Этот протокол описывает использование иссеченных препаратов кишечной ткани или "кишечных мешочков" в качестве модели ex vivo функции кишечного барьера. Эта модель может быть использована для оценки целостности как эпителиального барьера, так и слизистого слоя геля в определенных участках кишечника в животных моделях заболеваний пищеварительной системы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экс Vivo Кишечные Sacs для оценки слизистой проницаемости в моделях желудочно-кишечные заболевания
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эпителиальный барьер является первым врожденным защита желудочно-кишечного тракта и избирательно регулирует транспорт из просвета к нижележащим тканях, ограничивая перенос мелких молекул через эпителий и практически полностью запрещающий эпителиальную макромолекулярную транспорт. Эта селективность определяется слизистой слоя геля, который ограничивает транспорт липофильных молекул и обоих апикальных рецепторов и узких соединительных белковых комплексов эпителия. В пробирке модели культуры клеток эпителия удобны, но в качестве модели, им не хватает сложность взаимодействий между микробиоты, слизистой-гель, эпителий и иммунной системы. С другой стороны, в естественных условиях оценка поглощения или проницаемости кишечника может быть выполнена, но эти анализы измерить общую желудочно-кишечную абсорбцию, без указания площадке специфичности. Экс естественных проницаемости анализов с использованием "кишечные мешочки"; являются быстрый и чувствительный метод измерения либо общую целостности кишечного или сравнительный перевозки конкретных молекулы, с дополнительным преимуществом кишечной специфики сайта. Здесь мы опишем приготовление кишечных мешков для исследований проницаемости и вычисление очевидно проницаемости (P приложение) молекулы через кишечный барьер. Эта техника может быть использована в качестве метода оценки абсорбции лекарственного, или изучить региональную эпителиальный барьер дисфункции у животных моделях желудочно-кишечных заболеваний.
Введение
Кишечного эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта является площадь поверхности слизистой оценивается в 400 м 2 в взрослого человека. Следовательно, она постоянно подвергается вызов от микробов, попадает препаратов, питательных веществ и бактериальных токсинов. Хост должен не только различать приемлемые синантропных бактерий и потенциально патогенных микроорганизмов, но должна предотвратить эти виды и их секретируемые молекулы от пересечения эпителиальный барьер, в то же время позволяя поглощение питательных веществ. Таким образом, роль кишечном эпителии будет действовать в качестве селективного барьера к просветными Содержание 1. Это достигается, в частности, путем врожденной эпителиальной защитной системы на слизистой, который действует через реагировать биологической системе, состоящей из конститутивных и индуцируемых механизмов 2.
Потеря функции эпителиальный барьер является патологией, что является характерной чертой ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта. В естественных условияхэкспертиза эпителиальной барьерной функции могут быть оценены через желудочный зонд молекулы индикаторного и последующего анализа сыворотки 3. Однако эта методика не дает никаких указаний на сайт барьерного дисфункции. В пробирке и экс естественных оценки сопротивления трансэпителиального использованием Transwell системы 3 и Ussing камеры 4,5 соответственно, которые обычно используют в качестве суррогатных маркеров эпителиальных барьерной функции, но не хватает способствуя физиологию болезни животных моделей 6. В этом протоколе мы опишем модель подготовки экс виво ткани, обеспечивающую прямое и локализованное оценку кишечной целостности и который может быть использован для оценки слизистой барьерной функции при нескольких уровнях. Важно отметить, что эта методика может быть применена к животных моделях болезни, или может быть фармакологически манипулировать, чтобы позволить в глубине допроса слизистой барьерной дисфункции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все животное работа в этом протоколе производится при строгом соблюдении университета комитета Ньюкасл животных этике утверждены процедуры.
1. Подготовка инструментов, питательных сред и блюда
- Предварительно теплой СМИ 199 (TC199) или Игла в модификации Дульбекко (DMEM) СМИ до 37 ° С. Предварительно кислородсодержащих среда барботированием с 95% O 2/5% CO 2. Убедитесь, что среда имеет конечный рН 7,3.
- Подготовьте шва путем разрезания два 5 секций см для каждого мешка. Петля швы в незамкнутой узел.
2. Вскрытие и подготовка желудочно-кишечного тракта
- Вывод твердой пищи 12 ч, прежде чем эвтаназии. При желании, разместить животных на питательных добавок геля в течение этого времени.
- Эвтаназии мышей от передозировки пентобарбитоном натрия ([200 мг / кг], внутрибрюшинного введения) с последующим смещением шейных позвонков, в соответствии с институциональной этике протоСтолбцы и брызги 70% этанола на брюшной полости и грудной клетки.
- Используя ножницы, создать горизонтальную разрез в середине живота и выставить брюшины.
- Продолжить, чтобы отделить и удалить желудочно-кишечного тракта путем разрезания верхней части тонкой кишки из желудка в пилорического сфинктера и резки толстого кишечника у ануса. Используйте пинцет, чтобы мягко удалить брыжейки. Поместите кишечный тракт в предварительно подогретый, насыщенный кислородом среде.
- Определить секцию кишки должны быть оценены на проницаемость (Рисунок 1) и сократить секцию свободной от остальной части кишечного тракта.
- Для того чтобы поддерживать согласованность между животными, измерить секции двенадцатиперстной кишки и тощей кишки по отношению к животу, и измерять участки толстой кишки и подвздошной кишки по отношению к слепой кишке.
- При выборе участков ткани, обратите внимание на наличие слизистой ассоциированных лимфоидных тканей, таких как пейеровы бляшки. Они могут быть определены как небольшой кивокмологий на серозную сторону просвета.
- Использование 1 мл шприц, осторожно промойте просвета содержимое кишечного сегмента в чашку Петри с предварительно нагретой PBS (37 ° C). Эти фекальные содержание может быть отброшен или хранили при -80 ° C для последующего анализа по желанию.
3. Подготовка кишечника Sacs
- Приготовьте 1 мл шприц с объемом 300 мкл тестируемого соединения или молекулы. Для целостности слизистой, 1 мг / мл раствора FITC-декстрана M.Wt. в 4400 может быть использован. Зонды, начиная от 4,400-70,000 Da размера могут быть использованы для увеличения чувствительности. Надежно закрепите небольшой животное сосудистой катетера на шприце.
- Мера 5 см от открытия кишечного сегмента и связать сегмент надежно закрыта с шовным-петле в этой точке. Аккуратно поместите предварительно связаны шовный петлю вокруг отверстия кишечника и вставьте притупляются катетер. Вытяните петлю закрыта таким образом, чтобы обеспечить кишечного сегментаи освободить объем 300 мкл из шприца в кишечнике, гарантируя, что весь раствор впрыскивают.
- Аккуратно удалите катетер одновременно потянув шовный петлю, чтобы закрепить закрытие кишечного мешка. Вырезать кишечный мешок сыпучих из кишечника и поместить в 50 мл коническую трубку, наполненную 20 мл обогащенной кислородом среде, предварительно нагретой до 37, чтобы ° С.
4. Измерение проницаемости
- Место конические пробирки, содержащие кишечную мешочки в ванну с подогревом воды установлен в 37 ° С. На 0, 30, 60, 90 и 120 мин временных точках, взять пробу 100 мкл из конической трубе и переходом на 96-луночный планшет, заменив объем с 100 мкл свежей среды в каждом случае.
- После окончательного берут пробу, разрезать мешочки в точке шва и вниз по длине отрезка, подвергая поверхность слизистой.
- Измерьте длину и ширину каждой кишечного сегмента. Если Дезикрасный, оснастки заморозить сегменты и хранить при температуре -80 ° C для белка или биохимического анализа, или альтернативно, в магазине в стабилизации РНК раствора для молекулярных анализов.
- Построить стандартную кривую журнала разведений для FITC-меченых молекул от 1 до 1 × 10 -6.
- Образцы Мера и стандарты для FITC на флуоресцентной ридере, FITC возбуждения / испускания: 495 нм / 519 нм.
5. Расчет кажущейся проницаемости для каждого отдельного кишечной Сак
- Преобразование единиц времени, чтобы сек.
- Для каждой временной точке, вычислить кумулятивную концентрацию, Q
Q T = (С Т * У г) + (Q T сумма * V s), где:
Q T = Накопительное концентрация в момент времени т
С т = Концентрация в момент Т
V R = Объем при стороне приемника
Q T сумма = сумма всех предыдущих Q T
= V SОбъем пробы - Участок Q от времени (Т) и вычислить наклон: δQ / & delta; t
- Вычислить кажущуюся проницаемость (P приложение)
Р приложение = (δQ / & delta; t) / (А * Co), где:
А = площадь ткани
C 0 = Исходная концентрация
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол может быть использован для изучения региональных изменений в барьерной функции кишечника на животных моделях желудочно-кишечных заболеваний. Измеряя поток от парацеллюлярной зонда по поверхности слизистой на разной областях желудочно-кишечного тракта 7, целостность эпителиальных плотных контактов может быть оценена. Кроме того, путем изменения характера парацеллюлярной зонда по размеру (Рисунок 2) или гидрофобность (рисунок 3), с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы подробно выделение и подготовку кишечника мешочков для оценки слизистой барьерную функцию Экс Vivo. Кишечные препараты SAC уже в основном были использованы в фармацевтических исследованиях, изучая поглощение кандидатов наркотиков через кишечник. Тем не менее, этот анализ в равной степени хорошо подходит для изучения кишечных заболеваний. Кишечная проницаемость может существенно варьироваться в зависимости от региона и сайт-специфической оценки проницаемости позволяет лучше понять регионального значения...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была профинансирована грантом Национального проекта по здравоохранению и медицинским исследованиям APP1021582 и грантом Института медицинских исследований Хантера, спонсируемым Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the Estate of the Late Leslie Kenneth McFarlane.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dekantel Нерассасывающийся шелковый шовный материал | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Не содержит фенола, так как он препятствует флуоресценции |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | Не содержит фенолового красителя, так как он влияет на флуоресценцию |
| N-ацетилцистеин | Sigma Aldrich | Использование при 10 мМ в среде | |
| Сосудистый катетер мелких животных: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4 400 МВт | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20 000 МВт | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70 000 МВт | Sigma Aldrich | FD-70 |
Ссылки
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
