Для проверки правильного размера ампликонов ПЦР и для оценки концентрации ДНК очищенный продукт ПЦР разделяют в агарозном геле.
    1. Пипетка 2 мкл загрузочного буфера в реакционную пробирку для ПЦР и добавить 8 мкл ПЦР-продукта. Пипетировать эту смесь в лунки геля. Добавить 8 мкл размера маркера молекулярной массы (ДНК трап) в отдельной скважине, чтобы оценить размер ПЦР-продукта.
    2. Подать заявлениепостоянное напряжение при 10 В / см и остановить электрофорез, как только бромфеноловый синий маркер достиг около ¾ от общей длины геля. Визуализируйте разделенных фрагментов ПЦР с использованием УФ-просвечивания (длина волны 302 нм) и документировать их с помощью системы гель-документации. Оценить количество ДНК путем визуального сравнения с лестницы ДНК. Используйте приблизительно 10 нг в качестве мишени для маркировки ПЦР.

4. Sanger секвенирования

  1. Цикл Секвенирование ПЦР
    Примечание: Выполнить маркировку ПЦР в 10 мкл реакционной смеси с использованием коммерческого набора (Материалы таблицу).
    1. Добавляют 2 мкл 5х реакционного Mastermix 2 мкл препарата ДНК, 1,5 мкл рабочего раствора TPU1 или RTU4 (10 пмоль / мкл) и 4,5 мкл ДНКазы и РНКазы свободной воды.
    2. Поместите эту секвенирования реакционной смеси в амплификатор и запустить другой ПЦР. В общей сложности, процесс 25 циклов, состоящих из стадии денатурации (96 ° С,10 сек), стадии отжига (45-60 ° С, 5 секунд) и стадию удлинения (60 ° С, 2 мин). И, наконец, охлаждают реакционную смесь до 4 ° С.
  2. Очистка Секвенирование реакции
    1. Очищают реакционной смеси маркировки с использованием коммерческих колонок отжима для очистки ПЦР (Материалы таблицу).
    2. Нагрузка 10 мкл реакции секвенирования на предварительно гидратированного матрицы для гель-фильтрации и выполнить стадии центрифугирования при 750 х г в течение 3 мин.
      Примечание: При использовании этой процедуры неинкорпорированные краситель терминаторы удерживаются в гелевой матрице.
    3. Затем высушите водный элюат в вакуумном концентраторе. Центрифуга при 2500 х г в течение 20 мин до 30 при 40 ° С до полной сухости.
    4. Добавьте 10 мкл деионизованной сильно формамида затем денатурация при 90 ° С в течение 2 мин и смесь охлаждают на льду. Пипетка 10 мкл денатурированного образцов на 96-луночный мкл пластины. Хранить высушенный и очищенный продукт ПЦР при -20 & deg; С, если анализкоторые будут проводиться в более позднее время.
  3. 16S рРНК секвенирование гена и анализ последовательности ДНК
    Примечание: Выполнить анализ последовательности на автоматическом секвенсор (Материалы таблицы). Секвенсор используется здесь представляет собой автоматизированную флуоресценция на основе системы капиллярного электрофореза , который анализирует 4 образца одновременно (50 см 4-капиллярный массив) с помощью жидкого полимера , 67 (рис 1в).
    1. Поместите планшет в секвенсор. Написать образец листа (пластины записи) , как это изложено в пункте 2, сохранить его и запустить секвенирования выполнения / анализ , следуя шагам , приведенным в 1.
      Примечание: Продолжительность прогона последовательности составляет 2 ч и обеспечивает данные от 800 до 1000 пар оснований.
    2. Откройте программное обеспечение для анализа последовательности (Материалы таблицу). Данные последовательности приведены в виде текстового файла (.seq) и файл, содержащий electropherogram в том числе значений качества (QV) (.ab1).
      Примечание: База вызова автоматически наформируется с помощью программного обеспечения для анализа последовательности и лежащая в основе electropherogram проверяется визуально (например, высота пика, пик разделения) до последовательности используется для дальнейшего применения.
    3. Сравните сохраненный файл последовательности ДНК в базе данных с использованием NCBI алгоритма BLAST Н.Р. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF МС

Примечание: Масс - спектрометр использует N 2 лазер 337 нм и управляется при помощи специального программного обеспечения управления (материалы таблицы). Спектры записываются в линейном режиме и массовом диапазоне от 2000 до 20000 Да покрыта. Интерпретация данных и распределение баллов по образцам осуществляется в режиме реального времени с помощью программного обеспечения для анализа (таблица материалов) (рис 1d).

  1. Приготовление бактерий для MALDI-TOF MS Analysis
    1. Вырастить бактерии , представляющие интерес (например, Myroides odoratimimus) на Columbia кровяной агар , содержащий 5% лошадиной крови , при 37 ° С в течение от 18 до 24 ч, в зависимости от бактериального штамма (рис 2а). Выполните окрашивали по Граму для проверки морфотипом организма исследуемого, а также чистоту культуры.
    2. Используйте деревянную зубочистку для передачи одного бактериальной колонии на лунку стальной мишени 96-луночного (рис 2b и 2c). Пятно 1 мкл 70% -ной муравьиной кислоты в верхней части сушили на воздухе организма на стальной мишени и оставьте сохнуть в течение приблизительно 2-3 мин.
    3. Затем перекрывают пятно с раствором матрицы 1 мкл, содержащий 50 мг / мл CHCA (α-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в органическом растворителе (50% ацетонитрил, 2,5% трифторуксусной кислоты, 47,5% H 2 O).
      Примечание: Кислотный метод наложения (по способу приготовления пластины) может быть использован для повышения качества масс-спектров. Было показано, что для грамположительных бактерий такой «кислотной атаки» увеличивает оценка васифилисе измеренных спектров 45.
      Примечание: В качестве альтернативы автоматизированной системой подготовки проб (Материалы Таблица) могут быть использованы , в которых контакт свободные места 1 мкл 70% раствора муравьиной кислоты и после первого цикла сушки, 1 мкл раствора матрицы наносят на бактериальную мазка. Образцы затем сушат в стандартных условиях, при относительной влажности 60% и готовы к использованию для анализа.
    4. Пусть мазок с матрицей обложил воздушно-сухой снова в течение приблизительно 5 минут в капот. Этот бактериальный мазок с матрицей применяемой в настоящее время стабильна в течение многих часов.
      Примечание: Бактериальные мазки без матрицы не могут быть стабильными из-за деградации белка.
  2. Выполнение MALDI-TOF MS Analysis
    1. Введение образцов
      1. Откройте программное обеспечение управления наших mMIS (Материалы таблицу).
      2. Проветривайте загрузки образца порт масс-спектрометра, нажав на кнопку IN / OUT прибора.
      3. Откройте порт погрузки после щелчка и вставьте мишень MALDI-TOF MS с высушенной бактериальной мазок плюс матрицы.
      4. Закройте порт и эвакуировать снова. Заметим , вакуум и , когда он достигает 4,5 х 10 -6 мбар начала измерения.
    2. Анализ проб
      1. Откройте программное обеспечение для анализа наших mMIS (Материалы таблицы) и выберите в меню "Файл". Выберите "Новая классификация" и новое окно "MALDI Biotyper в реальном масштабе времени мастера классификации" открывает. Введите имя проекта, например "измерения Myroides project_1, в поле" Название проекта "и нажмите кнопку" Новый ". В соответствии с новым диалоговом окне под названием" Новый проект "название проверки проекта и продолжить, нажав на кнопку" OK ".
      2. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Аналит размещения" открытой. Выбор целевых позиций (например, A1, A2, A3 ...), правый клиск любое выбранное положение (обозначено синим квадратом) и выберите пункт "Добавить образцы". В автоматически открыт таблицы типа представления в образце, имя образца ID и необязательно комментарий. Нажмите на кнопку «Далее», чтобы продолжить.
      3. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Выбор MALDI методов Biotyper" открытой. Выберите "Bruker Таксономию" из "ПСМ из таксономических деревьев" и нажмите кнопку "Далее", чтобы продолжить.
      4. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Резюме проекта" открытое. Проверьте введенные данные, приведенные выше, для реального проекта классификации. Начало классификации запуска, нажав на кнопку «Готово» (Рисунок 2d - е). Измерение начинается автоматически при достижении соответствующего вакуума.
      5. Следуйте классификации работать, пока измерение не будет успешно завершена. Посмотреть таблицу результатов в тон "MALDI Biotyper Realtime Классификация проекта Myroides измерения project_1" откройте меню "View" и нажмите кнопку "Results".
      6. Просмотр "Bruker Daltonics MALDI Biotyper результатов классификации", как HTML-файл в веб-браузере по умолчанию. Печать и сохранить результаты.
    3. Мера тестовый стандарт ежедневно до начала анализа проб для калибровки прибора и выполнения проверки прибора еженедельно (прибор самопроверки).
      Примечание: Во время измерения MALDI-TOF спектров анализируются в реальном времени с помощью программного обеспечения для анализа (материалы таблицы). Список десяти видов с их соответствующих баллов дается и подается в лабораторной информационной системы (ЛИС) для составления отчетов.
    4. Критически оценить результаты MALDI-TOF MS (см репрезентативные результаты) и, в случае необходимости, включать другие тесты, такие как biochemical- и антибиотических профилей чувствительности или 16S рРНК секвенирования генов и, при необходимости, окрашивали по Граму дляназначая бактериальная видов к микробиологической докладу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS является новым, быстрый и недорогой метод для микробиологических рутинной диагностики. Бактериальный идентификация видов путем MALDI-TOF MS производит спектры в основном состоит из рибосомных белков , но и других "очень консервативных белков с функциями дом по поддержанию пострадавших в минимальной степени от условий окружающей среды" 17 .The База данных этого mMIS содержит большой набор эталонных спектров и даже бактерии , которые редко встречаются в клинических ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оба MALDI-TOF MS и 16S рРНК секвенирование гена дают возможность идентифицировать большое количество различных бактерий. MALDI-TOF MS является быстрым и недорогим способом, который прост в обращении и большие базы данных бактериальных масс-спектров доступны. По этой причине, MALDI-TOF MS является быстрым, экономически эффективным и надежным методом для проведения исследований , направленных на скрининг редких бактериальных патогенов 17,20,39,51. В проспективном исследовании сравнивали MALDI-TOF MS с другими ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Энно Джейкобса за его постоянную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CHROMASOLV, вода класса ВЭЖХ, 1 лSigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, Германия270733
Тканевый лизер LTQiagen, Hilden, Германия85600Осциллирующий гомогенизатор
Стеклянные шарики 1,0 ммVWR International, Дармштадт, Германия412-2917
Термомиксер 5436Eppendorf, Гамбург, Германия2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Германия51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U)Qiagen, Hilden, Германия201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')biomers.net, Ульм, Германия -
Обратный капсюль RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)biomers.net, Ульм, Германия -
Мастерамцикл Eppendorf, Гамбург, Германия- Термоцилсер
Реакционная пробирка 1,5 млSARSTEDT, Nü mbrecht, Германия72,692
Реакционная пробирка 2 млSARSTEDT, Nü mbrecht, Германия72,693,005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Германия711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Германия711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Гамбург, Германия-Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 кг)Merck, Дармштадт, Германия1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Германия849006
SmartLadder SF - от 100 до 1,000 bpEurogentec, Lü ttich, БельгияMW-1800-04
Бромфенол синий (25 г)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, ГерманияB0126
Ксилолцианол FF (10 г)Sigma-Aldrich Chemie, Mü nchen, ГерманияX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf,Германия-раствор
бромида этидия 1% (10 мл)Carl Roth, Karlsruhe, Германия2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, Mü nchen,Германия-Системадокументирования геля 
ExoSAP-IT (500 реакций)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Великобритания78201
Buffer (10x) с ЭДТА Life Technologies, Дармштадт, Германия402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Дармштадт, Германия4337450
Hi-Di formamide (25 мл)Life Technologies, Дармштадт, Германия4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Германия63206
3130 Генетический анализаторLife Technologies, Дармштадт, Германия-Секвенатор
MicroAmp оптическая 96-луночная реакционная пластина со штрих-кодомLife Technologies, Дармштадт, Германия4306737
Генетический анализатор 3130, основание пластины 96-луночныйLife Technologies, Дармштадт, Германия4317237
Генетический анализатор 3130, фиксатор пластины 96-луночныйLife Technologies, Дармштадт, Германия4317241
Генетический анализатор 3130, скважина пластинчатые септыLife Technologies, Дармштадт, Германия4315933
Генетический анализатор 3130, полимер POP-7, 7 млLife Technologies, Дармштадт, Германия4352759
Генетический анализатор 3130, 4-капиллярная матрица, 50 смLife Technologies, Дармштадт, Германия4333466
Программное обеспечение для анализа секвенирования 5.4Life Technologies, Дармштадт, Германия-
microflexBruker Daltonik, Бремен, Германия-Our mMIS
VITEK MSbioMé rieux, Nü rtingen, Германия 2nd mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Бремен,Германия-Программноеобеспечение для управления устройством
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Бремен,Германия-Программноеобеспечение для анализа
α-циано-4-гидроксикоричная кислота, HCCA, 1  gBruker Daltonik, Бремен, Германия201344
Калибровочный стандарт пептидов IIBruker Daltonik, Бремен, Германия222570
MSP 96 мишень полированная стальBruker Daltonik, Бремен, Германия8224989
peqGREENpeqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Бремен, ГерманияЧасть No 1836007 Автоматизированная система пробоподготовки
Витек 2 биоМé rieux, Nü rtingen, Германия Наш aMIS
MicroScan Beckman Coulter, Крефельд, Германия2nd aMIS
BD Phoenix™ Автоматизированная микробиологическая системаBD, Гейдельберг, Германия3rd aMIS
i>Staphylococcus aureus subsp.  Ауреус  Rosenbach (ATCC®   25923&торговля;)Американская коллекция типовых культур (ATCC), стандарты LGC, Мольсхайм, ФранцияПоложительный контроль для ПЦР 
<

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521(2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491(2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412(2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289(2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985(2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095(2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16S

Похожие статьи