Методическая статья

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53210

⸱

12 сентября 2015 г.

 ,  , 
1Department of Physiology & Membrane Biology, University of California Davis

В этой статье

Краткое содержание

Модифицированный метод Лэндиса позволяет парно измерять гидравлическую проводимость отдельных микрососудов в брыжейке нормальных и генетически модифицированных крыс в контрольных и тестовых условиях с использованием методов микроперфузии. Это удобный метод оценки механизмов, регулирующих проницаемость микрососудов и трансваскулярный обмен в физиологических условиях.

Аннотация

Эксперименты по измерению свойств проницаемости микрососудов индивидуально перфузированных обеспечить мост между расследования молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих проницаемость сосудов в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и функциональных свойств обменных целых микрососудистых кровати. Метод, чтобы иглу и заливать венулярного микрососудов брыжейки крыс на и измерения гидравлической проводимости в микрососудов стенки описано. Основное оборудование включает в себя необходимости прижизненной микроскоп с большим модифицированной стадии, которая поддерживает микроманипуляторами позиционировать три различных микроинструментов: (1) скошенной стекла микропипетки, чтобы иглу и заливать микрососудов; (2) стекло микро-обтуратор, чтобы временно блокировать перфузии и позволяют измерять transvascular движения потока воды в измеряемой гидростатического давления, и (3) тупым стеклянной палочкой, чтобы стабилизировать ткань брыжеечной на месте катетеризации. Модифицированный Лэндис микро-окклюзия TechniqUE использует эритроцитов, взвешенных в искусственном перфузат в качестве маркеров transvascular движения жидкости, а также позволяет повторные измерения этих потоков, экспериментальные условия изменились и разницы гидростатического и коллоидного осмотического давления в микрососудах тщательно контролируется. Измерения гидравлической проводимости в первую очередь с использованием управления перфузат, то после повторного катетеризации же микрососудов с тестов perfusates позволяют парных сравнений на ответ микрососудов в этих хорошо контролируемых условиях. Попытки продлить способ микрососудов в брыжейку мышей с генетической модификации ожидаемых изменить проницаемость сосудов были строго ограничены из-за отсутствия длинных прямых и неразветвленных микрососудов в брыжейку мыши, но в последнее время наличие у крыс с аналогичными генетических модификаций, используя CRISPR технологии / Cas9 планируется открыть новые области исследования, когда методы, описанные здесь, могут быть применены.

Введение

Microperfusion в сосудистой входит установка контролируемый поток искусственного перфузату известного состава с помощью микропипетки в кровеносном сосуде обычно меньше, чем 40 мкм в диаметре. Перфузией судно остается в пределах его нормальных условиях ткани и перфузии животного крови до времени катетеризации. При использовании в сочетании с различными видео изображений или флуорометрическими методов, в месте microperfusion позволяет измерять воды и растворенных веществ протекает через стенки микрососудов в условиях, когда движущие силы для этих потоков известны и свойства проницаемости сосудистой стенки может быть непосредственно оценены. Кроме того, путем регулирования состава жидкости, окружающей микрососудов в ткани (перфузату и superfusate), регулирование проницаемости микрососудов и обмена может быть исследована путем предоставления эндотелиальные клетки, формирующие стенки микрососудов подвергаться различным еXperimental условия (агонисты, модифицированные условия перфузии, люминесцентные индикаторы для измерения внутриклеточного состава и сигнализации) для измеренных именно периоды времени (с до часов). Кроме того, ультраструктурных или цитохимические оценки ключевых клеточных структур, регулирующих молекул барьер может быть исследована в тех же микрососудов, в котором проницаемость измеряется непосредственно. Подход, таким образом, образует мост между расследования клеточных и молекулярных механизмов, чтобы изменить функцию эндотелия барьер в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и расследования в интактных микрососудов. Смотрите следующие обзоры для дальнейшей оценки 1-6.

Ограничение microperfusion, что он может быть использован только в микрососудистых кровати, которые являются тонкими, прозрачными и имеют достаточную структурную целостность, чтобы позволить катетеризации со стеклянной микропипетки. В то время как ранние исследования использовали лягушачьи микрососудов брыжейки в тонкой кожной и жабы мuscle 7,8, на сегодняшний день наиболее часто используется в моделях подготовка млекопитающих является крыса брыжейки 9-15. Большинство исследований были сосредоточены на острых изменений в сосудистой проницаемости исследуемой за периоды 1-4 часов, но более поздние исследования были распространены на измерения на отдельных судов 24-72 ч после первоначального перфузии 12,16. Недавно разработанная технология CRISPR, который обещает сделать более генетически модифицированные модели крыс для изучения регулирования проницаемости сосудов 17 следует включить методы, описанные в этой связи должны применяться в венулярного микрососудов брыжейки в этих важных новых моделей крыс.

Метод требует инвертированного микроскопа, оснащенного встроенным микроскопом обычай этапе достаточно большой, чтобы держать и подготовку животных и по крайней мере три микроманипуляторами используется для позиционирования микроинструментов близких к перфузии судна и согласовать перфузии микропипетку с суднаПросвет. Например, пользовательские платформы для стадии ху микроскопа (около 90 × 60 см) могут быть изготовлены из листа толщиной 1 см стального листа с антикоррозийной покрытием. Этап прикреплен к столу инженерно индексом или двух голубей хвост слайды, установленных под прямым углом и поддерживаемых на тефлоновых столбов или шаровые переводов для движения в горизонтальной плоскости. Типичный установка (рисунок 2) имеет много общего с микроскопом и микропозиционированное оборудования, используемого для диапазона прижизненных экспериментов микроциркуляции, таких как те, для измерения одного потока кровеносного сосуда и гематокрита, локальную доставку кислорода кровью перфузии микрососудов, регуляция сосудистого гладкой тонус мышц, и локальное скопление микрососудов флуоресцентных индикаторов, введенных в обращение всей. 18-26

Принципиальной особенностью метода является измерение объемного расхода (J) через об области, определенной поверхности (ы) микрососудов стенки. Для достиженияэто через модифицированной методики Landis описанного здесь простой перевернутый микроскоп является адекватной. Небольшое видео камера установлена ​​на порт изображений и видеосигнала, с добавлением временной базы, отображается на видеомониторе и записаны как в цифровом виде на компьютере или в виде цифрового или аналогового сигнала на видеомагнитофоне. После того, как микрососудов канюлировали часть из микрососудов видимой камере, может быть изменена путем перемещения этап и манипуляторы в качестве единицы, не нарушая катетеризации.

Измерение transvascular потоков может быть также в сочетании с более детальных исследований с использованием флуоресцентного микроскопа сложный с соответствующими фильтрами, таких как установок, используемых для измерения растворенного проницаемости, люминесцентного контроля соотношения цитоплазматического кальция или других клеточных механизмов, и конфокальной микроскопии 6,12,13, 27. Ключевым преимуществом всех подходов microperfusion является способность делать повторные меры, на том же судне, При контролируемом изменении движущей силы, такой как гидростатического и онкотического давлений или индуцированного изменения ответов судна в воспалительных состояний. Наиболее распространенной конструкцией является попарное сравнение измеренного гидравлической проводимости (L P) на том же сосуде с судна первой перфузии с помощью микропипетки, заполненной контрольной перфузату и красной суспензии клеток, чтобы установить состояние базовой линии проницаемости, то со второй пипетки с тестируемым агентом добавлены перфузату. Несколько cannulations возможны цикла повторного после реперфузии с контрольной пипетки.

Настоящий протокол показывает катетеризации и microperfusion из венулярного судна крысы брыжейки записывать потоки воды по всей микрососудов стенки и измерения L P стенки сосуда, полезную индекс проницаемости общего пути для воды и растворенных веществ через неповрежденный эндотелия барьер. Процедура называется модифицированной Landis TechniqUE потому, что первоначальный принцип Landis использования относительное движение эритроцитов в качестве меры transvascular обмен жидкости после перфузии блокируется сохраняется 28, но диапазон условий эксперимента (например, гидростатические и альбумина различия онкотического давления на микрососудов стенки) доступны после microperfusion намного больше, чем в крови uncannulated перфузии микрососудов 8,29.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

О себе этика: Все процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.

1. Предварительное изготовление Микропипетки, Restrainers, и блокаторы

  1. Извлеките несколько чистые боросиликатного стекла капилляров в половине использованием электронного съемник регулируется таким образом, что, когда тянули, растянутый участок трубки составляет около 1 см в длину и две половинки несколько симметрично. Убедитесь, что конус согласуется с размерами на рисунке 1. Используйте обе половинки для Микропипетки, restrainers и блокаторов.
    1. ФАСКА микропипетки использованием воздушным приводом шлифовального круга 30 0,5 мкм наждачной бумагой купались в воде. Установите угол держателя микропипетки так, что она составляет около 30 градусов от горизонтали.
    2. Тщательно вымыть и высушить с помощью микропипетки всасывание тянуть чистый ацетон через наконечник и вверх по валу. Осмотрите микропипетки (1А) с помощью небольшой прямой микроскоп с 4 × 40 × и целей, оснащенных держателя микропипетки крокодил и окуляра сетки.
    3. Выберите микропипетки с открытостью около 50 мкм длиной, с фаской, длина которой / ширине между 3.1 и 3.5 и с резко сужающейся точке, которая помогает проникнуть в жесткие коллагеновые волокна в брыжейки.
    4. Храните 15-20 микропипетки на несколько разных размеров в коробке пыли.
  2. Сделать restrainers используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил стеклянную капиллярную трубку кратко возле Микропламя сформировать тупой конец (рис 1B). Хранить несколько в коробке пыли.
  3. Сделать microoccluders используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил капиллярной трубки под Микропламя и аккуратно согнуть (с помощью адаптера труб., Например, 23G) штраф наконечник (около 4 мм от кончика), чтобы сделать угол близок к 120 градусов к оси ( Рисунок 1С). Марка и хранить несколько.

2. Подготовка животных и хирургии

  1. Обезболить самца (350-450 г) или самок крыс Sprague-Dawley (200-300 г) пентобарбиталнатрием (80-100 мг / кг, Sigma-Aldrich, P3761) с помощью подкожной инъекции; защиты брыжейки, не используя внутрибрюшинного введения.
  2. В течение хирургических операций и экспериментальных протоколов, поддерживать анестезию путем дополнительных инъекций (30 мг / кг) по мере необходимости. Определите глубину анестезии пальца щепоткой или роговицы рефлекс. После завершения экспериментальной процедуры, эвтаназии крысу через пентобарбиталом передозировки или внутри сердечной инъекции насыщенным раствором хлорида калия под анестезией.

3. Подготовить решения и эритроцитов для использования в качестве маркеров потока

  1. Готовят раствор Рингера для млекопитающих superfusate и контроль перфузата раствора (обычно у млекопитающих раствор Рингера, содержащий 10 мг / мл жирной кислотыбесплатно бычий сывороточный альбумин, BSA).
    1. Фильтр Перфузат через 0,2 мкм шприц фильтры для удаления мелких частиц, которые могут блокировать кончик микропипетки; фильтр в небольшом чистом контейнере.
  2. Подготовьте эритроциты, опираясь около 0,2 мл крови из хвостовой вены анестезированных крыс в 20G иглы на небольшом шприца, содержащего 0,05 мл гепарина (1000 ед / мл) и переносят в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую около 14 мл млекопитающих решение раствор Рингера ,
    1. Центрифуга мягко пакет эритроцитов (около 200 × макс г в течение 7 мин). Откачать супернатант и вновь приостановить эритроциты в растворе Рингера.
    2. После центрифугирования и удаления супернатанта в три раза оставить эритроцитарной в нижней части трубы для последующего использования. Следует отметить, что эта процедура снижает тромбоцитов в конечных perfusates до менее 0,1% от нормальных уровней 31.

4. Организовать ткань на животныхЛоток

  1. Бритье брюшко под наркозом крысы снизу пупка до мечевидного отростка. Убедитесь, что выбритый участок простирается вокруг правой стороны (для крыс, размещенной на правой стороне), так что волосы не образуют фитиль обратить superfusate из ткани также. Удалить вырезать волосы с увлажненной марлевой салфеткой или тканью.
    1. Держите кожу с тупым зубчатыми щипцами и сделать центр строки разрез (длиной 2-3 см) через кожу, используя надежное ножницы. Использование штрафа (ирис) ножницы сделать подобный разрез через белой линии, поднимая брюшную стенку с зубчатыми щипцами, чтобы избежать повреждения кишечника.
    2. С животного на боку на лотке для животных, осторожно выньте кишки из брюшной полости с помощью хлопка наконечником аппликаторы-(дерево), смоченные палки в растворе Рингера и тупыми зубчатыми щипцами. Упорядочить кишку в ткани и таким образом, чтобы брыжейки накинутой столба для просмотра через микроскоп заботясь, чтобы избежать прикосновения брыжейки (Потьеntially повреждения микрососудов) либо с пинцетом или хлопка.
      Примечание: Лоток для животных (2А) могут быть построены из оргстекла и требует ткани хорошо (Deep около 3 мм), оптически ясно столба (например, полированный кварц около 2 см диаметром и 5 мм.) И потепления площадку регулируется для поддержания температуры животного. Толщина столба не должна превышать рабочее расстояние объектива.
  2. Расположите лоток животных на сцене микроскопа так, чтобы брыжейки виден через окуляры.
  3. Подставьте самотечных капельного линии постоянно переливать брыжейки раствором Рингера млекопитающих в поддерживаемой при 35-37 ° С. Используйте марлевые тампоны, чтобы держать кишечник в месте, помогают удерживать влагу, и фитиль решение избыточного Рингера с поверхности. Отрегулируйте поток и аспирации стоков для поддержания равномерной толщины superfusate.
  4. Определение целевых венулярного микрососудов, которые являютсянеразветвленные сегменты вниз по течению конвергентной потока, один или два отделения дистальных истинных капилляров. Найти неразветвленную сосуд (в идеале, 600 до 1000 мкм в длину), имеющие оживленное кровообращение и свободной от лейкоцитов, торчащие на стенке емкости.
  5. Поместите тест микрососудов в центре области микроскопа и переместить фиксатор в положение вблизи выбранного катетеризации сайта.

5. Заполните микропипетки и Гора в держатель

  1. Перед cannulating, приостановить эритроциты в перфузат. Добавить 7 мкл эритроцитарной 0,5 мл перфузата в чистом тестовом боросиликатного трубки. Примечание: гематокрита 1-3% может быть использован, но в соответствии гематокрита приведет к последовательной концентрации перфузату любых веществ, поступающих из эритроцитов.
  2. Установите 1 мл шприц с адаптером 23G труб и PE 50 труб (5-15 см длиной). Нарисуйте Перфузат / красный смесь клеток в шприц. Обратить шприц для смешивания и изгнать все пузырьки из трубы иАдаптер. Для повышения эффективности, подходят трубки до нескольких шприцев до начала эксперимента и держать их в свободном поле пыли или полиэтиленовый пакет.
  3. Заполните микропипетки путем продвижения трубки в большом конце микропипетки, пока она не упрется в трапециевидный участок. Применить нежный быстрый толчок на поршень шприца, чтобы заполнить кончик микропипетки. Примечание: маленький ручеек или капель должна быть видна на кончике, чтобы свидетельствовать полное заполнение.
  4. Вывод трубки, мягко нажимая на поршень, чтобы заполнить широкую часть микропипетки вала. Удалить мелкие пузырьки в широком вала тщательно стряхивая микропипетки вал. Примечание: Аналогичная процедура была проиллюстрирована 32.
  5. Поместите микропипетки в держатель пипетки с боковой порт, который позволяет соединение непрерывный жидкости к водяной манометр. Убедитесь, что держатель, который прикреплен к гидравлическим приводом используется для управления очень тонкой продвижение микропипетки, это под небольшим углом (15-25 °)к горизонтали таким образом, чтобы край конуса микропипетки не попал в кишечник или лоток.
  6. Установите гидравлический привод на подвижной микроманипулятора, который имеет X, Y, Z и диски для того, чтобы тесную связь с испытательного сосуда (рис 2).
  7. Регулировка гидростатическое давление, приложенное к жидкости в микропипетки с помощью шприца или заполненный водой резиновую грушу, чтобы изменить высоту жидкости в толще воды манометра до около 40 CMH 2 O выше брыжейки.
  8. Иглу микрососудов как можно скорее после заполнения пипетки; эритроциты оседают на дно пипетки, так что после примерно 40 мин очень мало эритроцитов будет течь в сосуд.

6. Microcannulation и Микрососудистой Измерение давления

  1. Перед установкой заполненный микропипетки под микроскопом, осторожно нажмите на фиксатор ткани вблизи микрососудов применения достаточную силу для захвата ткани. Нарисуйтефиксатор обратно, слегка растягивая ткань в соответствии с микрососудов, так что напряжения в брыжеечных коллагеновых волокон приведены в соответствие с судна.
    1. Совместите микропипетку с судна и опустите его в поле зрения через окуляры. Поместите наконечник непосредственно перед выбранной катетеризации сайта и опустить его на ткань так, чтобы она частично препятствует потоку внутри емкости, но не закрывают его.
  2. Иглу судно при движении пипетки медленно в просвете сосуда, используя гидравлический привод. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть нижней стороне судна.
    Примечание: В микропипетки вводит просвет, перфузат быстро моет крови в сосуде из просвета и перфузату свободно течет в циркуляционном дистальнее животного в испытательную микрососудов, вытесняя некоторые из нормального кровотока в сосудах ниже по течению.
  3. Опустите перфузионное давление, регулируя манометр до крови (как указанокрасные клетки животного) втягивается обратно в перфузии сегменте; это определяет давление баланса, где эритроциты аккуратно колеблются в просвете сосуда и измеряет гидростатическое давление микрососудов (Р с) на дистальном конце микрососудов сегмента. Поддерживать судно перфузии при всех давлениях выше этого давления баланса.

7. Microocclusion и сбор данных

  1. Необязательный шаг: Перед использованием микро-окклюдер блокировать судно, нажмите его в ткани в неиспользуемом области брыжейки далеко от судна так, чтобы кончик накапливается штраф площадку ткани, которая защищает экспериментальную судно во время повторного микро- окклюзии.
  2. Поместите блокатор выше перфузии судна вблизи нижнего края области микроскопа.
  3. Запишите следующее с видео и аудио.
    1. Устно записать расположение блока сайте и нижний края экрана, как показано на окуляр визира.
    2. С кончикаблокатора размещены чуть выше микрососудов, использовать мелкий контроль г в микроманипулятора мягко опустите блокиратор, пока поток в сосуде не поглощается. Обратите внимание на давление манометра (Р) об аудио. Применить окклюзии, как правило, 3-10 сек, а затем отпустите, восстановление бесплатный перфузии. Перемещение сайт загромождать судна в направлении кончика пипетки в 5-10 мкм шагов в зависимости от времени (> 5 мин после первоначального блока на сайте), количество включений (3-5), чтобы предотвратить повреждение сосудов стенки при блоке сайта ,

8. Анализ данных и измерения L р (Водопроницаемость)

  1. Во время воспроизведения видео, определить начальную расстояние (l 0) из маркера эритроцитов к окклюзии сайта с помощью изображением микрометра и известных положений на изображениях. Определить начальную скорость (dℓ / DT) маркера клетки от его положения в нескольких кадрах в течение 3-10 сек записанных изображений. Удерживатьмой радиус сосуда (г) из снимков, сделанных во время окклюзии (рис 3).
  2. Рассчитать J V / S для каждого окклюзии как (dℓ / DT) × (1 / л 0) × (R / 2). Рассчитать L P при постоянном давлении в (J V / S), деленное на давление вождения в (микрососудов давления - эффективного осмотического давления коллоидной; см Обсуждение).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 4 показаны результаты от измерения временной ход изменений в L р у крысы венул микрососудов канюлированную последовательно четыре perfusates. 33 Величина L P, рассчитанной при постоянном давлении, использовали в качестве показателя изменений микрососудов стенки проницаемости, прежде в контрольной состоянии с перфузатом, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, то, когда судно подвергается противовоспалительное средство брадикинина (BK) с использованием ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подробная информация о L расчетов стр. Несмотря на то, transvascular движение жидкости происходит в то время как судно свободно перфузии, такой обмен слишком мал, чтобы быть измерена в свободное перфузии, потому что это, как правило, меньше, чем 0,01% от стоимости перфузии сосудов. Однако, когда перфузия временно остановлен окклюзии микрососудов, transvascular поток (т.е. фильтрации) измеряется от движения маркерных эритроцитов в просвете как столба жидкости между маркером эритроцитов и мест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов HL44485 и HL28607.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
МИКРОСКОП, СТОЛ И СТОЛИК
инвертированный микроскоп (металлургического типа) с тринокулярной головкой для видео: напримерOlympusCK-40пытается расположить окуляры выше относительно столика - вам придется смотреть через окуляры, протягивая руку к верхней части столика через промежуточные микроманипуляторы
инвертированный микроскоп (металлургический тип) с тринокулярной головкой для видео: напримерLeicaDMILпопытайтесь расположить окуляры выше относительно сцены - вам придется смотреть через окуляры, дотягиваясь до верхней части сцены над промежуточными микроманипуляторами
узкого диаметра, большим рабочим расстоянием: примерNikonNikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform - 1/2 дюйма или 1 смсварочный цех, это должно быть тяжелым для уменьшения вибрации
Таблица Unislide x-y: слайды с голубиным хвостомVelmexAXY4006W1
VIDEO
CCD видеокамера: примерPulnixTM-7CN (больше не выпускается)нет необходимости в цвете
система видеозахвата со звуком--общая
система воспроизведения видео (полностью неподвижный кадр, покадровое движение)
маленькая
МИКРОМАНИПУЛЯТОРЫ, ДЕРЖАТЕЛИ
микроманипуляторы, XYZ (3)Приор/Стоэлтинг (больше не доступен)ищите тонкий Z, и больший диапазон хода в грубых приводах для простоты позиционирования
гидравлического зонда привода, в одну сторонуFHC50-12-1Cнужно купить либо ручной привод, либо электронный привод
ручного барабана FHC50-12-9-02
или гидравлический привод, 3-ходовойSiskiyou CorporationMX610 (1-ходовой) или MX630 (3-ходовой)отлично подходит для коротких рук, заполнен водой и должен быть отправлен обратно для заправки ~ каждые 2 года
соединители / стержни / держателиSiskiyou CorporationMXC-2.5, MXB и т. Д.
штифтовые тискиStarrett162Cдля удержания удерживающего устройства
держатель пипеткиWorld Prescision InstrumentsMPH3
водяной манометр ~120 см
ЛОТОК
прозрачный плексиглас для микроскопа лоток для животных
3/4 дюйма полированный кварцевый диск ~ 1/4 дюйма высотойКварц Сайентиал Инк.custom ( или полированное оргстекло, стекло); убедитесь, что высота объектива меньше рабочего расстояния объектива
Клей из плексигласа (Приварной 4: ОСТОРОЖНО КАНЦЕРОГЕН)
медицинский клей для тканевого колодцаNuSilMED-1037
Универсальный термоковрик из силиконовой резины, 5 дюймов Д x 2 " ВтКоул ПармерEW-03125-20нагреватель для лотка для микроскопа - требуется шнур и контроллер - доступна
версия 240 ВАдаптер шнура питания для каптоновых нагревателей и комплектов, 6 футов, 120 В переменного токаCole ParmerEW-03122-75
STACO 3PN1010B Контроллер переменного напряжения, 10 А; 120 В вход, 0-140 В на выходеCole ParmerEW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
вертикальный съемник пипетокSutter Instrument CompanyP-30 с нихромовой нитью
1,5 мм OD тонкостенная капиллярная трубкаSutter Instrument CompanyB150-110-10
пипетка для шлифовки воздушных камней и диссекционный микроскоп -- см. ссылку в текстеили приобрести пакет от Sutter Instruments или World Precision Instruments
RX Honing Machine, System IIRX Honing Machine CorporationMAC-10700 Rx System II Machineальтернатива воздушному камню, использование с препарирующим микроскопом, установленным под углом
    с керамическим точильным дискомRX Honing Machine Corporationиспользовать "как есть" или прикрепить притирочную пленку притирочную пленку
листы, 0,3 или 0,5 мкм3Мартикул No 051144 80827268X Imperial притирочная пленка листы с клейкой обратной стороной - можно приобрести на Amazon
, из листовой сталимикрофонМИКРОСКОПА

Ссылки

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

intravital

Похожие статьи