Этот протокол описывает метод препарировать, экспериментально манипулировать и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантата культуры полезны, когда высокий уровень успеха, эффективность и воспроизводимость необходимы, чтобы проверить эффекты плазмид для электропорации и / или реагентов веществ, т.е., ферментативных ингибиторов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетчатка является хорошей моделью для развития центральной нервной системы. Большой размер глаза и, самое главное доступность для экспериментальных манипуляций в яйце / в естественных условиях составляет куриный эмбриональный сетчатки универсальным и очень эффективным экспериментальной модели. Несмотря на то, сетчатке цыпленка легко цели в яйце по внутриглазных инъекций или электропорации, эффективное и точное концентрация реагентов в сетчатке может быть трудно полностью контролировать. Это может быть из-за вариаций точного места инъекции, утечки из глаза или неровной диффузии веществ. Кроме того, частота пороков развития и смертности после инвазивных манипуляций, таких как электропорация достаточно высока.
Этот протокол описывает экс ово техники для культивирования целые эксплантатов сетчатки из куриных эмбрионах и обеспечивает способ контролированной экспозиции сетчатки к реагентам. Протокол описывает, как препарировать, экспериментально манипулировать, и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантаты можно культивировать в течение примерно 24 ч и подвергают различным манипуляций, таких как электропорация. Основные преимущества в том, что эксперимент не зависит от выживания эмбриона и что концентрация вводимого реагента в можно варьировать и контролировать, чтобы определить и оптимизировать эффективную концентрацию. Кроме того, метод является быстрым, дешевым и вместе с его высокой скоростью успеха экспериментальной, она обеспечивает воспроизводимость Результаты. Следует особо подчеркнуть, что он служит в качестве отличным дополнением к экспериментов, проведенных в яйце.
Введение
Сетчатка является частью центральной нервной системы, и это, с его относительной простотой и хорошо характеризуется сотовой архитектуры, популярной модели для изучения развития центральной нервной системы. Глаз эмбриона курицы является относительно большим по сравнению с остальной частью эмбриона. Поэтому легко доступны в яйце для экспериментальных манипуляций, таких как инъекции или электропорации, и служит отличным инструментом для получения знаний о клетке сетчатки и биологии развития в естественных условиях. Несмотря на эти основные преимущества, выживание эмбрионов может быть низким, когда эксперименты являются инвазивными, такие как с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол выполняется в соответствии с рекомендациями в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Ассоциации по исследованиям в видении и офтальмологии".
1. Яйцо Обращение и сбор глаз
- Храните белые Ливорно яйца на 12-14 ° С в течение не более чем 1 недели. Если возможно, используйте охлажденный винный кулер для хранения оплодотворенных яиц.
Примечание: Более высокие температуры магазин привести к неправильному развитию эмбриона, в то время как более низкие температуры увеличивает смертность. Длительное время хранения увеличивает как смертность и аномалии развития. - Выдержите яйца в 37,5 ° C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол описывает подготовку (1А-F) и культивирование целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Этот протокол был успешно использован для целых сетчатки эксплантов из эмбрионов ST20 (E3) в ST31 (E7).
Электропорация плазмид ДНК в целом сетчатки эксплантов позволяет для маркировки и отслеживания сетчатки клеток-предшественников или избыточная экспрессия различных генных продуктов. Для экспериментах электропорации, пигментный эпителий осторожно удаляют из энуклеиров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой работе подробно протокол для вскрытия, электропорации или химической обработки, и культивирования целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах представлена. Этот протокол является простым, быстрым и позволяет как для высокой скорости успеха и воспроизводимость Результаты.
Электропорации целых эксплантатов сетчатки производит большие участки клеток, которые экспрессируют генную конструкцию интереса. Легко правильно расположить электроды и подвергать определенную ча.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Работа была поддержана Barncancerfonden (PR2013-0104), Шведским исследовательским советом (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond и St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (таблетка) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 мм Чашка Петри | VWR | 734-0006 | |
| 100 μ l наконечники для пипеток | VWR | 613-0798 | |
| 1,5 мл одноразовая пластиковая кювета | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-луночная пластина | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 мм чашка Петри | VWR | 391-1998 | |
| 70% этанол | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 ингибитор III | 217714 | Calbiochem | 300 нМ в 0,01% |
| Инкубатор клеточных культур | Thermo Forma | ||
| Препарирующий микроскоп | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Электроды | Platina, изготовленные на заказ | ||
| Электроквадратный поратор ECM 830 | Гарвардский аппарат | ||
| F12 Смесь питательных веществ | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Щипцы | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Замораживающая среда NEG50 | Cellab, Швеция | 6502 | |
| GFP экспрессирующая ДНК плазмида (pZGs) | |||
| Увлажненный инкубатор | Grumbach Brutgeraete GmbH, Асслар, Германия | 8204 | |
| Инсулин | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-глутамин | Life Technologies | 25030024 | |
| монтажная среда ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Парафиновая пленка | VWR | 291-1214P | |
| Параформальдегид | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way для встраивания формы | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Пенициллин стрептомицин | Life Technologies | 15140-122 | |
| Фосфогистон 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Разведение 1/4,000 |
| Платиновые электроды (изготовленные на заказ из "ронделей) | Sargenta | 390-R (ронделлер) | Диаметр: 4 мм, толщина 0,1 мм |
| Платиновые электроды | Sonidel | CUY700P4L | Диаметр: 4 мм |
| Полиэтиленовая пастеровская пипетка | VWR | 612-2853 | |
| Шейкер вращателя | VWR | 444-2900 | |
| Маленькая ложка | VWR | 231-2151 | |
| Сахароза | VWR | 443815S | |
| Белые яйца | Местный поставщик | ||
| Винный холодильник | WineMaster 24, Касо, Берлин, Германия |
Ссылки
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
