β-бочковые белки наружных мембран (OMP) выполняют множество функций в наружных мембранах грамотрицательных бактерий, митохондрий и хлоропластов. В этой связи мы надеемся устранить известное узкое место в структурных исследованиях, представив протоколы производства ОМП с β бочками в количествах, достаточных для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мембранные белки выполняют важные функции в клетках, такие как транспорт питательных веществ, подвижность, передача сигналов, выживание и вирулентность, но составляют всего ~1% процентов известных структур. Существует два типа мембранных белков: α-спиральные и β-бочковые. В то время как белки α-спиральной мембраны можно найти почти во всех клеточных мембранах, белки β-бочковых мембран можно найти только во внешних мембранах митохондрий, хлоропластов и грамотрицательных бактерий. Одним из распространенных узких мест в структурных исследованиях мембранных белков в целом является получение достаточного количества чистого образца для анализа. В надежде помочь тем, кто заинтересован в разгадке структуры их любимого белка внешней мембраны (ОМП) с β бочками, представлены общие протоколы для производства целевых β-бочковых ОМП на уровнях, пригодных для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии и/или ЯМР-спектроскопии. Здесь мы описываем конструкционный дизайн как для нативной экспрессии, так и для экспрессии в тела включения, очистки с помощью аффинной метки и кристаллизации с использованием методов скрининга моющих средств, бицелла и липидной кубической фазы. Эти протоколы были протестированы и признаны эффективными для большинства ОМП грамотрицательных бактерий; Тем не менее, существуют некоторые мишени, особенно для митохондрий и хлоропластов, которые могут потребовать других методов экспрессии и очистки. Таким образом, приведенные здесь методы должны быть применимы для большинства проектов, в которых используются ОМП из грамотрицательных бактерий, однако уровни экспрессии и количество очищенного образца будут варьироваться в зависимости от целевой ОМП.
Введение
β-бочка ОМР можно найти только во внешних мембранах митохондрий, хлоропластов и грамотрицательные бактерии 1-3. В то время как они служат аналогичные роли в качестве альфа-спиральных белков, они имеют очень разные складку, состоящий из центральной области β-бочка мембраны встраиваемый в диапазоне от 8-26 антипараллельными бета-нитей с каждой пр дь тесно связан с двумя соседними нитями (фиг.1 и 2). Первый и последний пряди области β-бочка затем взаимодействуют друг с другом, почти исключительно в анти-параллельно (за исключением митохондриальной VDAC), чтобы закрыть и загерметизировать домен β-бочка из окружающей мембраны. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Клонирование и экспрессия
Примечание: Для включения структурных исследований, достаточное количество высокоочищенного белка должно быть получено, и это как правило , начинается с клонированием и избыточной экспрессии белка - мишени β-бочка наружной мембраны (OMP) в E. палочки (Рисунок 4). На сегодняшний день все β-бочка OMP структур, в том числе для структур митохондриальной VDAC, были получены от бактериально экспрессируемого белка 11. Здесь, общие протоколы представлены для клонирования и экспрессии β-ствольной ОМР для (1) нативной экспрессии непосредственно в бактериальных мембранах и (2) выражение....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
YiuR является TonB железа зависит от переносчика , который является предполагаемый целевой вакцины против Yersinia Pestis. Первоначально он был идентифицирован с помощью анализа микрочипов. Вот, шаги , которые были предприняты для определения структуры YiuR с помощью рентгеновской кристаллографии изложены (рисунок 9). Для клонирования ДНК-последовательность YiuR (минус сигнальная последовательность N-концевой) был ПЦР-амплифицирован из геномной ДНК, и субклониру.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
β-бочка ОМР выполняют важные роли в грамотрицательные бактерии, митохондрии и хлоропласты и являются важными объектами для структурного анализа, которые предлагают огромное количество информации о существенных молекулярных механизмов на внешних мембран этих соответствующих органелл. Тем не менее, производит достаточно образца для структурного анализа не всегда просто и, следовательно, общий трубопровод представлен для производства достаточного количества целевых ОМР β-ствола для определения структуры, объясняя подробно .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Эрве Селию из CNRS за предоставление UV-изображений, а также Криса Деттмара и Гарта Симпсона с химического факультета Университета Пердью за предоставление изображений SONICC. Мы хотели бы выразить признательность за финансирование со стороны Национального института диабета, болезней пищеварительной системы и почек и Программы внутренних исследований в Национальных институтах здравоохранения. Кроме того, мы хотели бы выразить признательность за дополнительное финансирование от Национального института общих медицинских наук (A.M.S. и C.J.), Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (N.N. 1K22AI113078-01) и Департамента биоло....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кристаллизационный робот | TTP Labtech, Art Robbins-Any | должен работать здесь, кроме LCP кристаллизационного | |
| ПЦР термоамплификатора | Eppendorf, BioRad-Media | ||
| Shaker | New Brunswick, Infors HT-UV-vis | ||
| спектрометра | Eppendorf-SDS-PAGE | ||
| аппарата | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE и нативные гели | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare-AkTA | ||
| Purifier | GE Healthcare-Микроцентрифуга | ||
| Eppendorf-Centrifuge | |||
| (низкая-среднескоростная) | Beckman-Coulter-Ultracentrifuge | ||
| (высокая скорость) | Beckman-Coulter-SS34 | ||
| ротор | Sorvall-Type | ||
| 45 Ti ротор | Beckman-Coulter-Type | ||
| 70 Ti гомогенизатор | Beckman-Coulter-Dounce | ||
| Fisher Scientific | 06 435C | ||
| Emulsiflex | Avestin-Dialysis | ||
| tubeing | Инструменты Sigma | D9652 | |
| LCP | Hamilton, TTP | Labtech-VDX | |
| 24 лунки | Hampton Research | HR3-172 | |
| Сэндвич-пластины | Hampton Research, молекулярные размеры | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Кристаллизационные листы Grace | Bio-Labs | 875238 | |
| колонка HiPrep S300 HR GE | Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-сефарозная колонка | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Кристаллизационные экраны | Hampton Research, Qiagen, Molecular | Dimensions-Газонепроницаемый | |
| шприц (100 мл) | Hamilton |
Ссылки
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
