Методическая статья

VDJ-SEQ: Глубокий анализ последовательности перестроенных тяжелой цепи иммуноглобулина ген Reveal Клональный Evolution Узоры клеточной лимфомой

26.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53215

⸱

28 декабря 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает подход к исследованию рекомбинированных областей VDJ тяжелой цепи иммуноглобулина лимфом путем глубокого секвенирования и извлечения перестройки VDJ и статуса соматической гипермутации для определения клональной архитектуры отдельной опухоли. Сравнение клональной архитектуры между парной диагностикой и образцами рецидива выявляет режимы клональной эволюции рецидива лимфомы.

Аннотация

Понимание клональность опухоли имеет решающее значение для понимания механизмов, участвующих в онкогенеза и прогрессирования заболевания. Кроме того, понимание клоновых изменения состава, которые происходят в опухоли в ответ на определенный микро-среды или лечения, может привести к разработке более совершенных и эффективных подходов к искоренению опухолевые клетки. Тем не менее, отслеживание опухолевые клоновых субпопуляций был сложным из-за отсутствия различимых маркеров. Чтобы решить эту проблему, А VDJ-след протокол был создан, чтобы проследить закономерности эволюции клоновых диффузного большой клеточной лимфомой (В-ККЛ) рецидива эксплуатации VDJ рекомбинации и соматической Гипермутационный (ГИМ), два уникальных особенностей клеточных лимфом.

В этом протоколе, следующего поколения секвенирования (NGS) библиотеки с индексирования потенциала были построены из усиливается переставить тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) VDJ области от пар первичной диагностики и рецидивов В-ККЛ SAMPле. В среднем более полумиллиона VDJ последовательности в образце были получены после секвенирования, которые содержат как VDJ перестройку и информацию SHM. Кроме того, индивидуальные трубопроводы биоинформатики были разработаны, чтобы полностью использовать информацию о последовательности для характеризации IgH-VDJ репертуара в этих образцах. Кроме того, трубопровод позволяет реконструировать и сравнение клонального архитектуры отдельных опухолей, что позволяет рассмотрение клонального неоднородности в диагностике опухолей и вычета клоновых линий развития между диагнозом и рецидивом опухоли пар. При применении этого анализа к нескольким парам диагноз рецидива, мы обнаружили ключевую доказательства, что несколько Отличительной опухолевые эволюционные модели может привести к ККЛ рецидива. Кроме того, этот подход может быть расширен в других клинических аспектов, таких, как определение минимальной остаточной болезни, мониторинга прогресса рецидивов и ответа на лечение, и исследование иммунного репертуараES в условиях не-лимфомы.

Введение

Рак является заболеванием клональный. С тридцать лет назад, когда Питер К. Ноуэлл предложил рака клонов эволюции модель 1, многие исследования пытались вскрыть клоновых населения в образцах опухолей и реконструировать клоновых расширения и эволюции моделей, которые лежат в основе процесса онкогенеза 2. Недавно вся-секвенирование генома позволило следователям сделать глубокий взгляд на клоновых неоднородности и эволюции 3,4. Однако из-за отсутствия разрешимыми маркерами во многих типах клеток, трудно сделать вывод о точной клонального архитектуру и эволюционный путь. К счастью, есть естественный клональность маркер зрелых В-клеток, из которых многие лимфоидных злокачественных новообразований, в том числе ДВККЛ, происходят. В ответ на антигенной стимуляции, каждый В-клеток могут образовывать единую производительную последовательность IgH VDJ путем присоединения V H (переменная), А D (разнообразие), и J Н (присоединение) сегмент вместе с большим бассейном этих сегментов. В этот прocess, небольшие порции исходной последовательности могут быть удалены и дополнительные не-шаблонный нуклеотиды могут быть добавлены, чтобы создать уникальный VDJ перегруппировку. Эта специфическая VDJ перестановка может быть унаследован по всей потомства этого B-клетки, поэтому пометки индивидуальный зрелые B-клетки и ее потомства 5. Кроме того, ШМ происходит на рекомбинантных последовательностей VDJ в последующем зародышевых центров (GC) реакции вводить дополнительные мутации для расширения пула антител и повышению аффинности антител 6. Поэтому, сравнение и сопоставление VDJ и SHM модели образцов лимфомы, которые прошли эти процессы, внутри опухоли неоднородность может быть очерчен и клональной путь эволюции болезни может быть выведена.

Ранее VDJ перегруппировки и ШМ могут быть идентифицированы с помощью ПЦР амплификации рекомбинантных регионы, клонирование продуктов ПЦР, а впоследствии метод сэнгера получить информацию о последовательности. Этот подход яS низкой пропускной и низкий выход, получения лишь очень небольшую часть всей рекомбинированного VDJ репертуара, и препятствуя характеристику общей представленности клоновых населения в данном образце. Модифицированный подход был создан генерации NGS секвенирования индексированные библиотеки из продуктов ПЦР VDJ и выполнения PE 2х150 п.о. последовательности, чтобы получить более чем полмиллиона рекомбинированные VDJ последовательности на образец. Кроме того, пользовательский трубопровод был разработан для выполнения контроля качества (КК), выравнивания фильтр VDJ последовательности считывает чтобы идентифицировать и перегруппировки ГМС каждого считанного и выполнять филогенетического анализа на клональной архитектуры каждого образца. Кроме того, новый подход был создан для дальнейшего характеризуют клоновых модели эволюции для образцов, собранных на разных стадиях заболевания.

Мы применили этот метод к образцам пациентов DLBCL. В-ККЛ является агрессивная форма неходжкинской лимфомы с частыми рецидива в срок до одного-гоIRD пациентов 7. ККЛ рецидивы обычно возникают рано, в течение 2 3 лет с момента первоначального диагноза, хотя некоторые происходят через 5 лет 8. Прогноз на рецидив пациентов плохое, только с 10% достижения 3-летняя выживаемость без прогрессирования в связи с ограниченными возможностями лечения. Это является основой для настоятельной необходимости новых подходов для лечения В-ККЛ рецидив 9,10. Тем не менее, молекулярные механизмы, связанные с ККЛ рецидива по-прежнему в значительной степени неизвестны. В частности, роль клонального неоднородности в диагностике и клонального эволюции в процессе развития рецидивов В-ККЛ в настоящее охарактеризованных, что делает его трудно определить точную и полезную биомаркеров для прогнозирования рецидива. Для решения этих вопросов, мы применили наш VDJ-секвенирования подход на нескольких пар подобранных пар проб ККЛ первичный диагноз рецидива. Два различных клоновых эволюционные сценарии рецидива появились из сравнения клоновых архитектур между диагнозом и рецидивом SAMPле, что предполагает несколько молекулярных механизмов могут быть вовлечены в ККЛ рецидива.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Усиление VDJ

1.1) выделения ДНК из образцов опухолевых

  1. Извлечение ДНК из тонких срезов (10-20 мкм), замороженных ОКТ встроенных нормальных или злокачественных тканей.
    1. Дайджест 10-30 тонких срезов ткани встроенного режут криостата микротома в 4 мл лизирующего буфера нуклеиновых (0,0075 М трис-HCl, рН 8,2; 0,3 М NaCl; 0,002 М Na 2 EDTA) протеиназой К (0,5 мг / мл, конечная концентрация ) и 0,625% SDS в 15 мл центрифужную пробирку в водяной бане при 37 ° в течение ночи.
    2. Добавить 1 мл насыщенного NaCl (5 м) в обрабатываемой смеси и интенсивно встряхнуть в течение 15 сек.
    3. Центрифуга при 1100 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Передача супернатант к новому 15 мл центрифужную пробирку и добавить два тома 100% этанола.
    5. Смешать переворачивая пробирку 6-8 раз. Центрифуга при 5000 х г в течение 60 мин при 4 ° С для сбора осажденного ДНК.
    6. Промыть ДНК гранул в два раза 70% -ным этанолом. Центрifuge в 5000 мкг в течение 15 мин каждый раз собирать осадок.
    7. Растворите ДНК в 100-400 мкл ТЕ-буфера при комнатной температуре в на шейкере в течение ночи. Выход ДНК составляет от 5 до 200 мкг (конечная концентрация между 50-500 нг / мкл) в зависимости от размера ткани
  2. Извлечение ДНК из тонких срезов (10-20 мкм), фиксированных формалином, paraffin- встроенного (FFPE) нормальной или злокачественной ткани.
    1. Выдержите парафиновых срезов в 1 мл ксилола в два раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждый раз в 1,5 мл трубки микроцентрифужных де-paraffinize. Сбор срезах тканей центрифугированием при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Инкубируйте разделы в 1 мл 100% -ного этанола в два раза при комнатной температуре 10 мин, каждый раз, чтобы удалить остаточные ксилолы. Сбор срезах тканей центрифугированием при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Парафин полностью растворяется в этой точке и только секция ткань остальные.
    3. Высушите разделы при комнатной Temperature в течение 10-15 мин.
    4. Делают 0,5 мг / мл протеиназы К раствора 1x ПЦР буфера (10x разбавленного из ПЦР буфера с нуклеазы без воды). Добавить раствор протеиназы К в образцах в конечном объеме 50-100 мкл на и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
    5. Тепло образцов при 95 ° С в течение 10 мин, чтобы инактивировать протеиназы К.
      Примечание: На этом этапе, образец ДНК растворяли в буфере для ПЦР и могут быть использованы на этапах 1.2 и 1.3 непосредственно. Выход ДНК составляет от 0,5 до 20 мкг (конечная концентрация между 10-200 нг / мкл) в зависимости от размера ткани.

1.2) Оценка качества ДНК

  1. Смешайте 0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы с 45 мкл мастер смеси из коммерческого набора лестницы в ПЦР-пробирку.
  2. Добавьте 5 мкл ДНК, полученной из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз.
  3. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C для7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и выдержка при 15 ° С.
  4. Приготовьте 2% агарозном геле в ТВЕ (Трис / ЭДТА / боратном).
  5. Смешайте 20 мкл ПЦР-реакции с 4 мкл 6x красителем, и загружают на 2% агарозном геле.
  6. Пятно агарозный гель с 0,5 мкг мл этидия бромида раствор / и выявления продуктов ПЦР с системой гель воображения. Примечание: образцы, которые дают 5 продуктов ПЦР при размерах 100, 200, 300, 400, 600 и BP будут по-прежнему генерировать VDJ ампликоны.
    ВНИМАНИЕ: этидий бромид является мощным мутагенным. Обращайтесь с особой осторожностью носить защитные механизмы, т.е. перчатки, и выбросить в конкретных контейнеров в руководящих учреждения.

1.3) VDJ ПЦР

1.3.1) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 1 (IgVHFR1)

  1. Смешайте 45 мкл мастер смеси на этикетке трубкиред как "Mix 2" коммерческого соматических IGH Гипермутационный анализа для обнаружения гель комплект, 0,25 мкл полимеразы Taq ДНК, и 5 мкл образца ДНК, полученного из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку.
  2. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C в течение 7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и выдержка при 15 ° С.
  3. Решение весь продукт ПЦР в 2% агарозном геле методом электрофореза.
  4. Пятно агарозный гель с 0,5 мкг мл этидия бромида раствор / и выявления продуктов ПЦР с системой визуализации геля. Моноклональное ампликона, как ожидается, с размером от 310-380 п.о..
  5. Вырежьте часть геля, содержащего моноклональное ампликон между 310-380 б.п..
  6. Очищают ДНК из вырезанной геля, используя стандартный набор Gel Extraction согласно протоколу производителя. Примечание: для образцов, которые FR1 фрагменты можно было бы получить, нет необходимости подробно IGVHFR2 и IgVHFR3.

1.3.2) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 2 (IgVHFR2)

  1. Смешайте 45 мкл мастер смеси из трубы, обозначенный как «Tube B" коммерческого IGH Джин Клональность анализа для обнаружения комплект гель, 0,25 мкл полимеразы Taq ДНК, и ДНК образца 5 мкл полученного из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку ,
  2. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C в течение 7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и оставляют при температуре 15 ° С.
  3. Решение весь продукт ПЦР в 2% агарозном геле методом электрофореза.
  4. Представьте ПЦР продукт (ы) с помощью 0,5 мкг мл этидий окрашивания / бромид. Моноклональное ампликона может наблюдаться в диапазоне размеров от 250-295 п.о..
  5. Вырежьте часть геля, содержащего моноклональное ампликон между 250-295 б.п..
  6. Очищают ДНК из вырезанной геля с использованием стандартного гель экстрактионный комплект в соответствии с протоколом производителя.

1.4) Оптимизация VDJ ПЦР

  1. Используйте следующие модифицированные условий ПЦР амплификации IgVHFR1 и IgVHFR2 использованием субоптимального ДНК: 95 ° С в течение 7 мин, 40 циклов при 95 ° С в течение 60 сек, 60 ° С в течение 60 сек и 72 ° С в течение 90 сек, конечным удлинением при 72 ° С в течение 10 мин.

2. VDJ Amplicon Библиотека Подготовка и секвенирование

2.1) Подготовка Библиотека

2.1.1) Конец ремонтно-

  1. Перевести VDJ ПЦР-продукта от 1,3 в ПЦР-пробирку и добавить ресуспендирующего буфера от образца ДНК Подготовка комплекта, чтобы поднять объем до 60 мкл.
  2. Добавить 40 мкл Конец ремонтной смеси из образца ДНК комплектом подготовки и тщательно перемешать.
  3. Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 30 мин в предварительно нагретой амплификаторе (30 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.
  4. Смешайте 136 мкл магнитные шарики и 24 мкл ПЦР гРаде вода сначала в 1,5 мл трубки, а затем перенести всю реакцию конечного ремонта от 2.1.1.3 в 1,5 мл трубки и хорошо перемешать с решением бисером.
  5. Место труб на магнитной подставке в течение 2 мин, чтобы позволить разделение гранул из раствора. Аспирируйте супернатант, и промыть шарики 80% свежеприготовленным EtOH дважды в то время как трубка на магнитной подставке.
  6. Аспирируйте этанольного раствора полностью и позволяют бусинки высохнуть на воздухе в течение 15 мин при комнатной температуре в течение 15 мин.
  7. Возьмите трубку от магнитных стоять и ресуспендируют бисером в 17,5 мкл буфера ресуспендирования.
  8. Место трубки назад на магнитной подставке на 2 мин в отдельных шариков из ресуспендирующего буфера. Снимите ресуспендирующего буфера (конец ремонтно-продукт суспендируют в буфере для ресуспендирования сейчас) в чистую ПЦР-пробирку.

2.1.2) А-хвостохранилище

  1. Добавить 12,5 мкл А-хвостохранилища смесь в пробирку, содержащую ПЦР Конец ремонта продукт и тщательно перемешать.
  2. Инкубируйте ПЦР-пробирку при 37 ° С в течение 30 мин в предварительно нагретой амплификаторе (37 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.

2.1.3) Адаптер Лигирование

  1. Добавить 2,5 мкл буфера ресуспендирования, 2,5 мкл Ligation Mix, и 2,5 мкл ДНК Индекс Адаптер в реакции A-хвостов.
  2. Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 30 minl в предварительно нагретой амплификаторе (30 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.
  3. Добавить 5 мкл буфера для лигирования Stop в каждой реакции и тщательно перемешать.
  4. Смешайте 42,5 мкл хорошо смешанные магнитных шариков, чтобы очистить реакцию, выполнив шаги 2.1.1.5 до 2.1.1.8. Добавить 50 мкл буфера ресуспендирования для элюирования адаптера лигируют-продукт.
  5. Очистите адаптер лигировали продукт во второй раз с помощью 50 мкл хорошо смешанные бусины AMPure XP, и элюируют продукт в 25 мкл буфера ресуспендирования в чистую ПЦР-пробирку.

2.1.4) Фрагменты ДНК Усиление

  1. Добавить 5 мкл ПЦР-праймер коктейль и 25 мкл ПЦР Master Mix для ПЦР пробирку, содержащую адаптера лигированную продукт и тщательно перемешать.
  2. Выполните усиления в запрограммированный амплификаторе при следующих условиях: 98 ° С в течение 30 сек; 10 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 сек; Затем 72 ° С в течение 5 мин и выдержка при 10 ° С.
  3. Очистка реакцию с помощью 50 мкл хорошо перемешанной магнитных шариков, и элюируют конечного продукта в 30 мкл буфера ресуспендирования.

2.1.5) библиотека проверки

  1. Количественно конечный продукт с использованием протокола флуорометра производителя. Конечная концентрация библиотека между 2,5 до 20 нг / мкл.
  2. Оценить качество конечного продукта с помощью аналитический инструмент с чипом Высокая чувствительность ДНК в соответствии с протоколом производителя. Ожидайте одну полосу с ожидаемым размером для любой IGVHFR1, IGVHFR2 или IGVHFR3. Электроннаяxpected размер библиотеки продукта равен размеру исходного VDJ ампликона плюс размер адаптеров (~ 125 п.н.).

2.2) VDJ-ПЦР Библиотека Объединение и последовательности

  1. Рассчитать молярность каждой фракции библиотеки, используя следующую формулу: = нМ [(нг / 1000) / BP * 660] · 10 9, где нг является концентрация библиотеки VDJ-ПЦР, полученного на шаге 2.1.5.1 и кип пик размер библиотеки VDJ-PCR измерять на стадии 2.1.5.2.
  2. Развести библиотеку на 2 нМ (всего 10 мкл) с ДНКазы без воды.
  3. Комбинат 10 мкл разбавленных 2 нм библиотек вместе в 1,5 мл трубки.
  4. Добавить равный объем PhiX шип-контроль в 1,5 мл трубки.
  5. Загрузите бассейн в концентрации 7 вечера на в проточной ячейке.
  6. Последовательность библиотеки, используя парноконцевое 150 цикла секвенсор в соответствии с протоколом производителя.

Анализ данных 3.

Примечание: Суммичных из биоинформатики сценариев, используемых в этом разделе можно найти в дополнительном файле кода.

3.1) Выравнивание и КК

  1. Карта парноконцевое последовательности читает против человека IGH V, D и базы данных J область с веб-сайта IMGT 11 с использованием адаптированной нуклеотидной алгоритм взрыва на основе "BLASTN" доступной из NCBI с зазором открытых казни 2, расширение гэпа 1, Длина слова 7, и адрес электронной пороговое значение 10 -4. Откажитесь от чтения-пару не отображаются на обоих с IGH V и J области.
  2. Граф оставшиеся чтения пар, которые имеют отображения IGH V и J, чтобы получить частоты соответствие комбинации VJ по всем прочитать пары, полученные от секвенирования перспективе на образце. Граф чтения-пару, если оно отображается как в IGH V и J ген, а затем добавить его аллель в соответствующем счете для конкретной комбинации VJ.
  3. Позиция счетчики для каждой рекомбинированного VDJ области, полученной из 3.1.2 с высокойТекущая к низшему. VDJ область имеет самый высокий читает количество определяется в качестве основного комбинации перегруппировки.
  4. Откажитесь выровненных последовательностей, которые охватывают менее 35% доменного крупной перегруппировки определены в 3.1.3.

3.2) ГИМ профиля Идентификация

  1. Граф все модели ГИМ поперек читает с шага 3.1.3. Определить каждого шаблона SHM как субклона.
  2. Подсчитайте количество субклонами, которые, соответствующих различным уникальных моделей СТМ и количество говорится, что отображаются на отдельных субклонами.

3.3) Графическое представление результатов

  1. Выполните филогенетического анализа на субклонами, используя свои соответствующие ГИМ шаблоны, используя окрестность метод соединения с R пакет "обезьяны" в соответствии с протоколом производителя. Рассчитать расстояние матрицу из отдельных различных группировок воссоздать Субклон филогенез корнями в последовательности зародышевой линии в VJ сочетание в вопросе для каждого парного набора образца.
  2. Используйте нуклеотидной последовательности каждого субклона как вектор символов и рассчитать приблизительное расстояние строку между всеми субклонами в крупной VJ перестройки как для диагностики и соответствующих образцов рецидивов с использованием расстояния Левенштейна меру, где математически расстояние между двумя выравнивания задается д х, у (I, J), где d х, у (I, J) = 1, если я ≠ J и 0 в противном случае, а затем подвести эту функцию по длине строки, соответствующие нуклеотидные последовательности I и J.
  3. Графически отобразить полученную матрицу расстояний субклон и их соответствующими пунктам субклон в следующих двух способов:
    1. Использование R пакет "масса" в соответствии с протоколом производителя для применения многомерного масштабирования с расстоянием субклон матрицы и формировать двумерную карту принцип координат, который затем нанесены по логарифмуиз субклональные пунктам, как радиус окружности.
    2. Построить неориентированный граф, основанный на расстоянии Левенштейна, где вершины соответствуют каждому отдельному субклона, вытекающие из основных VJ перестройки.
      Примечание: Если расстояние между двумя различными клонами равна один, то существует ребро между этими двумя вершинами. Если расстояние больше, чем один, то нет ребро, соединяющее их.
    3. Постройте график подпункте 3.3.3.2 с помощью функции tkplot в "iGraph" R пакете с макета Камада Каваи в соответствии с протоколом производителя. Радиус вершины пропорциональна кубу корню из общего числа клонов, отображенных на ней, и затенение используется красный и синий диапазон, чтобы обозначить долю клонов, которые либо принадлежат к диагностике (синий) или (красный) образцов рецидивов ,

3.4) Неоднородность Энтропия) Измерение (

  1. Изучите цифры и субклон отсчетовиндивидуальные картины соматической гипермутации, происходящие в крупной VJ перестройки для каждого парных набор образцов.
  2. Рассчитать эмпирическую энтропию и остаточного эмпирическую энтропию с поправкой на число различных клонов в каждом образце с помощью оценки энтропии стандарт гистограмма основе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В целом процедура VDJ последовательности (VDJ-след), в том числе выделения ДНК, рекомбинации VDJ область амплификации и очистки, библиотека последовательности строительства, читает обработку и филогенетического анализа, представлена ​​на рисунке 1. Регулярно 5-200 мкг ДНК может быть получена из замороженные срезы ткани или твердой 0,5-20 мкг ДНК из фиксированных формалином парафиновых срезах тканей. В зависимости от качества, перегруппировки рисунком, и SHM степени отдельных образцов, разнообразные VDJ ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Из-за почти неограниченного количества итераций информации о последовательности кодируемого VDJ перегруппировки и СГМ в IGH локуса В-клеток человека, экспертиза всей IGH репертуар высокой пропускной глубокой последовательности оказался эффективным и всеобъемлющим образом, чтобы очертить клональный и суб-клоновых населения B-клеток. Кроме того, эта стратегия может быть использована для изучения клонального эволюции путь развития В-клеток опухоли, стадии ремиссии, и рецидива путем сравнения клоновых и суб-клоновых архитек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Риту Шакнович и членов Elemento lab, Melnick lab и Tam lab за вдумчивые обсуждения. Мы также хотели бы поблагодарить Центр ресурсов геномики в Медицинском колледже Вейла Корнелла за проведение VDJ-секвенирования. YJ был поддержан премией ASH Scholar Award. WT и OE поддерживаются грантом Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE поддерживается премией NSF CAREER, Консорциумом по борьбе с раком Старра и Фондом Хиршля. Мы также хотели бы поблагодарить Кэтрин Бенеш, доктора юридических наук, магистра здравоохранения за ее щедрую поддержку этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЭтанолVWR89125-170200 пруф, для молекулярной биологии
TE буферLife Technologies12090-01510 mM Tris· Cl, pH 8,0; 10 мМ ЭДТА
КсилолесVWREM-XX0055-6500 мл
Протеиназа K Life Technonogies25530-015100 мг
Раствор дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) СмесьPromegaU151510 мМ каждый нуклеотид
10x ПЦР Буфер Roche11699105001без MgCl2
ampliTaq Gold DNA Polymerase с золотым буфером и MgCl2Life Technonogies431180650 &m; l at 5 U/µ l
Лестница для контроля размеров образцовInvivoscribe Technologies 2-096-002033 реакции
IGH Анализ соматических гипермутаций v2.0 - Обнаружение геляInvivoscribe Technologies 5-101-003033 реакции, Микс 2 для обнаружения IGVHFR1
IGH Gene Clonality Assay - Gel DetectionInvivoscribe Technologies 1-101-002033 реакции, пробирка B для детекции IGVHFR2
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM829120 &; l at 5 U/µ l
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) буферCorning (cellgro)46-011-CM6x1 l
50x TAE BUFFER   VWR101414-2981 л
раствор бромида этидияSigma-AldrichE151010 мг/мл
25.н. DNALadder Life Technologies105970111 &; g/µ l
100 bp DNA LadderLife Technologies15628-0191 &микро; g/µ l
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500500 г
40% Акриламид/Бис РастворBio-Rad Laboratories1610144500 мл
QIAquick Gel Extraction KitQiagen2870450 колонок
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Qubit dsDNA Высокочувствительный набор для анализаLife TechnologiesQ32854
Высокочувствительный набор ДНКAgilent Technologies5067-4626
2100 БиоанализаторAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
MiSeqIllumina
Qubit 2.0 ФлуориметрLife TechnologiesQ32872
Буфер для ресуспензии (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Смесь для окончательного восстановления (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Смесь для хвостового анализа (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Смесь для лигирования (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Индекс адаптера ДНК (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
(Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)КоктейльIllumina FC-121-2001
(Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)Мастер-миксIllumina FC-121-2001
(Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)IlluminaFC-121-2001
Магнитный стендLife Technologies4457858
Система визуализации геляBio-Rad Laboratories170-8370
Буфер для стоп-лигирования из праймеров ПЦР для ПЦР

Ссылки

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35(2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432(2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VDJ

Похожие статьи