Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Краткое содержание

Представленные методы предоставляют пошаговые инструкции по выполнению коллекции респирометрических анализов на основе микропланшетов с использованием изолированных митохондрий из минимального количества скелетных мышц мыши. Эти анализы позволяют измерить механистические изменения/адаптации в потреблении кислорода в митохондриях в обычно используемой животной модели.

Аннотация

Митохондрии скелетных мышц играют специфическую роль во многих патологических заболеваниях. Таким образом, измерение потребления кислорода в качестве индикатора функции митохондрий в этой ткани стало более распространенным. Несмотря на то, что существует множество технологий и анализов, которые измеряют митохондриальные дыхательные пути в различных клетках, тканях и видах, в настоящее время в литературе существует пробел в отношении составления этих анализов с использованием изолированных митохондрий из скелетных мышц мышей для использования в технологиях на основе микропланшетов. Важно отметить, что использование респирометрических анализов на основе микропланшетов растет среди митохондриальных биологов, поскольку они позволяют проводить высокопроизводительные измерения с использованием минимального количества изолированных митохондрий. Таким образом, была разработана коллекция респирометрических анализов на основе микропланшетов, которые способны оценить механистические изменения/адаптации в потреблении кислорода в обычно используемой животной модели. Представленные здесь методы содержат пошаговые инструкции по проведению этих анализов с оптимальным количеством митохондриального белка и реагентов, а также с высокой точностью, о чем свидетельствует минимальная дисперсия в динамическом диапазоне каждого анализа.

Введение

Основная физиологическая роль скелетных мышц митохондриями является производство АТФ из окислительного фосфорилирования ^1. Важно отметить, что скелетные мышцы митохондрий играть определенную роль в физической нагрузки ^{2, 3} старения, дегенеративные заболевания ^{4 и} Type II диабетом ^5. Как стареющем обществе, и типа диабета II, являющегося ^7-й ведущей причиной смерти в Соединенных Штатах ^6, потребность в способах, которые оценивают функции митохондрий становится все более более распространены в биомедицинских исследованиях ^7,8. В частности, измерение потребления кислорода имеет исключительную полезность в оценке функции митохондрий, так как она представляет собой скоординированную функцию между митохондриальных геномов и ядерных выразить функциональные компоненты окислительного фосфорилирования ^9.

Несколько существуют технологии, позволяют измерение потребления кислорода в интактных клетках и изолироватьD митохондрии ^7-10. Кроме того, анализы были разработаны для различных типов клеток и тканей, а также в различных видов, которые позволяют для измерения митохондриальных дыхательных путей и контроля ^9,11,12. Тем не менее, в настоящее время существует пробел в литературе в отношении составления всех этих анализов с использованием изолированного митохондрии от мыши скелетных мышц для использования в микропланшета технологии потребления кислорода. Важно отметить, что использование микропланшетов основе respirometric анализов растет среди митохондриальных биологов и позволяет высоких измерений пропускной используя минимальные количества изолированными митохондриями ^9. Таким образом, коллекция микропланшета на основе анализов respirometric были разработаны, которые позволяют выявлением, где аномалии и / или адаптации может происходить в электронно-транспортной цепи (ETC). Кроме того, предусмотрены две дополнительные микропланшет, основанные respirometric анализы были разработаны, которые позволяют оценку координации betweeп трикарбоновых кислот (ЦТК) цикл и т.д., и между бета-окисления и Т.Д. Важно отметить, что представленные методы обеспечивают четкое и краткое способ измерения механистические изменения в функции митохондрий в обычно используемой модели животного.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается после одного изолированы митохондрии из красного скелетных мышц. Митохондрии были выделены, как описано выше в ~ 75 - 100 мг красного скелетных мышц ^13. Между 5 - 10 мкг / мкл белка митохондрий будут достигнуты из этого количества ткани ресуспендированием окончательного митохондриальной гранул в ≤50 мкл буфера для изоляции митохондрий (IBM) 2 (см Frisard др ^13).

1. Настройка

1. Подготовка работы исходные растворы (таблица 1) и митохондриальной Анализируемый раствор (MAS) смеси (таблица 2) для последующих анализов.
   Примечание: Большая часть подготовки к анализов может быть сделано заранее, так как большинство запасов решения и МАС могут быть сохранены.
2. Гидрат А respirometric картридж анализа в 1 мл калибровочного раствора в ночь перед экспериментом в _не-СО 2 инкубаторе при 37 ° С.
3. В день эксперимента, тAKE из замороженных запасов (субстраты и модуляторы, митохондриальные МАС смешивания, MAS без BSA, Таблица 1) и оттепель в 37 ° C бане или инкубатора.
4. Подготовьте все решения субстрата (таблица 3) и инъекции (таблица 4-5) и отрегулируйте рН по желанию (рН 7,4). После того, как рН, хранить на льду.
5. Программа мульти-хорошо потребление кислорода измерения машина правильной смеси, ждать, и параметров меры (см Таблицу 6) и этикетки фон и группа / состояние скважин первом входе в программное обеспечение для анализа, а затем в режиме «Стандарт».
   1. Введите в "Гостевой" форум и нажмите на кнопку "пробирной Wizard". После того, как в "пробирной Wizard", щелкните на "Протокол", чтобы изменить микс, ждать, и измерения параметров. Этикетка фона скважин под "Back. Коррекция "на вкладке и убедитесь, что выделить" У коррекцию фона ".
   2. Этикетка услitions щелкнув сначала на вкладке "Группы и знаки", а затем на вкладке "Группа". Информация После эти параметры введены, нажмите "Завершить", а затем "Сохранить шаблон".

2. Анализ Выполнить

1. Загрузите растворы для инъекций, в преддверии картриджа анализа и начать калибровку первом входе в программное обеспечение для анализа, а затем, введя "Стандартный" режим. Введите в "Гостевой" форума. Откройте шаблон, сохраненный в шаге 1.5 под диск "XF", на вкладке "Шаблоны". После того, как открытый, нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать калибровку.
   Примечание: Пробег картридж анализ должен быть введен в машину с зубчатым угла в левом нижнем углу. Это займет около 30 мин. Позаботьтесь, чтобы придать решения в соответствующие порты. Инъекции в таблице 4-5 перечислены в порядке загрузки.
2. Аккуратно, но тщательно перемешать mitochondРИА складе при перемешивании раствора с наконечником пипетки в 200 мкл с последующим растиранием аккуратно запас с наконечником пипетки в 200 мкл, который имел свою отверстие расширенную резанием ~ 3 мм от конца наконечника с помощью ножниц.
3. Выполнение бицинхониновой кислоты (BCA) Анализ для определения концентрации белка в митохондриальной складе.
4. Использование концентрации акций, приобретенная из стадии 2.3, ресуспендируют 10 мкг белка / митохондриальной 200 мкл сукцината / ротеноном смеси субстрата (таблица 3). Ресуспендируют 14 мкг белка митохондрий / 200 мкл субстрата остальных смесей (Это должно быть сделано для каждой смеси субстрата) (таблица 3). Поместите все митохондрий белок / субстрат смеси на льду.
   Примечание: Оптимальное количество белка митохондрий на лунку для каждого анализа было определено, как описано выше ^9. Было установлено, что пируват / малат, пальмитоил карнитина / малат, глутамат / малатD анализы электронов течением используют 3,5 мкг белка митохондрий, в то время как сукцинат / ротенон набора использует 2,5 мкг белка митохондрий на лунку. Таким образом, исследователь должен ресуспендируйте достаточно белка митохондрий для 4 размножается в этом шаге, так как либо 2,5 мкг или 3,5 мкг на 50 мкл загружается на лунку (см шаг 2,6).
5. Смешайте решения митохондрии / подложки аккуратно, но тщательно перемешивали раствор с кончика пипетки 200 мкл, а затем осторожно растирая акции с кончика пипетки 200 мкл, который имел ~ 3 мм его конце обрезаются.
6. Поместите культуральный планшет на льду и трижды, нагрузка 50 мкл / лунку каждого из митохондрий / субстрата смесей. Разработчики микропланшетов основе анализа respirometric рекомендуем оставить минимум две пустые (без митохондрий) скважин, предпочтительно по обе стороны на культуре клеток пластину.
7. Спин культуре клеток пластину при 2000 г в течение 20 мин при 4 ° С. В то время как пластина сзакрепления, разогреть решения подложки на водяной бане 37 ° C.
8. После спин завершена, тщательно загрузки 450 мкл каждого раствора субстрата в верхней части его соответствующие лунки (т.е. загрузить пируват / малата подложку в лунки, которые имеют митохондрии первоначально ресуспендировали в этом растворе субстрата). Будьте уверены, чтобы загрузить пластину при комнатной температуре. Примечание: контрольные лунки должны быть загружены с 500 мкл субстрата. Контрольные лунки, предназначенные для анализа потока электронов должен быть загружен с электронным потоком субстрата (пируват / малат + FCCP), в то время как в сочетании анализа пустые лунки может быть загружен с любым муфты анализа подложки.
   Примечание: При выполнении связанной и электронные анализы потока на той же пластинке, исследователь должен передать фона скважин соответствующих анализов после анализа выполнения завершения использования платформы "XF Reader" на вкладке "Инструмент". После того, как в настройке "инструмент", нажмите на "администрации"Вкладка, а затем "коррекция фона". Хит "Конец инструмента в режим настройки", когда завершена. Это потому, что сочетание аскорбат / ТМФД может потреблять _О 2, таким образом, отдельное коррекции фона, необходимое для каждого типа анализа.
9. После того, как 450 мкл субстрата в каждую лунку добавляли, просматривать слой митохондрий в скважине, чтобы обеспечить митохондрии равномерно распределен в одном монослое (20X увеличение [см Rogers ^{9, рис} 4]). Уэллс, что, кажется, не имеют равномерно распределенную монослой могут быть удалены постфактум.
10. После проверки митохондриальной приверженности, вставьте планшет в respirometric анализа документа и начать анализ запуска, нажав кнопку "OK".
    Примечание: Калибровка с шага 2.1 должен быть полным, прежде чем запустить начнется. После того, как исследователь нажимает "ОК", машина будет извлечь утилиту пластину, которая была использована для калибровки.
    1. Удалить утилиту тарелку и поставить культуру пластину клеток, который содержит митохондрии в лоток. Синий выемка на планшет для культивирования клеток должны быть размещены в нижнем левом углу лотка. Нажмите на "продолжить", чтобы начать работать анализа.
11. После запуска завершена, извлеките клеточной культуры пластины и картриджа, нажав "Eject" на экране.
    1. После того, как пластины выбрасывается, снимите и выбросьте культуре клеток пластину и картридж и нажмите "Продолжить" на экране. Пробег будут автоматически сохранены в виде файла .xls в файле "Data".
12. Откройте этот файл и изменить отображение из "O2" в "OCR", нажав стрелку вниз под "Y1:" маркер.
    1. Следующее изменение "средняя точка" в "Точка-точка ставок" под "скоростью передачи данных отображается как:" вариант. Нажмите кнопку "OK", чтобы применить эти изменения.
13. Перейдите на вкладку "Mode Группа Ну" на левой нижней части экрана на группы скважин подобных условиях вместе. Наконец, нажмите кнопку "Выборочное среднее / стандартная ошибка" вкладку к середине экрана, слева. Кроме того, эти команды могут быть установлены до анализа начинается в обстановке "Мастер анализа".
    Примечание: Каждое условие будет иметь значение ± стандартное отклонение отображаемого для каждого курса и каждого состояния. Есть измерения скорости, принятые в условие (2 государства [Сцепление] / State3u [электронный поток] дыхание следуют четыре инъекции). Используйте среднее состояние 2 скорости второго измерения, определить государство 4o в точке минимума после олигомицину инъекции, используйте точку максимальной для государства 3 и Государственной 3U после АДФ и FCCP инъекции, соответственно, и использовать минимальную температуру для антимицин А индуцированных дыхания для муфты анализов. Используйте максимально точкой для пирувата / малат индуцированной государственного 3u дыхания, используйте минимумточка для ротеноном индуцированных дыхания, использовать максимальное точкой для сукцината индуцированной Государственный 3u дыхания, и использовать минимальную температуру для Антимицина A индуцированного дыхания для анализа потока электронов. Все эксперименты проводили 3 раза, а данные, приведенные результаты представительного трассировки.

Результаты

Рисунок 1 представляет уровень потребления кислорода (OCR) для пируват / малат, сукцинат / ротенон, пальмитоил карнитина / малат и глутамат / малат анализы (анализы Сцепление). Эти аналитические обводка отображаются как потребление кислорода Rate, или OCR, в зависимости от времени, которые фон correceted, и отображаются как точка-точка ставок. Каждая панель представляет собой потребление кислорода в различных митохондриальных государств, как описано случайно и Уильямс ^14. Первая панель представляет базальную потребление кислорода, или состояние 2. Вторая панель, после инъекции АДФ, представляет максимальную сочетании дыхание или конечным 3. третьей панели, после инъекции олигомицином А (ингибитор комплекса V), представляет дыхание должным протонной утечки, или государства 4o. Четвертый панель, после инъекции FCCP, представляет максимальную несвязанных дыхание, или государство 3U. Наконец, пятой панели, после инъекции антимицина А, представляет собой ингибирование окислительного дыхания. Примечательно, альл митохондриальные государства имеют минимальную стандартное отклонение. Это связано с тщательного перемешивания митохондриальной складе и митохондрии / подложки смесей и достижения одного монослоя митохондрий после спина приверженности (этап 2.6). С другой стороны, загрузка неравные митохондрий в каждую лунку и не достигая одного монослоя митохондрий в лунку микропланшета приводит к увеличению стандартного отклонения в каждом состоянии, как показано на рисунке 2.

В кальки на рисунке 1 отображения плато для каждого государства и митохондриальной для каждой подложки. Плато достигается после двух циклов измерений предполагает хорошую митохондриальной качество и что митохондрии остаются привязаны к колодцу на протяжении всего анализа. Кроме того, достижение максимальных ставок платовидных может быть более желательным, так как это позволяет исследователю взять среднее OCR в этих митохондриальных состояний, тем самым уменьшая смещение, которое может произойтипроизвольно выбирая точку.

Количество митохондрий на лунку определялось оптимизации испытаний. Оптимальное количество митохондрий на лунку должно привести к состоянию 2 ставки между 100-200 пмоль / мин / лунку и состояние 3 ставок <1500 пмоль / мин / лунка, так как эти значения находятся в пределах динамического диапазона зондирования кислорода в нескольких скважин кислорода Расход измерение машина. Загрузка слишком много белка митохондрий на лунку, может привести к OCRs пределами динамического диапазона прибора (фиг.3А). Рисунок 3 иллюстрирует загрузке 3,5 мкг белка митохондрий на лунку (синий трассировки) по сравнению с загрузкой 2,5 мкг белка митохондрий на лунку (красный отслеживание) для сукцинат / ротеноном анализа. Загрузка слишком много белка митохондрий на лунку может также привести к истощению кислорода в микрокамеры скважины, тем самым предотвращая точное измерение OCR для каждого последующего измерения ⁹ (3В </ STRONG>). Точка-точка OCR является мгновенная скорость изменения OCR. Если квартира, ОРЗ устойчивый / стабильный, но если уменьшается, то есть может быть биологическая или техническая проблема. Резкое сокращение OCR в штате 3 и Государственной 3u дыхания (рис 3а) вызвано митохондрий Исчерпав запас кислорода до конца измерения (рис 3B).

Рисунок 4 представляет OCR от времени для анализа электронного потока. Трассировка корректируется и отображается, как описано в рисунке 1. Первая группа в этом анализе представляет государство 3U дыхание на пируват / малат с помощью комплекса I. Вторая панель, после инъекции ротенона, представляет ингибирование комплекса I, опосредованного дыхания. В третьей группе, после инъекции сукцината, представляет субстрата стимулировали государственный 3U с электронами ввода и т.д. в комплексе II (комплекс II опосредованное дыхание). Четвертый панель, после инъекции Антимycin А, представляет ингибирование комплекса III и, таким образом, общую дыхания. Наконец, пятая группа, после инъекции аскорбиновой кислоты / ТМФД, представляет комплекс IV опосредованное дыхание. Подобно кальки на рисунке 1, все митохондриальные государства имеют минимальную стандартное отклонение, и каждый курс имеет или почти достиг плато.

Рисунок 1. Сцепление Анализы. (А) 10 мМ пирувата / 5 мМ малат, (Б) 10 мМ сукцината / 2 мкМ ротенон, (С) 40 мкМ пальмитоил карнитина / 1 мМ малат, и (D) 10 мМ глутамата / 10 мМ малат сочетании митохондриальные обводка дыхания определение, как определено путем измерения нескольких скважин потребления кислорода. Значения выражены как среднее ± SD. Митохондриальная белков загружен на лунку 3,5 мкг для всех анализов, кроме сукцинат / гнильенон, который использует 2,5 мкг белка митохондрий на лунку. Данные представляют N = 3 парные биологических повторяет. OCR = Потребление кислорода Оценить; АДФ = аденозиндифосфатом; Олиго = Олигомицин А; FCCP = Карбонильное cyanide- 4 - (трифторметокси) фенилгидразон; Анти-А = Антимицина А; PYR = пируват; SUCC = сукцинат; РОТ = Ротенон; PAL-C = пальмитоильную карнитин; GLUT = глутамат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. сильно варьирует пируват / малат анализа. Высоко переменной 10 мМ пирувата / 5 мМ малат анализа вызвано полностью смешения митохондрии от митохондриальной складе в подложке / MAS смеси, что приводит к переменной митохондриальной проTein нагрузка в каждую лунку. Митохондриальная белков загружен на лунку 3,5 мкг. Данные представляют N = 3 парные биологических повторяет. OCR = Потребление кислорода Оценить; АДФ = аденозиндифосфатом; Олиго = Олигомицин А; FCCP = Карбонильное cyanide- 4 - (трифторметокси) фенилгидразон; Анти-А = Антимицина А; PYR = пируват. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Перегрузка белка митохондрий для сукцинат / Ротенон анализе. (А) уровень потребления кислорода за пределами динамического диапазона нескольких скважин измерения машины потребления кислорода, вызванного загрузкой 3,5 мкг белка митохондрий на лунку (синий трассировки) по сравнению с загрузкой 2,5 мкг белка митохондрий на лунку (красный трассировки). (В ) Охygen напряжение приближается к нулю после ДПА и FCCP инъекций, вызванных загрузкой чрезмерное белка митохондрий (3,5 мкг) в каждую лунку (синий трассировки) по сравнению с загрузкой оптимальное количество (2,5 мкг) белка митохондрий на лунку (красный трассировки). Данные представляют N = 3 парные биологических повторяет за митохондриальной количество белка. OCR = Потребление кислорода Оценить; АДФ = аденозиндифосфатом; Олиго = Олигомицин А; FCCP = Карбонильное cyanide- 4 - (трифторметокси) фенилгидразон; Анти-А = Антимицина А; SUCC = сукцинат; РОТ = Ротенон; _О 2 = кислород; мм Hg = миллиметров ртутного столба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Поток электронов анализа. 5 мМ пирувата / 1 мМ малат + 4 мкМ FCCP, электрон енизкий митохондриальной трассировка дыхание анализ как определено путем измерения многолуночном потребления кислорода. Значения выражены как среднее ± SD. Митохондриальная белков загружен на лунку 3,5 мкг. Данные представляют N = 3 парные биологических повторяет. OCR = Потребление кислорода Оценить; Анти-А = Антимицина А; Asc = Аскорбат; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- р -phenylenediamine. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Реагент	Фото Концентрация	МВт	Конечный объем	Масса Добавлено	Комментарии / Описание
	(М)	(г / моль)	(мл)	(г или мл)
EGTA, рН 7,2	0,1	380,35	100 мл 1 М Трис из базы	3,801 г	Хранить при 4 ° С
HEPES	1	238,3	250 мл DIH 2 O	59. 57 г	Хранить при 4 ° С
MgCl 2, гексагидрат	1	203,31	250 мл DIH 2 O	50.82 г	Хранить при 4 ° С
Пируват рН 7,4	0,1	88.06 (Поставляется в 14.11 М раствора)	40 мл DIH 2 O	0,283 мл пировиноградной кислоты	Сделайте 1 мл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C, убедитесь, свежий каждые две недели
Сукцинат, рН 7,4	0,5	118.09	100 мл DIH 2 O	9,4 г суccinic кислоты	Сделайте 1 мл аликвоты и хранить при температуре -20 ° C
Малат, рН 7,4	0,5	134.09	100 мл 95% этанола	6,7 г яблочной кислоты	Сделайте 200 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C
TMPD	0.01	164,25	10 мл	0,0164 г	Сделайте 300 мкл аликвоты и хранят при -20 ° С; Смешать с эквимолярным количеством аскорбата, чтобы сохранить ТМФД пониженном
Пальмитоил хлорида Л-карнитин	0.01	436,07	1,14 мл 95% этанола	0,005 г	Сделайте 40 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C
Олигомицин	0,006	791,06	0,987 мл 95% этанола	0,005 г	Сделайте 20 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C
FCCP	0.01	254,17	3,9 мл 95% этанола	0,01 г	Сделайте 40 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C
Ротенон	0,001	394,4	10 мл 95% этанола	0,0039 г	Хранить при -20 ° C
Антимицина А	0,005	548,63	9.12 мл 95% этанола	0,025 г	Хранить при -20 ° C
К + АДФ	0,5	501,32	3,9 мл DIH 2 O	1,0 г	Хранить при -20 ° C
Яблочная кислота, рН 7,4	0,5	134.09	40 мл	2,68 г	Сделайте 200 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C

Исходные растворы

Реагент	Фото Концентрация	Масса Добавлено	Конечная молярность / Процент
	(М)	(г или мл)
Сахароза	-	11.98 г	70 мм
Маннитол	-	20.04 г	220 мм
Фосфат калия одноосновной	-	0,34 г	5 мм
MgCl 2, гексагидрат	1	2,5 мл	5 мм
HEPES	1	1,0 мл	2 мм
ЭГТА	0,1	5,0 мл	1 мм
По сути жирных кислот БСА Free-	-	1,0 г	0,20%

. Таблица 2. MAS Mix рН 7,4, 500 мл: 25 мл Алиготе и хранить при температуре -20 ºC * Примечание: Исключить BSA для MAS смеси, используемой для анализа инъекций.

Субстрат Средний	Конечная концентрация	Сумма складе (мкл)	Сумма MAS * (мл)
Пируват / малат	10 мм / 5 мМ	Пируват: 1000	9
		Малат: 100
Succicinate / Ротенон	10 мм / 2 мкМ	Сукцинат: 200	10
		Ротенон 20
* Пируват / малат + FCCP	5 мм / 1 мм / 4 мкМ	Пируват: 500	10
		FCCP: 4
		Малат: 20
Пальмитоил л-карнитин / малат	40 мкм / 1 мМ	Palmitoylcarnitine: 40 малат: 20	10
Глутамат / малат	10 мм / 10 мМ	Глутамат: 400	10
		Малат: 200

Таблица 3. Субстрат Решения рН 7,4: Сделайте свежий день эксперимента. * Электронный решение поток анализа.

Инъекции Средний	Концентрация	Сумма складе (мкл)	Сумма MAS (мл)	Сумма вводится в картридж	Конечная концентрация
					(После инъекции в пластине)
АДФ	50 мм	300 мкл	3	50 мкл	5,0 мм
Олигомицин	20 мкМ	10 мкл	3	55 мкл	2,0 мкм
FCCP	40 мкМ	12 мкл	3	60 мкл	4,0 мкм
Антимицина А	40 мкМ	24 мкл	3	65 мкл	4,0 мкм

Тспособные 4. Инъекции для связанных Анализы рН 7,4: Сделайте свежие. в день эксперимента. * Сцепление анализы включают (но не ограничиваются) пируват / малат, сукцинат / ротенон, пальмитоил карнитина / малат, и глутамат / малат.

Инъекции Средний	Концентрация	Сумма складе (г или UL)	Количество MAS (мл)	Сумма вводится в картридж	Конечная концентрация (После инъекции в пластине)
Ротенон	20 мкМ	60 мкл	3	50 мкл	2,0 мкм
Сукцинат	50 мм	300 мкл	3	55 мкл	5,0 мм
Антимицина А	40 мкМ	24 μ; л	3	60 мкл	4,0 мкм
TMPD / Ascorabte	1 мМ, 100 мМ	TMPD: 300 мкл	3	65 мкл	100 мкм, 10 мМ
		Аскорбат: 0,059 г

Таблица 5. Инъекции для электронного анализе потока рН 7,4: Сделайте свежие. В день эксперимента

Команда	Время (мин)	# Циклов
Калибровать
Подожди	10 мин (чтобы пластина, чтобы нагреть от приверженности шаге)
Смешивать	1 мин	2
меняAsure	2 мин
Подайте
Смешивать	1 мин	2
Мера	2 мин
Вводите B
Смешивать	1 мин	2
Мера	2 мин
Вводите C
Смешивать	1 мин	2
Мера	2 мин
Вводите D
Смешивать	1 мин	2
Мера	2 мин

Таблица 6. Инструмент Выполнить протокол.

Обсуждение

Методы, представленные в этой статье предоставить шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric митохондрии, выделенные из 75 - 100 мг мыши скелетных мышц. Эти анализы могут быть выполнены с высокой точностью, о чем свидетельствует плотный стандартное отклонение между трех лунок. Важно, что эти анализы позволяют respirometric выявлении, где нарушения и / или адаптации может происходить в т.д., ЦТК, β-окисления токопровод, подложка транспортеры, и т.д., в обычно используемом животной модели.

Это важно подчеркнуть, обоснование использования различных видов топлива и ингибиторы, используемые в настоящем протоколе. Пируват / малат и глутамат / малат respirometric анализы позволяют для оценки Комплекс I, опосредованного дыхания, а также при оценке их соответствующих транспортеров, и в случае глутамат, в Аденозиндеминазный ^15. Кроме того, сочетаниесукцинат / ротенон позволяет оценить митохондриальной дыхательной потока через комплекс II в ЕТС, так ротенон ингибирует комплекс I и сукцинат обеспечивает электроны комплекса II с помощью сокращения флавинадениндинуклеотид (FADH ₂₎ ^15. Эти анализы обеспечивают подложку конкретную информацию об эффективности связи и максимальной дыхания. Анализ электронный поток является уникальным в том, что сочетание подложки и ингибиторов позволяет оценить нескольких комплексов во митохондриальной дыхательной потока ^9. Начальная смесь субстрат пирувата / малат + FCCP позволяет для оценки максимального дыхания обусловлен комплекс I, в то время как инъекции ротенона последующим сукцината позволяет оценка максимального дыхания обусловлен комплексом II. Инъекция антимицина А, ингибитор комплекса III, с последующим введением аскорбиновой кислоты / TMPD позволить для оценки дыхания обусловлен комплекса IV, так как аскорбат / TMPD являетсядонора электронов для цитохрома С / комплекса IV. В то время как нет информации об эффективности связи не получается, метод идеально подходит для очень малых размеров выборки, которые исключают запуска нескольких подложек самостоятельно. Наконец, использование пальмитоил карнитина / малат позволяет оценить координации между -окисления и т.д. с восстанавливающим эквивалента от окисления пальмитиновой кислоты (бета-окисления) подается в ETC через электрона передающей флавопротеид ^15. Следует отметить, что поток пробы Сцепление и Electron также могут быть использованы в сочетании, чтобы идентифицировать изменения в функции митохондрий из-за некоторого вмешательства (лечения препарат, генетической манипуляции).

Высокая точность достигается для этих анализов, прежде всего, из-за тщательного перемешивания митохондрий, является ли это до определения белка, или с решениями подложки. Вдоль этих линий, как только митохондрии resuspendend в подложке SOLUTIOнс, важно, чтобы смешать это решение тщательно перед загрузкой культуру пластину клеток, как описано в шаге 2.2 с расширенной отверстие наконечника пипетки. Отказ смешивать митохондрии тщательно приведет к большим изменением в анализе. Кроме того, с помощью узкой пипетки отверстия создаст силы сдвига при смешивании митохондрии и увеличивает потенциал, чтобы повредить митохондриальных мембран и высвобождение цитохрома С. шаг соблюдение (2.7) также является важным шагом в этом протоколе. Отказ вращаться загруженный клеточной культуры пластину длинный / достаточно быстро приведет к неполной приверженности митохондрий в скважину, что приводит повышенной изменчивости между скважинами и измерений.

Описанный протокол был оптимизирован для включают в себя: загрузка оптимальное количество белка митохондрий на лунку, используя правильные концентраций / методы подготовки, чтобы сделать акции и подложки решения, изменения анализа бежать, чтобы обеспечить митохондриальной государственной плаteaus, и целесообразно смешивание митохондриальных фондовых и митохондриальной / подложки смесей. До этих усилий по оптимизации, авторы столкнулись ловушек в аналитическом счете. Ниже обсуждаются способы устранения неполадок / модификации, которые были полезны в оптимизации этого протокола. Что касается оптимальной загрузки, загрузка слишком мало митохондрий не вызовет надежную реакцию, при загрузке слишком много митохондрий исчерпает кислород в микрокамеры и привести к неточным измерениям. Роджерс и др ⁹ приведены примеры определения оптимальных объемов погрузки митохондрий на лунку для микропланшетов основе respirometric анализов. Чаще слишком много митохондрий загружен в также свидетельствует состоянии 2 ставки в течение 100-200 пмоль / мин / хорошо и состояние 3 ставки> 1500 пмоль / мин / лунку. Если в течение погрузка осуществляется, провести эксперимент с различной концентрацией митохондрий белка (например, между 1 -. 10 мкг), чтобы вызвать OCRs в пределах динамического гAnge измерительной машины потребления кислорода. Подготовка и использование правильных концентраций субстратов и запасов имеет первостепенное значение. Всегда использовать кислотную форму субстратов / инъекций и доведения рН с гидроксидом калия или HCl; буферы натрия / решения не рекомендуется. Кроме того, ресуспендированием субстраты / запасы в ДМСО или 100% этанола приведет к повреждению измерительного или ошибок. Будьте уверены, чтобы использовать 95% этанол где отмечено. Она является общей для пальмитоил карнитина для осаждения из 95% этанола после оттаивания замороженного акции, тем самым вызывая большой изменчивостью. Будьте уверены, чтобы разогреть пальмитоил карнитина акции и вихрь хорошо перед использованием. Кроме того, сильно варьирует пируват / малат результат анализа может быть связано с пируват фондовой существа> 2 недель. Будьте уверены, чтобы переделать замороженные аликвоты пирувата каждые 2 недели. Анализ выполнения был изменен, чтобы измерения 2-минутных обеспечить митохондриальных государственные плато. Если наблюдение истощения АДФ желательно, исследователь можетпродлить время измерения на вкладке «Протокол» в рамках проекта «Мастер анализа" форума. Наконец, большая изменчивость возникает, когда митохондриальной фондовые и митохондрий плюс подложки решения не гомогенизировали полностью до погрузки. Если изменчивость между скважинами высокая после анализа перспективе, убедитесь, что в полной мере смешивания раствора субстрата до следующего эксперимента. Никогда вихрь решения митохондрии / подложки, а перемешать, пюре и аккуратно растирать с расширенной отверстие наконечника пипетки.

Есть некоторые ограничения этого метода, которые стоит отметить. Во-первых, количество скважин на культуральный планшет, используемый для этих анализов является относительно низким (т.е.., 24 скважин и, по меньшей мере 2, предназначенных для контрольных лунок). Если желательно, чтобы выполнить все 5 из этих анализов на одной пластине, исследователь может только рассмотреть ответы от одной мыши одновременно. Тем не менее, следует отметить, что 96-луночные инструменты для ВЫСОг пропускную способность. Во-вторых, есть сила и слабость в оценке дисфункцию митохондрий в изолированных митохондриях по сравнению с в интактных клетках ^1. Некоторые недостатки включают наличие менее физиологическое значение по сравнению с интактными клетками и вызывающих артефакты из процесса выделения. Наконец, успех этого метода будет зависеть от качества процесса изоляции митохондрий.

Хотя некоторые из этих анализов были либо разработаны в различных системах или были подтверждены в других моделях на животных, методы, представленные здесь, являются первым, чтобы синтезировать все вышеупомянутые анализов для оптимального использования в нескольких хорошо измерение машина потребление кислорода с помощью мыши скелетная мышца. Важно отметить, что все 5 из этих анализов могут быть выполнены с количеством митохондрий, выделенных из ~ 75 - 100 мг мыши скелетных мышцах, обеспечивая тем самым высокую пропускную способность при минимальном материала. Большое значение, способность мульти-колодцатехнологии потребления кислорода для выполнения анализов с минимальными количествами митохондрий, в сочетании с оптимизированной методом изоляции, позволяет исследователю выполнять множество других экспериментов с остатком скелетной мышечной ткани (например,., западных пятна, ОТ-ПЦР, ферментативных анализы, и т.д.), который часто является борьба с этой модели на животных.

В заключение, методы, представленные в данном документе, шаг за шагом инструкции для выполнения коллекции микропланшета на основе анализа с использованием respirometric минимальные количества мыши скелетных мышц. Важно отметить, что представленные методы требуют минимальных количеств ткани и митохондрий. После освоено, описанные здесь позволит исследователям определить потенциальный механизм соединения или генного продукта в митохондриальной потребления кислорода в обычно используемом животной модели.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сахароза	Sigma Aldrich	S7903	Хранить в RT
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	Хранить в RT
Фосфат калия моноосновный, минимум 99,0%	Sigma Aldrich	P5379	Хранить в RT
Магния хлорид гексагидрат, реагент ACS, 99,0-102,0%	Sigma Aldrich	M9272	Хранить в RT
HEPES минимум 99,5% титрование	Sigma Aldrich	H3375	Магазин в RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Магазин в RT
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	Магазин в 4 ° C
Acid Free - BSA
Pyruirrigat Acid, 98%	Sigma Aldrich	107360	Хранить при 4 ° C
Янтарная кислота	Sigma Aldrich	S9512	хранить в RT
L(-) Яблочная кислота, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Хранить в RT
L-глутаминовую кислоту	Sigma Aldrich	G1251	Хранить в RT
N,N,N′,N′-Тетраметил--фенилендиамин	Sigma Aldrich	T7394	Хранить в RT
99%, порошок [TMPD]
Пальмитоил L-карнитин хлорид	Sigma Aldrich	P1645	Хранить при -20 ° C
Олигомицин А, &ge 95% (ВЭЖХ)	Sigma Aldrich	75351	Хранить при -20 °°; C
Карбонилцианид 4-(трифторметокси)	Sigma Aldrich	C2920	хранить при 2 - 8 °°; C
phenylhydrazone
≥ 98% (TLC), порошок [FCCP]Антимицин
А из streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Магазин при -20 градусов; C
Аденозин 5′-дифосфат монокалия соль дегидрат [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	хранить при -20 °°; C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Магазин в RT
Pierce™ Набор для анализа белка BCA	Thermo Scientific	23225	Н/Д