Методическая статья

Анти-вирулентных Срыв патогенных биопленки с помощью конструктивных Кворум-тушения Lactonases

DOI:

10.3791/53243

⸱

1 января 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ферменты, подавляющие кворум, являются антивирулентными и антибактериальными вариантами, которые могут смягчить патогенез без риска возникновения резистентности, предотвращая экспрессию факторов вирулентности и генов, связанных с устойчивостью к антибиотикам и образованием биопленки. В этом исследовании мы сообщаем о методе, который демонстрирует эффективность ферментов, подавляющих кворум, в разрушении бактериальной биопленки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрое появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью ускорило потребность в новых терапевтических подходах для борьбы с опасными для жизни инфекциями. Персистенция бактериальной инфекции часто связана с образованием биопленки, опосредованной чувством кворума. Таким образом, нарушение этой сигнальной цепи представляет собой привлекательную стратегию борьбы с вирулентностью. Сообщалось, что лактоназы, подавляющие кворум, являются эффективными разрушителями цепей, чувствительных к кворуму. Тем не менее, было очень мало сообщений об эффективном использовании этих ферментов для нарушения образования бактериальной биопленки. В этом протоколе описан метод нарушения образования биопленки у клинически значимого штамма A. baumannii S1 с помощью модифицированной лактоназы, гасящей кворум. Acinetobacter baumannii является основным патогеном человека, вовлеченным в серьезные внутрибольничные инфекции во всем мире, и его вирулентность объясняется главным образом стойкостью его биопленки. С помощью модифицированной лактоназной обработки достигнуто значительное снижение биопленки A. baumannii S1. Это исследование также показало возможность использования сконструированных ферментов, подавляющих кворум, в будущем лечении бактериальных заболеваний, опосредованных биопленкой. Наконец, этот метод может быть использован для оценки компетентности перспективных ферментов, гасящих кворум.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Варианты лечения инфекционных заболеваний осложняется быстрым ростом множественной лекарственной устойчивостью бактерий, которые устойчивы к широкому спектру антибиотиков 1. С высокой заболеваемости и смертности от устойчивых бактерий-опосредованные инфекции, существует необходимость эскалации процессов развития наркотиков и / или исследовать более антибактериальными альтернативы для улучшения терапевтических возможностей. В последнее время, подход анти-вирулентность набирает интерес, учитывая его потенциал в предотвращении вирулентность не через бактерицидные методы, следовательно, смягчению рисков механизмов сопротивления 2.

Кворум зондирования является «главный выключатель" в бактериальной вирулентности и нарушение этого явления сигнализации является перспективным методом борьбы с вирулентность против патогенезе 3. Наступление вирулентности требует накопления кворума молекул в внеклеточной среде после критического бактериального плотность населения достигается. Как-квоМолекулы ром диффундируют обратно в внутриклеточного матрикса, связывание с их родственными рецепторами приводит к активации факторов вирулентности, а также генов, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам и биопленки 4. В общем, нарушение кворума зондирования включает ингибирование кворума молекулу и взаимодействие рецептора, не затрагивая основных метаболических путей. Следовательно, он не имеет никакого прямого последствия на рост клеток. Так фитнес не будет нарушена, есть минимальное давление отбора для бактерий развиваться и сопротивление против таких методов лечения 5 получить. Кроме того, нарушение кворума зондирования может мешать присущих бактериальных защитных механизмов, как в случае образования биопленки, который обеспечивает защиту от антибактериальных агентов и иммунного ответа.

Считается, что 99% микробов на Земле существуют в сложных биопленки, как матриц, присвоении важные преимущества выживания для микроорганизмов, обитающих внутри йESE структуры 6. Что еще более важно, формирование этих сидячих доменов является причиной самых упорных и хронических внутрибольничных инфекций 7. Acinetobacter baumannii является одним из основных человеческих патогенов, что связано с глобальными внутрибольничных инфекций и его вирулентность в значительной степени объясняется кворума зондирования -опосредованной образование биопленки 8. Кворум-тушения ферменты были успешно использованы в срыве кворума опосредованной трансдукции сигнала от ориентации группу соединений, известных как N-ацил гомосериндегидрогеназу лактонов (AHLs), которые производятся грамотрицательных бактерий 9. Несколько исследований также расширены с использованием этих ферментов блокировать бактериальный патогенез путем уменьшения экспрессии фактором вирулентности и клеточных чисел в биопленок 10,11. К сожалению, остается отсутствие ощутимой демонстрацией эффективного использования кворума закалки ферментов против образования биопленки бактериальными патогенами.Re были попытки использовать ингибиторы кворума (AHL), аналоги вместо кворума закалки ферменты, чтобы сорвать А. baumannii образование биопленки 12. Хотя этот метод с использованием ингибиторов малых молекул является действительным подход, поддерживая его биодоступность в трансляционных использования может быть проблемой. Напротив, использование каталитических кворумных закалки ферментов может обойти проблему биодоступность, как ферменты более пригодными в сторону иммобилизации на поверхности биомедицинских устройств для терапевтического воздействия.

Здесь мы опишем оценку последствий инженерных кворума закалки lactonases из Geobacillus kaustophilus (ГКЛ) 13 об образовании бактериальной биопленки, используя кристалл фиолетовый окрашивание и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Это исследование является первым успешная демонстрация нарушения биопленки в клинически значимых А. baumannii S1 напряжение с помощью кворума закалки ферменты. Описанные методыв данном исследовании являются полезными для оценки эффективности других кворума закалки ферментов в последующих терапевтических усилий в области развития против патогенных грамотрицательных бактерий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Кристалл Фиолетовый Количественное образование биопленки в А. baumannii S1

  1. Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в лизогении бульона (LB) (триптон 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л) при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
  2. Отрегулируйте культуры А. baumannii S1 до желаемого OD 600 0,8. Использование 96-луночного планшета, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 10 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 100 мкл.
  3. Подготовка управления культуры, а также, это не содержит каких-либо фермент. Повторите аналогичные условия, с получением желаемого количества повторов.
  4. Накройте тарелку с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 3 часов, прежде чем осторожно извлечением носителя.
  5. Добавить еще 100 мкл свежей среды LB к колодцу и инкубируйте в течение 21 ч при 30 ° С.
  6. После второго периода инкубации, осторожно удалить все носители. Вымойте планктона бактерий ячейку с 200 мкл стерильной воды. Убедитесь, что существует только минимальное нарушение в клетках во время стирки.
  7. Добавить 100 мкл 1% раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Извлеките кристаллическим фиолетовым раствором путем промывания скважины с 200 мкл стерильной воды. Повторите мыть для более двух раз.
  8. Добавить 100 мкл 33% уксусной кислоты в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин с легким встряхиванием; это будет распустить краситель.
  9. Определения количества биопленки, образованную путем измерения оптической плотности кристаллического фиолетового при 600 нм. Количество кристаллического фиолетового пропорциональна количеству биопленки, образованной.

2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии А. baumannii S1 биопленки

  1. Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в LB при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
  2. Объявлениетолько культура А. baumannii S1 до желаемого OD 600 0,8. Использование 35 мм со стеклянным дном М блюдо, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 30 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 1 мл.
  3. Обложка М-Блюдо с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Выдержите М-блюдо на 30 ° С в течение 3 ч перед удалением мягко СМИ. Добавить 30 мкл очищенного фермента и ГКЛ свежей средой, доводя его до общего объема 1 мл. Инкубировать в течение еще 21 ч при 30 ° С.
  4. Повторите шаг 2,3 и инкубируют в М-Dish еще в течение 24 ч при 30 ° С. Затем снимите СМИ осторожно.
  5. Добавить 500 мкл 5 мкг / мл Алекс Fluo-488 конъюгированного агглютинина зародышей пшеницы (WGA), растворенного в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с мю-Петри и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин; это будет пятно сформированную биопленку. Удалить окрашивания раствор и промойте тон мю-Блюдо с 2 мл HBSS. Повторите стадии промывки еще раз.
  6. Добавить 500 мкл 3,7% формальдегида, растворенного в HBSS и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин; это будет исправить биопленки на х-блюдо. Вымойте М блюдо один раз 2 мл HBSS и затем снимите решение полностью. Μ-блюдо фиксируется с биопленки могут быть сохранены в темноте при 4 ° С до визуализации CLSM.
  7. Для CLSM изображений и анализа, использовать 63-кратное увеличение, чтобы генерировать 97 стеков за изображения с интервалом 0,21 мкм на стеке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В количественного эксперимента кристаллического фиолетового, две кворума закалки ферменты используются для демонстрации возможности в срыве биопленки: дикого типа ГКЛ и улучшенный GKL двойной мутант (E101G / R230C). Оба фермента были показаны, чтобы продемонстрировать lactonase активность против 3-гидрокси-деканоил-L-гомосерин лактон (3-ОН-С 10 -HSL), главным кворума молекула используется А. baumannii S1 14. Для действительного оценки нарушения биопленки, с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В обоих наборов эксперимента А. baumannii S1 культивировали в LB среде без NaCl в высокой концентрации соли может уменьшить количество биопленки, образованную бактерий 15. Наличие такого артефакта может недооценивать количество биопленки, образованный, а также эффекты кворумных закалки ферментов через различные условий обработки. Использование фермента каталитически неактивным важно в качестве отрицательного контроля, чтобы устранить возможные эффекты связывания фермента. 1 показано, что,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от Фонда академических исследований Министерства образования, а также Национального совета по медицинским исследованиям и Национального исследовательского фонда Сингапура.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Триптон BD211705
Экстракт дрожжейBD212750
96-луночная пластинаCostar3596
Кристаллическая фиолетоваяSigma-AldrichC6158
Уксусная кислотаЛабораторное сканированиеPLA00654XВнимание: легковоспламеняющая
μ-тарелкаIbidi80136
Alex Fluo 488-конъюгированная WGAИнвитрогенW11261
Хэнка s сбалансированный солевой раствор Инвитроген141475095
формальдегидSigma-AldrichF8775Внимание: коррозионный 
Synergy HT Microplate ReaderBioTek
1X-81 Инвертированный флуоресцентный микроскопOlympus

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
  4. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  5. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
  6. Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
  7. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  8. Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
  9. Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
  10. Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
  11. Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
  12. Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
  13. Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
  14. Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
  15. Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A baumannii S1

Похожие статьи