Методическая статья

Производство двухцепочечной ДНК Ministrings

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53177

⸱

29 февраля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation

В этой статье

Краткое содержание

Линейный ковалентно замкнутый (LCC) минивектор ДНК (министруна ДНК) — это невирусный вектор доставки генов, обеспечивающий высокую эффективность трансфекции и подходящий для любого приложения доставки ДНК. Производственная система проста, быстра и масштабируема in vivo. Следующий протокол содержит наглядные пошаговые инструкции по производству министрун ДНК.

Аннотация

Мы построили линейные ковалентно замкнутые minivectors (LCC) ДНК в качестве невирусных генов доставки вектора альтернативы производится с помощью простой платформы в естественных условиях. Ministrings ДНК обладают повышенный профиль безопасности , а также эффективно доставлять груз в ДНК клеток - мишеней. Обычные ДНК-векторы несут нежелательные прокариотические последовательности, включая гены устойчивости к антибиотикам, CpG мотивов и бактериальными начала репликации, что может привести к стимуляции реакций хозяина иммунологических. Биодоступность обычных ДНК-векторов, осложнен из-за их больших размеров молекул. Их круговая природа может также придавать хромосомной интеграции, что приводит к инсерционного мутагенеза.

Бактериальные последовательности вырезают из minivectors ДНК, оставляя только интерес ген (ГОИ) и необходимых элементов эукариотических экспрессии. Наши LCC ДНК minivectors или ministrings ДНК, лишенные иммуногенных бактериальных последовательностей; Поэтому улучшение е местоEIR биодоступности и ГОИ выражение. В случае вектора интеграции в хромосому, то ministring LCC ДНК будет летально разрушают хромосому хозяина, тем самым удаляя потенциально опасный мутант из популяции пролиферирующих клеток. Следовательно, ministrings ДНК предлагают преимущества 'minicircle' ДНК, устраняя потенциал для нежелательных событий вектор интеграции. По сравнению с обычными плазмидами и их изогенных круговыми, ковалентно замкнутых (КТС) аналоги, ministrings ДНК демонстрируют превосходную биологическую доступность, эффективность трансфекции и цитоплазматический кинетика - таким образом, что они требуют меньших количеств катионных поверхностно-активных для эффективной трансфекции клеток-мишеней.

Мы построили один шаг индуцируемой в системе естественных условиях для производства ministrings ДНК в кишечной палочки, которая проста в использовании, быстрым и масштабируемым.

Введение

Цель состоит в том, чтобы производить масштабируемых количества линейных ковалентно замкнутой (LCC) ДНК minivectors с использованием простой и высокоэффективный одностадийный тепла , индуцируемого естественных условиях ДНК системы производства ministring в. ministrings ДНК обеспечивают безопасную и эффективную невирусный стратегию для доставки ДНК. Они сочетают в себе безопасность векторов LCC с эффективностью minicircles ДНК, а также предложить более безопасную альтернативу вирусные полученные векторы без ущерба для эффективности трансфекции.

Для того, чтобы система доставки трансгенов, чтобы быть успешным, вектор ДНК должна проникать в клетку-хозяина целевой и выражают кодированный трансген (ы). Есть несколько клеточные барьеры, которые необходимо преодолеть на практике, в частности, в системах млекопитающих. Для того чтобы избежать деградации при добавлении сыворотки нуклеаз и иммунной обнаружения с помощью ретикулоэндотелиальной системы, вектор ДНК должна быть био- и иммунной совместимостью с целевой системой. Незащищенный ДНК быстро усваиваются плазмы нуклеази плазмида мембрана состоит из плотных липопротеинов барьеров поэтому ДНК-вектор должен быть способен быстро пересекая плазматическую мембрану клеток-мишеней. После того, как в клетке, векторы должны пройти через цитоплазму и проходят через ядерную мембрану, чтобы войти в ядро ​​для трансгенной экспрессии. Невирусные методы доставки генов сосредоточиться на повышении ткане и клеточной ориентации. Тем не менее, применение обычных плазмид с этими методами снижает эффективность трансфекции в связи с наличием иммуногенных бактериальных последовательностей, которые быстро Silences экспрессию гена 1,2. Обычные плазмиды, как правило, несут гены устойчивости к антибиотикам для поддержания в прокариотических системах. Тем не менее, это может привести к потенциально опасное воздействие на человека хостах или придавать устойчивость к природе хозяев флоры с помощью горизонтальных эффектов переноса генов. Обычные плазмиды также содержат динуклеотид CpG мотивы 2, которые могут вызвать нежелательную реакцию иммуностимулирующее, потенциальноуменьшения или глушителей экспрессии трансгена.

Поскольку они исключительно состоят из эукариотической экспрессионной кассеты, ДНК minivectors, такие как ДНК minicircles 3, являются лучшей альтернативой для доставки гена, они имеют улучшенные характеристики внеклеточную и внутриклеточную биодоступностью и улучшенную экспрессию гена из - за их уменьшенного размера и отсутствием иммуностимулирующих прокариотических элементов 4. Пониженные тарифы размер вектора лучше по отношению к устойчивости к касательных сил , связанных с введением в естественных условиях на целевом сайте 5. Чем выше число копий вектора на единицу массы требует меньшего количества реагента для трансфекции, что приводит к снижению токсичности. Тем не менее, в случае случайного вектора интеграции в хромосому хозяина, циркулярно ковалентно закрыт (CCC) векторов, включая как minicircles ДНК и обычных плазмид, придают молекулярную непрерывность и, следовательно, может привести к инсерционного мутагенеза, который может иметь разрушительные последствия 6. Для сравнения, интеграция линейного вектора ДНК разрушает хромосомы и инициирует пути клеточной гибели, тем самым удаляя мутантной клетки из пролиферирующих популяции клеток и предотвращения инсерционного мутагенеза 7. Минимализма иммунологически определяется экспрессия генов (Midge) векторов 8 и микро-линейных векторов 9 (MiLV) представляют собой векторы LCC ДНК , разработанные в лабораторных условиях . Векторы Мидж выставлен до улучшения экспрессии трансгенов в 17-кратном в естественных условиях по сравнению с обычными плазмидной ДНК векторы 11, и показали обнадеживающие результаты в вакцине 10 и рак 8 генной терапии. Кроме того, из - за кручения структуры LCC minivector, и меньшее количество реагента для трансфекции требуется по сравнению с CCC суперспирализована аналога, тем самым снижая токсичность 7.

Наши усовершенствованные векторы LCC ДНК, ministrings ДНК, продемонстрировали высокую эффективность экспрессии и bioavaiлабильность 7. Кроме того, ministrings ДНК производятся на тепловыделяющей индуцибельная естественных условиях производственной системы в одностадийном, целесообразной и экономически эффективной альтернативой Мидж и MiLV LCC векторы, которые требуют несколько этапов в пробирке. Производственная система ministring ДНК должна быть продемонстрирована простой тепловой индуцируемого процесс , выполняемый в естественных условиях, что делает его экономически более эффективно и легко масштабируются. Эта система эксплуатирует Yersinia энтероколитные бактериофага PY54 происхождения Tel / дружище protelomerase система 12 рекомбинации , чтобы отделить минимальную эукариотической кассету экспрессии из прокариотической плазмиды позвоночника. Мы проектировали клетки кишечной палочки (W3NN) , чтобы выразить Tel protelomerase под контролем теплового индуцируемого промотора бактериофага Х, či [Ts] 857 13. При экспрессии, Тель protelomerase действует на целевых сайтах дружище , присутствующих в "Супер Sequence" (SS) участков , расположенных на плазмиде предшественникас получением LCC продуктов, из которых ministring ДНК затем может быть очищен (рисунок 1). Участки SS на плазмиде предшественника ministring ДНК также кодируют целевые сайты для других рекомбиназ включая Cre рекомбиназой (LOX), символ TELN protelomerase (telRL) и Flp рекомбиназой (FRT), облегчая тем самым производство изогенных LCC и КТС minivectors из одной плазмиды - предшественника. Кроме того, каждый узел СС примыкают с обеих сторон энхансер SV40 (SV40e) последовательностей, которые служат для улучшения ядерной транслокации 14. Мы показали в другом месте , что последовательное добавление SV40e постепенно дает соответствующее увеличение эффективности трансфекции 7. Плазмида предшественник (пДНК MiniString или PDMS) содержит полилинкер (рисунок 1) для облегчения введения любого желаемого гена интереса к транскрипционной слияния с зеленым флуоресцентным репортер (GFP).

ДНК minivector технология можетиспользоваться вместо обычных методов переноса генов, экспрессию репортерных генов, а также оценки в отношении эффективности трансгенной экспрессии в эукариотических системах. ministrings ДНК сочетают биосовместимость и увеличение возможности повышения эффективности трансфекции векторов "мини" с превосходным профилем безопасности линейных ДНК-векторов. Наш надежный один шаг платформы производства быстро и легко производит ministrings ДНК для любого применения переноса генов и предлагает более высокий профиль безопасности.

Протокол

1. Подготовка средств массовой информации и культуры

  1. Для LB + Amp: Приготовьте 500 мл Лурии-Бертани бульона (LB) стерилизовали в автоклаве при 121 ° С в течение 30 мин. Дополнение с ампициллином с получением конечной концентрации 100 мкг / мл ампициллина, и хранят при температуре 4 ° С до тех пор, пока требуется.
  2. Для ТБ + Amp: Подготовка к большой (500 мл или больше) объемов производства ministring. Приготовьте 600 мл стерильной Terrific Broth (TB) стерилизованных с использованием автоклава при 121 ° С в течение 30 мин. Дополнение с ампициллином с получением конечной концентрации 100 мкг / мл ампициллина, и хранят при температуре 4 ° С до тех пор, пока требуется.
  3. Для LB агар + Amp: Готовят стерильные агаром LB, подготовив LB + Amp, дополненной 15 г / л агара. Аликвотные примерно в 15 - 20 мл в стерильные чашки Петри и хранят вверх дном, при 4 ° С до использования.
  4. Подготовьте полосу тарелку W3NN [PDMS] по асептических полосатость W3NN [PDMS] клетки на LB агар + Amp. Инкубируйте overniGHT при 30 ° С, до тех пор, пока отдельные колонии можно наблюдать. Не инкубировать W3NN выше этой температуры, чтобы избежать derepressing выражение protelomerase.
  5. Консерванта передача 5 мл LB + Amp в стерильную пробирку. Подготовка ночной культуры W3NN [PDMS] инокулируя этот объем с одной колонии с щелевой пластины. Инкубируют культуры в течение ночи при 30 ° C в шейкере при 230-250 оборотов в минуту.

2. Фаза роста

  1. Консерванта перевод 10 мл LB + Amp в стерильную 125 мл колбу Эрленмейера и инокуляции 100 мкл ночной W3NN [PDMS] культуры в подготовленную LB + Amp, что делает разведение 1: 100.
    1. Для больших объемов, добавляют 500 мкл ночной культуры в 50 мл TB + Amp в 250 мл колбу Эрленмейера, вместо LB + Amp.
    2. В качестве альтернативы, использовать в качестве второго "представитель" культуры на этапе 2.2.
  2. Инкубируйте в качалке инкубаторе при температуре 30 ° C и 250 оборотов в минуту до тех пор, кульратура достигает середины до поздней лог - фазы, обозначенный оптической плотности (OD) или оптической плотности: A 600 = 0,8. Через 1-2 ч, среда должна начать появляться мутная невооруженным глазом.
    1. Консерванта передача 1 мл культуры на чистую спектрофотометра кювете.
    2. Мера поглощения света с помощью UV-VIS спектрофотометр с длиной волны, установленной на 600 нм. Используйте 1 мл сред, в которых клетки были выращены, чтобы установить пустой (LB или TB). Необязательно использовать репрезентативную культуру, начиная с шага 2.1.3 для этого шага вместо.
    3. Если культура еще не достигла соответствующего ОП, вернитесь к шейкере и проверьте еще раз через каждые полчаса. Проверьте OD чаще, А 600 приближается к 0,8.
  3. Как только культура достигла поздней лог - фазы, обозначенный A 600 = 0,8, асептически перенести культуру в стерильные 50 мл центрифужные пробирки.
  4. Собирают клетки центрифугированием культуры при 10000 х г в течение 10 мин. Проверить на реLLET в нижней части трубы.
  5. Слейте очищенную надосадочную в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов. Не беспокоить осадок клеток.
  6. Повторите шаги 2.4-2.5, пока не будут собраны все клетки.
  7. Повторное приостановить осадок в 100 мкл LB + Amp. Отберите с помощью микропипетки или использовать вихревой смеситель. Для большего производства ministring, повторно приостанавливать осадок из 50 мл ТБ + Amp культуры в 1 мл свежей LB + Amp СМИ.

3. Производство Ministring

  1. Консерванта добавляют 20 мл LB + Amp в 125 мл коническую колбу и нагревают до 42 ° С. Для увеличения производства ministring, подготовить 500 мл LB + Amp, предварительно нагретую до 42 ° С.
  2. Передача ресуспендирования в предварительно нагретую среду.
  3. Инкубируют при 42 ° С и 250 оборотов в минуту до прошлого лог - фазы, обозначенное A 600 = 1,0. Не оставлять 20 мл культуры при 42 ° С в прошлом 1 часа.
  4. Снизить температуру до 37 ° С и оставляют культуру для дополнительные 90 мин. Для получения 500 мл, оставить культуру в течение дополнительного периода индукции 90 - 120 мин и не снижают температуру.
  5. Уменьшить температуру до 30 ° С и оставляют культуру качалке при 200 оборотах в минуту в течение дополнительного периода температура понижающую от 2 часов. Для получения 500 мл, продлить температуру понижения до 4 часов или в течение ночи.

4. Сбор Ministrings

  1. Консерванта передать культуру в стерильные 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга при 10000 мкг в течение 10 мин и проверьте на гранулы.
  2. Декантируют надосадочную жидкость в соответствующий контейнер для биологически опасных отходов, не нарушая гранул. Повторяйте, пока все клетки не были собраны.
  3. Сохраняют осадок для экстракции плазмиды с любой коммерческой добычи и комплектом для удаления эндотоксинов или флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С для последующего извлечения.

Результаты

После экстракции ДНК, остаточной плазмиды-предшественника, LCC прокариотической позвоночника, и ministring ДНК будут восстановлены. Общий выход плазмиды и чистота может быть оценена с помощью спектрофотометра. Чистота оценивается с использованием отношения оптической плотности при 260 нм и 280 нм (А260 / А280), где соотношение 1,9-2,0 является оптимальным. Все LCC и CCC продукты могут быть разделены с помощью электрофореза в агарозном геле (AGE) (рисунок 2). AGE визуализирует результаты ministring производства после тепловой индукции до ministring очистки. Качественная оценка ministring производства может быть сделано на данном этапе путем сравнения интенсивности зонную ministring (2,4 кб) к родительской плазмиды (5,6 кб) (рисунок 2). Ministring ДНК могут быть восстановлены с помощью стандартных протоколов экстракции плазмидной гель после AGE. На рисунке 3 приведены ministring эффективности производства при различных условиях , которые могут произойти во время переносаING вне протокола. Ministring эффективность производства определялась на основе интенсивности полос ДНК с использованием программы анализа производителя. Любая подобная программа денситометрия может быть использована для анализа результатов AGE.

figure-results-1
Рисунок 1:. Обзор ministring производства (А) Родитель вектор содержит полилинкер в транскрипционного слияния с геном - репортером, обрамленное двумя сайтами СС. Позвоночник кодирует бета-лактамазы резистентности к ампициллину , а также содержит несколько уникальных участков разреза с магистралью для пищеварения в пробирке. (В) Описание основного протокола. Шаги 2) Фаза роста и 3) Ministring Производство представлены на диаграмме, чтобы обеспечить общую схему шагов, вовлеченных, подчеркнув простоту протокола. (C) Ministring индукции, Тепло индукции инактивирует термочувствительного репрессора, что позволяет выражение тел с последующим Тель - активности на сайтах СС в родительских плазмид. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Ministring производство после того, как отклонения от протокола. 1: Контроль, 2: неиндуцированном, 3: Заросший, 4: Overinduced, 5: раннее удаление. ДНК ministring составляет примерно 2,4 кб, LCC костяк составляет 3 кб, а pNN9 родитель плазмида 5,6 кб. Интенсивность Полоса ministring и LCC магистральных полос падение с отклонениями от протокола, что указывает на более низкий выход ministring. Слева направо: 1 кб лестницы из New England Biolabs; Контроль, в соответствии с протоколом; Неиндуцированном, нет температуры повышенной передачи; Заросший, температура Дурин на повышеннуюг стационарная фаза; Overinduced, расширенная температура повышенной передачи; Раннее удаление, отсутствие температуры пониженной передачи. Плазмиды экстрагировали с помощью Омега-Биотек EZNA Плазмида Mini Kit. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3:. Эффекты отклонения от протокола о ministring эффективности производства (PE) Результаты представляют собой среднее значение из 3 испытаний. PE оценивается по относительной интенсивности полосы, измеренной с помощью AlphaImager HP после возраста. Отклонения происходят на следующие этапы: контроль, в соответствии с протоколом; Неиндуцированном, без температурного переключении на более высокую на этапе 2; Заросший, температура во время начала повышенной передачи стационарной фазы на этапе 1.6; Overinduced, расширенный температурный переключении на более высокую на шаге 2.3; Раннее удаление, клетки удаляют и экстрагируютбез температуры пониженную на шаге 2.3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы опишем простую систему для производства ministrings LCC ДНК с использованием тепла, индуцируемого протокол один шаг, который не требует никакого специального оборудования, кроме той, которая используется в типичных роста бактерий и манипуляций. ministrings ДНК без кручения, стабильные линейные экспрессии ДНК кассеты, лишенные прокариотических генетических элементов. Они могут быть использованы вместо обычных методов переноса генов, экспрессию репортерных генов, а также в оценках в отношении эффективности трансгенной экспрессии в эукариотических системах. ministrings ДНК сочетают биосовместимость и увеличение возможности повышения эффективности трансфекции векторов "мини" с превосходным профилем безопасности линейных ДНК-векторов. Наш надежный один шаг в естественных условиях эксплуатационной платформы быстро и легко производит ministrings ДНК для любого применения переноса гена без необходимости использования нескольких дорогостоящих процессов в лабораторных условиях .

Есть несколько важных шагов кобеспечить оптимальное производство ministring (цифры 2 и 3). Тепло индукции является наиболее важным шагом на пути к ministring производства. Полное отсутствие ministring производства, скорее всего, из-за отсутствия индукции тепла (клетки сохранившие при 30 ° С), где подавление экспрессии protelomerase предотвращает превращение плазмиды-предшественника к LCC ministring. После индукции протокола тепла, ожидать эффективности производства примерно на 75%. Тепло индукции является оптимальным в то время как клетки в логарифмической фазе. Хотя нет статистически значимой разницы в ministring PE при использовании клеток в стационарной фазе ( "Заросший", рисунок 3), мы сделали наблюдать почти уменьшение общего выхода плазмиды 50%. Урожайность будет зависеть от протокола экстракции плазмиды, использованной. Для оптимального производства ministring, вызвать индукционного нагрева в то время как клетки в логарифмической фазе. Плохое производство ministring, скорее всего, является результатом длительной температуры повышающей или Недостатнт температура понижающей передачи. Длительная температура повышенной передачи не рекомендуется , так как это активизирует E. палочка ответ 15 теплового шока, который может ингибировать активность protelomerase и мешать стабильности плазмиды. Таким образом, выбор времени температуры пониженную является еще одним важным шагом для эффективного производства ministring. Без дополнительного времени инкубации при 30 ° С, ministring эффективность производства было обнаружено, что очень плохо ( "раннее удаление", рисунок 3). Это может быть связано с количеством времени, необходимого для выражения Tel и активности. Происходящий Профаг кодирование PY54 Тел protelomerase обычно инфицирует Yersinia, который оптимально около 28 произрастает ° С 12, что указывает на 30 ° C также может быть более оптимальным для Тель - активности.

Производственная система ДНК minivector использует платформу в естественных условиях для создания высококачественных бактериальных последовательностей свободных minivectors ДНК. Изменения в протоколе может яNCLUDE изменения питательной среды для оптимизации плазмиды и продуцирования белка в целях стимулирования роста клеток во время фазы роста (ТБ вместо LB), или увеличить ministring производства и преобразования эффективности. Для больших объемов культуры (200 мл и больше), температура пониженную и инкубирования при 30 ° С, может быть продлен в течение ночи без сильного негативного воздействия на ministring PE. Мы включили изменения в нашем протоколе на 500 мл культур, в качестве примера. Очистка ministrings ДНК может быть ускорен путем переваривания ин витро эндонуклеазы прокариотических позвоночника. Есть целый ряд эндонуклеаз сайтов - мишеней (например, PI-SCEI, PvuI, ScaI) доступны на прокариотической цепи плазмиды - предшественника, которую можно разрезать , чтобы выставить открытые линейные концы, что позволяет деградации в пробирке прокариот позвоночника. Выделение ministrings из других видов вектор также может быть достигнуто с помощью анионообменной хроматографии мембраны 16.

Один ограничение тока, связанный с системой векторного производства LCC ДНК является необходимость очистки ministring ДНК из других LCC и CCC продуктов. Хотя легко очищают с помощью стандартных методов выделения плазмид, стадии выделения по-прежнему может быть недостатком в условиях крупномасштабной. Разделение ministring может отнимать много времени, используя AGE, если ministring и прокариотической позвоночник LCC слишком похожи по размеру. В качестве альтернативы, анионообменной хроматографии мембраны может обеспечить лучшее разделение ministrings от CCC вида переносчиков 16. Температура может быть повышенной передачи другим потенциальным ограничением , как высокие температуры также активирует реакцию теплового шока в E. палочка, которая негативно влияет на рекомбинантный белок дает 17 и , следовательно , привести к снижению уровня плазмиды ministring преобразования. Мы сообщаем о других оптимизаций производственной платформы , чтобы обойти и / или смягчения таких последствий теплового шока 18. МыТакже в настоящее время методы оптимизации для устранения или уменьшения загрязнения LCC прокариотической магистральную в естественных условиях.

Хромосомная интеграция ministring LCC ДНК разрушает хромосомы хозяина и подвергает клетки к апоптозу. Это не только уменьшить потенциальные негативные последствия инсерционного мутагенеза, таких как онкогенеза и глушителей соседних генов, тем самым улучшая его безопасность; летальный эффект может также служить в качестве идеального способа забивные и замены гена исследований без сопутствующих побочных эффектов и повреждения интеграции. ДНК ministring векторы могут быть применены к передаче и экспрессии генов для терапевтических белков, РНК, антител или антигенов в данной мишени в естественных условиях или заменить ее неправильному или нефункциональные аллеля. Простой один шаг тепла , индуцируемого в естественных условиях производственная система позволяет ДНК ministring векторы быть легко получены для клинического или промышленного применения.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят естественных и технических наук Научно-исследовательский совет Канады (NSERC) для финансирования этой работы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
E. coli W3NNШтамм медифаговдля обработки министрун: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFPMediphageдля обработки министрун: также упоминается как pDNA Ministring (pDMS)
BD Difco Дегидратированные питательные среды: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Scientific 244620Fisher
BioReagents Terrific BrothFisher ScientificBP2468500
BD Bacto Обезвоженный агарFisher Scientific214010
AmpicilinMP Biomedicals LCC2190147
сверхчистый Milipore WaterFisher Scientific Z00Q0V0USМодель: Mili-Q Advantage A10 Система очистки воды
Хирургические перчаткиVWR(S) 82026-424, (M) 82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430         
Тарелки Fisherbrand Petri с прозрачной крышкой с поднятым гребнем (100  х  15  мм)Fisher ScientificFB0875712
30 мл KIMAX ПробиркиVWR89001-448
Спектрофотометр КюветаSarstedt67.74
Стерильный 15 мл Falcon Tubes  BD Falcon62406-200,
Стерильные центрифужные пробирки 50 мл  FroggaBio2930-S0
Falcon Одноразовые полистирольные серологические пипетки 10 млBD Falcon13-675-20
Falcon Одноразовые полистирольные серологические пипетки 25 млBD Falcon13-668-2 
Микропипеттор (100-1,000  μ l)FroggaBioC1000-1
Микропипеттор (20-200  μ l)FroggaBioC200-1
Стерильные наконечники для пипеток (100-1,250  μ l)VWR89079-472 
Стерильные наконечники для пипеток (1-200  μ l)VWR89079-460
Fisher Scientific Экономичная горелкаFisher Scientific03-917Q
Шейкер инкубатора NewBrunswick Scientific M1352-00000
Стерильная колба Эрленмейера (125 мл)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980125 Aldrich 
Стерильная фляга Эрленмейера (250 мл)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980250 Aldrich 
Стерильная колба Эрленмейера (500 мл)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980500 Aldrich 
СпектрофотометрThermo Fisher Scientific335901модель: напольная центрифуга Genesys 10 Vis
BeckmanCoulter 369001Модель: Настольная
центрифугаAvantiBeckman 362114 Модель: GS-6R
Научный аналоговый вихревой смеситель Fisher Fisher Scientific 02-215-365
1 кб Лестница ДНКНовая Англия BioLabsN3232S
Родительская плазмида Fisher J-E

Ссылки

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Линейная ковалентно замкнутая ДНКпродукция in vivoочистка плазмидэлектрофорез в агарозном гелеиндукция путем температурного сдвиганабор для удаления эндотоксиновкультура Escherichia coliген антибиотикорезистентностивектор доставки генов
Производство двухцепочечной ДНК Ministrings
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.