Пространственно-временная Отображение подвижности в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подготовка кишечника

Краткое содержание

Недавно доступные методы видеозаписи и пространственно-временного картирования (STmap) позволяют визуализировать и количественно оценить как распространяющиеся, так и смешивающие паттерны перистальтики кишечника. Цель этого протокола — объяснить создание и анализ STmaps с помощью системы мониторинга перистальтики желудочно-кишечного тракта (GIMM).

Аннотация

Несколько подходы были использованы для записи и оценить моторику желудочно включая: записи изменений в мышечной напряженности, внутриполостной давлением, и мембранного потенциала. Все эти подходы в зависимости от измерения активности в одной или нескольких точках вдоль кишки одновременно, которые затем интерпретируются, чтобы обеспечить ощущение общей схеме моторики. В последнее время развитие видеозаписи и пространственно-временной отображение (STmap) методов позволили наблюдать и анализировать сложные узоры в бывших естественных условиях целых сегментов толстой кишки и кишечника. После регистрации и оцифровывается, видеозаписи могут быть преобразованы в STmaps, в котором диаметр просвета преобразуется в градации серого или [карты диаметр называется (Dmaps)] цвет. STmaps может предоставить данные о направлении моторики (т.е., стационарный, перистальтические, противоперистальтический), скорости, продолжительности, частоты и силы шаблонов сократительной подвижности. Преимущества этого подхода включают в себя: analysiс взаимодействия или одновременного развития различных форм подвижности в различных регионах в том же сегменте, визуализация подвижности шаблон меняется с течением времени, и анализ того, как деятельность в деятельности влияет одного региона в другой регион. Видеозаписи могут быть воспроизведены с различными сроками и параметров анализа, так что отдельные STmaps и узоры моторики могут быть проанализированы более подробно. Этот протокол специально детализирует последствия внутрипросветных живота жидкости и внутрипросветных стимулов, которые влияют на формирование моторики. Использование агонистов рецепторов просвета и антагонистов обеспечивает механистическую информацию о том, как определенные шаблоны инициируются и как один шаблон может быть превращено в другое рисунком. Техника ограничивается возможностью только измерить подвижность, который вызывает изменения в просвете диаметре, без предоставления данных об изменениях внутрипросветных давления или напряжения мышц, и по генерации артефактов на основе экспериментальной установки; хотя, analysiS методы могут объяснить эти вопросы. По сравнению с предыдущими методами видеозапись и STmap подход обеспечивает более полное представление о желудочно-кишечного.

Введение

Различные методы записи и анализа моторику кишечника были разработаны в течение последних 150 ^лет 1. Они варьировались от начального в естественных условиях наблюдения и описания Уильям Бомонт и Вальтера пушки на более поздних методов измерения и интерпретации мультисайтовой записи мышечного напряжения, внутриполостной давлением, и / или мембранного потенциала (т.е. соединительных потенциалы) ^{2 - 6.} Эти последние подходы обеспечивают снимок общей схеме моторики, но ограничены по количеству сайтов записи и действия интерполяции данных в областях между ними сайтов записи.

Недавнее развитие видеозаписи и пространственно-временной отображение (STmap) методов позволили наблюдать и анализировать сложные узоры подвижности в бывших естественных условиях целых сегментов толстой кишки и кишечника. Первоначальные подходы, впервые описанные для Интескишечные сегменты в конце 1990-х, ^7,8 зависели от следователя разработанное программное обеспечение для анализа видеозаписи, несколько групп уже созданы или изменены программное обеспечение для этой цели ^{2,8 - 12.} В то время как многие группы генерируется свои программные пакеты или плагины, все они анализируют диаметры сегмента ткани и конвертировать эти разные диаметры в оттенках серого представления. Коммерчески доступный записи и системный анализ называется системой мониторинга желудочно-кишечного тракта (GIMM) обеспечивает ключ подхода, который позволяет для анализа как пропульсивной моторики через определения фекального скорости осадок в свинки дистальной толстой кишки ^{13, а также} анализ движителей и смешивания моделей подвижности с стимул жидкости в неповрежденных сегментах кишечника ^{4,5,14 - 19.} Этот последний подход зависит от генерации и анализа STmaps и описан в этой статье. Цель этого метода является увеличение тон возможность качественно и количественно анализируют различные шаблоны подвижности в кишечнике. В то время как другие группы использовали STmap для анализа подвижности через свое собственное программное обеспечение, это первое описание, как использовать GIMM анализировать образцы моторики генерацией STmaps. В настоящей работе, мы предоставляем подробные шаг за шагом инструкции о: подготовке кишечника тканей для записи видео, правильной настройке параметров записи видео в максимально способности обнаруживать изменения в диаметре ткани, создание STmaps, а также Интерпретация и анализ STmaps с использованием системы GIMM и программное обеспечение ImageJ.

Способ, описанный здесь, является специфическим для анализа просвета перфузии жидкости или полутвердые вещества, содержащие соединения, которые влияют на кишечную перистальтику узоры. Способ анализа кала движения гранул описано в работе мужского пола и его коллеги ^13. Общий метод, описанный здесь может бытьприменены к другим трубчатых гладкомышечных органов, таких как: тонкой кишки, кровеносных сосудов, мочеиспускательного канала, мочеточников и др Хотя этот метод сам по себе не обеспечивает данные по изменению давления или напряжения мышц, она может быть в сочетании с использованием давления преобразователи, датчики силы или электрофизиологические измерения, чтобы обеспечить более полное представление о моделях моторики, как некоторые другие группы показали ^2,15,20,21.

Протокол

Институциональная Уход и использование комитета Университета Содружества Вирджинии в животных (IACUC) одобрил все животные и процедуры эвтаназии, используемые в настоящем протоколе.

1. Подготовка решений

1. Подготовьте 4 л буфера Кребса (в составе [в мм]: 118 NaCl, KCl, 4,75 1,19 _КН 2 _РО 4, 1.2 _MgSO 4, 2,54 CaCl _2, 25 NaHCO _{3, 11} глюкозы). Взвесить соответствующих количеств каждого твердое химическое вещество, помещенной в соответствующем объеме деионизированной воды и перемешать с помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным.
2. Затем аэрации раствора с carboxygen (95% O _2, 5% СО ₂₎ в течение 30 мин при нагревании до 37 ° С.
3. Определить рН раствора при 37 ° С (той же температуре, что и в ванночку) и в то время доведения рН до 7,4, если это необходимо с помощью HCl. Хранить буфер Кребса непрерывно carboxygenated и при 37 ° С по всей длине эксперимента.
4. Положилприток и отток труб от перистальтических насосов в резервуар буфера и очереди на перистальтических насосов, чтобы начать перфузии буфера в течение труб и органов системы ванны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер не может быть изначально закачивается обратно в оригинальной упаковке до того либо ткани в банях органов или химических веществ в буфер перфузии. Это уменьшает общее количество буфера, необходимую для экспериментов. Тогда выходной буфер перфузии линии должны быть помещены в пустую емкость, чтобы входящих и выходящих буферов не смешиваются.
5. Калибровка температуры отопительной системы на термостаты таким образом, что буфер в ваннах органов становится и остается 37,0 ± 0,5 ° C на протяжении всего эксперимента. Подтверждение и при необходимости изменить рН буфера Кребса в, по меньшей мере еще один раз перед размещением сегментов ткани в ванне на шаге 2.8.

2. Подготовка тканей

1. Эвтаназииморская свинка с использованием ингаляции диоксида углерода / удушья в герметичной камере или другим способом эвтаназии, утвержденной местной ухода за животными и использование комитета.
2. После подтверждения эвтаназию животного, разрезать брюшную стенку в продольном направлении рассечение ножницами и найти кишечник. Сокращение брыжейки, прикрепленный к тонкой кишке, чтобы помочь подвергать слепой кишки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить, эвтаназия выполнить вторичную процедуру, как двустороннего торакотомии, как утверждается для ухода за животным и использование комитета.
3. Расположить дистальный конец слепой кишки и секут проксимальном отделе толстой кишки, расположенной по периферии его подключения к слепой кишке. Затем секут проксимальном отделе толстой кишки снова ~ 8 см дистальнее первого рассечения.
4. Поместите ткань толстой кишки в подогретой и carboxygenated раствором Кребса (описанного в разделе 1) для дальнейшего вскрытия. Pin двоеточие в рассечение ванны и использовать меньший набор ножниц, чтобы удалить как много брыжейки и жира, как это возможно.
5. В чeated рассечение лоток, удалите все содержимое в просвете осторожно перфузии буфера Кребса через просвет, используя шприц, соединенный с тупым концом катетера (для предотвращения перфорации ткани). Избегайте чрезмерной растяжение сегмента во время этого процесса перфузии.
6. Получить две стеклянные трубки катетера огневой полировкой (диаметр 3 мм) и поместите короткий кусок полиэтиленовой трубкой (~ 3 мм длиной и 3 мм ~ диаметр) вокруг части стеклянной трубки, поступающего в ткани просвет.
   Примечание: Это позволит шов, чтобы быть размещены вокруг ткани и стеклянной трубки, чтобы оставаться безопасным и не выскальзывает, как препарат помещают в ванночку и при изменении длины ткани.
7. Вставьте один катетер в полость конце препарата ткани и связать нить вокруг маленького кусочка трубки, окружающей катетер с использованием узел хирурга. Аккуратно пытаться тянуть катетер обратно, чтобы узел уютно. Затем выполните те же действия с другой катетер, входящего тон аборальных конец ткани.
8. После того, как катетеры обеспечены, переместить весь препарат (ткань плюс катетеры) от вскрытия лоток в один из ванны органа. Поместите подготовку в ванну с ротовой конце, обращенном в сторону от пользователя.
9. Затем смонтировать / обеспечить стеклянной трубки катетера в ванну органа одной из двух предложенных методов.
   Примечание: Защита стеклянных трубок предотвратить сегмент ткани от изменения длины в ходе эксперимента или прихода над уровнем поверхности буфера Кребса в ванне.
   1. Вариант А: Безопасный верхнюю часть стеклянной трубки к верхней части боковой панели пластиковой ванне для органов за счет использования глины Mölder или пластиковой клипа.
   2. Вариант Б: Безопасный стеклянных трубок в металлических опор, которые держат над подготовкой орган ванны камер с использованием пластиковых зажимов.
10. После того, как катетеры обеспечены в ванну, приложить 5-см кусок трубы к открытому концу каждого катетера. Для орального кошкиheter, присоединить этот трубопровод к 10-мл шприц, который будет использоваться для введения буфера в просвет проксимального сегмента ободочной. Для аборальной катетера, этот кусок трубы позволит просвета отток должен быть направлен в емкость сбора (50 мл стакана, водохранилища и т.д.).
11. Использование шприц, присоединенный к концу полости, медленно нагревали флеш буфер Кребса через ткань, чтобы обеспечить просвет, что жидкость может протекать через ткань. Поток подтверждается жидкость, выходящая спинной катетер. Калибровка видео-записи системы (раздел 3) протокол в то время как ткани уравновешивает в течение 30 мин.

3. Калибровка Видео-записи системы

1. Калибровка размещение высоты камеры, настройки видео для яркости и контрастности, а горизонтальное расстояние с помощью программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшие настройки для внутрипросветных перфузии установок отличаются от настроек, используемых для определения скорости движения гранул ^13.
2. Клиск на вкладке эксперимента для камеры должен быть откалиброван. Затем в меню "Файл" выберите "Калибровка".
3. После того как видео появляется в "калибровки" окна рабочей станции, установите камеру на высоте, где образ включает концы катетеров, вставленных в просвете ободочной кишки.
4. Затем, калибровки горизонтального расстояния смотреть в изображении с помощью полупрозрачного правитель наклейку, прикрепленную к каждой бане.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта калибровка имеет решающее значение для более поздних программных расчетов просвета и скорость сократительных волн.
5. В этом же окне "Калибровка рабочей станции", установлен красные вертикальные направляющие так, чтобы они 10 мм друг от друга в соответствии с линейкой в ​​изображении камеры. Затем введите соответствующее расстояние (10 мм) в окне «Расстояние курсоры» и нажмите кнопку 'CAL'.
6. Затем отрегулируйте усиления, яркости, и затвор ползунки в окне "откалибровать" станцию, чтобы изменить образ камеры, чтосегмент ткани выглядит как темный силуэт на светлом фоне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 4 показывает хорошие и плохие примеры этой процедуры калибровки.
7. Чтобы правильно настроить изображение, а также настраивать фокус и диафрагму ручки на самой камере.
8. Калибровка завершена. Нажмите кнопку "Сохранить", а затем нажмите кнопку "OK" в всплывающем и, наконец, нажмите кнопку 'EXIT'.

4. Генеральный экспериментальные процедуры

1. После процедуры калибровки камеры и 30 мин ткани равновесия являются полными, назвать испытания в каждой экспериментальной протокола. Имена Пробные может быть на основе имени и концентрации соединения и объема жидкость intraluminally перфузии в сегменте ткани во той части эксперимента.
2. Затем закрывают пробирку, выступающий из спинной катетер посредством использования зажима трубы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвращает жидкость из просвета выхода спинных конца во время фуrther эксперименты, позволяет использовать конкретных объемов в просвете спровоцировать различные уровни живота (рис 1).
3. Вводите примерно 0,7 мл буфера Кребса в проксимальных толстой просвета, чтобы обеспечить достаточно живота инициировать пропульсивной схватки у морской свинки экс естественных условиях подготовки.
   Примечание: Этот объем может слегка отличаться (0,1 - 0,2 мл) в зависимости от общей длины сегмента интактной и количества участке, приложенного к сегменту в ванночку.
4. После того, как сегмент растянут по просвета жидкости, включить камеру, а затем записать моторику течение заранее определенного периода времени (например, 10 мин).
   1. В частности, дважды щелкните по имени суда надлежащим образом, чтобы открыть экспериментальный вид камеры, а затем нажмите тумблер в положение "ON", чтобы просмотреть поле камеры. Затем нажмите кнопку записи, чтобы начать запись (кнопка записи будет оставаться красным, пока фотокамера записи) ай нажмите кнопку записи, чтобы остановить запись.
5. В конце этого начального управления живота суда, ослабьте / снять хомут загораживает спинной катетер, чтобы позволить сегмент ткани, чтобы продвинуть растяжения жидкости из просвета.
6. После 10-минутного периода повторного уравновешивания повторить эту процедуру с любым из различных питательных веществ, биоактивных агентов, наркотиков, или агонисты / антагонисты в просвете жидкости модифицировать пропульсивной моторики сегмента (например, короткоцепочечных жирных кислот или декановой кислота) ^10,18.
   1. Чтобы помочь калибр, когда новая экспериментальная жидкость поступает в толстой сегмент, оставьте воздушный пузырь рядом с портом шприца так, что при перфузии нового решения в просвете ободочной кишки прогресса пузыря позволит пользователю знать, когда экспериментальный жидкость Достигнуто просвет.
   2. Продолжить перфузии с внутрипросветный спинной катетер открытой до тех пор, пока пузырь был полностью протолкнулпросвета система перфузии (может потребоваться 2-3 мл перфузат). Тогда, позвольте сегмент ткани, чтобы изгнать жидкости через открытый спинной катетер до 5 мин.
      Примечание: После этой процедуры, просвет будет содержать незначительное объем жидкости, что позволяет перфузии известного объема жидкости в просвет.
7. Повторно закупоривать аборальной просвета трубки катетера с помощью зажима труб (как на шаге 4.3) вводят такой же объем жидкости, как растяжения в состоянии управления через шприц. Запись образцы моторики в ходе экспериментального периода для последующего анализа и сравнению с контрольной Кребса состоянии (как на шаге 4.5).
8. Повторные разделах 4.4 - 4.7 протокола с различными просвета соединений или различных концентраций же просвета соединения.

5. Строительство пространственно-временных Карты (STmaps)

1. После завершения записи эксперимент, дважды щелкните имя определенного суда, чтобы открыть анализа ветервл для строительства STmap.
2. В области воспроизведения видео, настроить контрастность и яркость ползунков в окне анализа, чтобы сделать изображение подходит для анализа (черный силуэт ткани на светлом фоне; рисунок 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если калибровка камеры не была выполнена надлежащим образом, прежде чем начать эксперимент изображение может быть изменен только в меньшей степени в этой точке.
3. После того как изображение противопоставляется должным образом, установите горизонтальные и вертикальные красные принципы в окне видеоизображения изолировать регион тканей для анализа и удаления областей, содержащих артефакты. Кроме того, выберите соответствующую сегмент времени от записи путем определения начала и окончания моменты времени для анализа.
   1. В частности, выберите начальную и конечную точки в пределах видео с помощью зеленой кнопки желтый 'B' 'A' и в программном обеспечении анализа. Установите ползунок времени начала видео сегмента для анализа ап нажмите зеленый 'A' кнопку. Затем установите ползунок до конца сегмента, анализировать и нажмите желтую кнопку 'B'.
4. Затем нажмите на вкладку "Анализ" двигатель, чтобы открыть окно STmap и нажмите кнопку "секундомер". После нажатия секундомер, рядом нажмите перекрестье курсора в черный силуэт ткани внутри видеоролика, чтобы начать STmap поколения.
5. После нажатия на перекрестие в силуэте ткани, программное обеспечение генерирует и отображает STmap для этого региона видео.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько минут в зависимости от длины видео, выбранной для анализа.
6. Нажмите кнопку "зума", чтобы просмотреть увеличенное изображение STmap и управления для регулировки изображения.
   1. Выберите опцию '' Цвет в недавно созданного окна, чтобы посмотреть, как цвет STmap вместо серого. Кроме того, выберите опцию "Включить", чтобы иметь возможность разместить курсор на конкретных пикселей в карте и противМЭН в розыск изменения в просвета для этой конкретной ткани регионе. Нажмите "Exit", когда закончите.
7. Экспорт STmap для использования в работах или презентаций или для анализа далее в ImageJ, выбрав в меню "Файл", затем выбрав "Экспорт данных", а затем "Meta File '. Тогда назовите STmap, который будет сохранен в качестве .emf файл и нажмите кнопку «Сохранить».
8. С другой стороны, сохранить образы STmap захватив скриншот. Это необходимо, чтобы сохранить псевдо-цветовых версии STmap.

6. Анализ сократительной скорость волны в STmaps

1. Для анализа скорости распространения сократительной или продолжительности сокращений, сначала преобразовать в STmap .emf файл .tiff, .gif, .jpg, .bmp или форматах, которые приемлемы для ImageJ через преобразования файлов программы выбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ не открыть формат выходного .emf из STmaps от программного обеспечения.
   1. АльтернативныеЭли, использовать программное обеспечение для захвата экрана, чтобы взять картину STmap на экране и сохранить его в соответствующий формат файла.
2. Затем откройте переформатирован STmap в ImageJ и откройте плагин GIMMProcessor открыв "" меню и выбрать «плагинов GIMMProcessor». Это откроет оба "GIMMProcessor" и "Измерения" Таблица окна.
3. Нажмите кнопку "прямоугольный инструмент выбора" в пределах окна ImageJ, а затем использовать его обрисовать, перетащив всю площадь масштабная линейка в правом верхнем углу STmap. После выбора, что область, нажмите кнопку "установить калибровочный 'в плагине. Наконец, вставьте соответствующее расстояние (мм) и время (сек) в поле калибровки в соответствии со значениями на линейка и нажмите кнопку "Готово".
4. Затем нажмите линии инструмент для рисования в окне ImageJ. Нарисуйте линию на STmap через центр сокращению распространяющейся вдоль угла гое наклон, перетаскивая на изображение STmap. С другой стороны, проведите вертикальную линию через полосы сокращения без распространяющейся определить продолжительность сжатия.
5. После линия рисуется нормально (только одна линия может быть обращено в то время), нажмите кнопку "принять измерение" в плагине, чтобы создать считывания из горизонтального расстояния, расстояние по вертикали, и по наклону прямой; которые соответствуют длине (мм), время (сек), и скорости (мм / сек) соответственно. Эти данные отображаются в окне "Измерения Таблица».
6. Повторите рисунок линии и анализ шаги несколько раз в течение заданного STmap и сохранить данные в файл .gmd. Нажмите кнопку "Сохранить" в плагине и имя файла. Затем нажмите кнопку "Сохранить" еще раз, чтобы завершить процесс. Эти данные впоследствии могут быть по сравнению с другими пробных данных или использовать повторно рисовать линии на STmap.

Результаты

Понимание Пространственно-временные Карты (STmaps) как диаметр Карты (Dmaps)

Хотя карты, генерируемые этой техники пространственно-временное, изменение просвета ткани является параметром, специально визуализированы в расстояния и времени. STmap изображает горизонтальное расстояние вдоль ткани сегмента на оси х (в мм) и время на оси у (в сек) со временем, начиная с верхнего и заканчивая временем на дне. В правом верхнем углу есть легенда, которая отображает минимальные и максимальные диаметры просвета, а также масштабирование и для х и у топоров (рис 1-4). Таким образом, различные оттенки пикселя в пределах полутоновое изображение соответствуют различным диаметрам просвета. Более темные пикселы соответствуют большими диаметрами и более легкие пикселей соответствуют меньших диаметров. Таким образом, сократительные волны круговой мышцы будут выглядеть как регионы светлой пикселизацией из-за уменьшения диаметра просвета ( Рисунок 1 черные стрелки). В противоположность этому, в просвете живота за счет кругового мышечной релаксации или большим болюса жидкости будет вызывать увеличение просвета диаметра и темные пиксели в (белыми стрелками 1, c) STmap / DMAP. Дальнейшее обсуждение формирования и смысла STmaps можно найти в работе группы ЛАММЕРС ^11.

Luminal Растяжение-индуцированные распространяющихся Схватки

На рисунке 1, морской свинки проксимальном отделе толстой кишки был растянут 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 мл буфера Кребса в течение 5 минут при каждом объеме. Распространяющихся схватки были, вызванное всех объемов ≥1.0 мл и появляются как тонкие белые полосы в STmap (рис 1). Растяжение из просвета кишечника вызывает возбуждение, распространяющихся сокращений. Как показано на фиг.1, диаметр просвета возрастает с большей внутрипросветных объемов и пиксели в STmapсоответствующая этому диаметру становится темнее создает общую фон темный. На некотором уровне живота перистальтического рефлекса активируется (1,0 мл; Рисунок 1), который инициирует пропульсивной волны сжатия при оральной конце, которые уменьшают диаметр просвета и двигаться в направлении анального конце сегмента (показано в виде белых полос на рисунках 1 и 4). Группа, представляющая сокращение белого часто предшествует темной полосы, которая представляет спинной отдых впереди волны перистальтики (рис 1С белые стрелки). Эти белые и темные пикселы соответствуют восходящей и нисходящей сокращения релаксации компонентов перистальтического рефлекса, соответственно ^22,23. В STmap на рисунке 1 панели А, есть 0 пропульсивной волны на 0,0 мл, 0 пропульсивной волны на 0,5 мл живота, 3 пропульсивной волны на 1,0 мл живота, 6 пропульсивной волны на 1,5 мл живота, и 5 пропульсивных машетт 2,0 мл живота.

Питательные индуцированных Стационарные / смешивания Схватки

Волны распространения сокращение не только моторика шаблон, который может быть визуализированы STmaps. Смешивание узоры подвижности, такие как сегментация может также рассматриваться в STmaps и соответствующего изображения (фиг.2А). Эта модель отличается распространения схватки. Во время смешивания моделей множество мелких, стационарные схватки происходят в различных областях, в то же время (представленных в нескольких маленьких белых квадратов в одной горизонтальной линии, но не касаясь друг друга). Хотя каждый сегментарный сжатия находится в неподвижном состоянии и не двигается в полости к анальному образом, как описано для распространения сокращений, способность к STmaps чтобы проиллюстрировать сложные узоры сократительные течение длительных периодов времени позволяет визуализировать медленного прогрессирования сокращений анально с течением времени (фиг.2А черная стрела). Продолжительностькаждая отдельная сжатия также может быть определена путем составления вертикальную линию через белый сжатия площади с использованием ImageJ и связанный модуль (фиг.2А). В данном конкретном STmap генерируется из внутри толстой перфузии короткоцепочечных жирных кислот, средняя продолжительность стационарного сжатия составляет ~ 2 сек (диапазон: от 1,9 до 2,1 сек). В то время как остальные брыжейки на отрезке ткани может вызвать артефакты в анализе, вертикальные линии артефакты, генерируемые брыжейки (фиг.1В, 2В) может быть использован для определения продольных мышечных движений. В фиг.1В и 2В горизонтальное движение черной вертикальной линии из-за сокращение и расслабление мышцы продольной. Это боковое перемещение продольной мышцы могут быть визуализированы на STmaps как горизонтальных движений вертикальных полос, генерируемых брыжейки артефактов (фиг.1В, 2В).

ImageJ и Plugiп Анализ STmaps

И скорость распространяющейся волны (рис 3), а также продолжительность сокращения (рис 2) может быть определена с помощью ImageJ и плагина GIMMProcessor. На рисунке 3, скорость распространения и прямоходящий и ретроградных волн составляла ~ 0,25 мм / сек (диапазон: от 0,21 до 0,35 мм / сек). Как можно видеть на видеоизображении над картой ST, линии анализа (красные линии, образующие окно на видеоизображение) были установлены точно вокруг одного края участка ткани, а не вокруг всего сегмента. Это важное применение руководящих принципов в программном обеспечении. Точная настройка этих принципов имеет решающее значение для правильного анализа видео, дальнейший анализ в разделе обсуждения. Это позволяет генерацию STmap, что визуализирует миогенные рябь сокращения ^24. Эти схватки миогенной происхождения и не изменить просвета диаметр значительно. Кроме того, разные режections распространения (прямоходящий или ретроградная), которые являются общими для рябь, могут быть проанализированы с помощью этой техники (рисунок 3). Как показано на рисунке 2, длительность сокращения может варьироваться в разных регионах участка ткани.

Правильное Анализ STmaps

Одним из потенциальных вопрос с созданием STmaps можно поколения артефакт из-за экспериментальной методологии. Например, брыжейки оставили на внешней стороне ткани будет увеличить диаметр чтение для той части ткани, создающего вертикальную черную линию на STmap (фиг.1, 2B). Наличие брыжейки также искусственно расширяет полутоновое карту, увеличивая широкое измерение просвета, что приводит к затуплению контрастных измерений шкалы. По этой причине лучше всего удалить брыжейки как можно полнее из сегмента без перфорации ткани. Другой возможный STmap артефакт представляет собой белый вертикальной линии связи с пузырьками внутри просвета жидкости, которые не могут быть противопоставлен черный (фиг.4В). Эти пузыри могут сделать диаметр просвета появляются меньше на программное обеспечение для анализа или наложения белый / свет регионы по лекалам моторики в STmap. Таким образом, установка сегмента ткани и надлежащего противопоставления видеозаписи перед анализом абсолютно решающее значение для успеха в построении STmaps (рисунок 4). Собственные и несобственные контрастные установок приведены на рисунке 4. Важно отметить, что корректировка видео в обоих калибровка камеры предварительного эксперимент и окно анализа пост-эксперимент имеет решающее значение для правильного формирования и анализа STmap. Неправильное калибровки изображения может привести к STmaps с непригодных данных (рис 4а).

700 "/>
Рисунок 1. Волны, распространяющиеся в проксимальных Колон. (А) Кривая живота-ответ (выполняется в морской свинки проксимальном отделе толстой кишки) был использован для определения соответствующего объема жидкости в просвете инициировать распространяющихся волн в этом сегменте (белые горизонтальные полосы). Черные стрелки иллюстрируют примеры полнометражных распространяющихся волн. Белые стрелки показывают артефакт линии, вызванного неполным удалением брыжейки. (Б) ближе вид распространения сокращения, достигнутые поколения STmap из эксперимента, аналогичной панели А, но видео меньшей продолжительности. Легче отметить, что схватки прогресс в устной к анальному направлении и определить предыдущий аборальных релаксации, представленного в темной области перед белой полосы по сравнению с панели А. Эта карта также обеспечивает другой вид брыжейки артефактов. Красный ящик идентифицирует область этом STmap расширен в панели C (C) Эта панель показывает еще ближе вид Oе то же видео и карту, как в панельных Б. Белые стрелки с надписью «Жидкость Растяжение 'точка темных пикселей, которые из-за Luminal живота жидкостью спинной к распространяющейся волны. Эти регионы, где круговая мышца происходит релаксация спинной круговой мышечного сокращения. Обратите внимание, что распространяющиеся сокращения выглядеть совершенно горизонтальных линий в панели А из-за долгого сроки карты. В панели В и С того времени масштабы все короче, так что сократительная волна имеет наклон, который может быть измерено и сообщено как скорость движения волны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Определение сжимающих Продолжительность от STmap. (А) Морская свинка проксимальных толстой кишки шпотоки в смешивание / сегментной подвижности структуры в ответ на внутрипросветного перфузии короткоцепочечных жирных кислот (бутират). Вертикальные красные линии были нарисованы через периоды сокращения, чтобы определить продолжительность сжатия с помощью изображения J и плагин GIMMProcessor. Черная стрелка показывает спинной направление распространения стационарных сокращений. (Б), распространяющихся схватки в подвздошной кишке мыши часто показывают регионы устойчивого сокращения. Вертикальные стрелки нарисованы на этой карте, показывают, что более устные регионах оставались контракт на более длительный срок. В этом препарате, анальный конец подготовки была закрыта, чтобы предотвратить жидкость от выхода из системы во время закрытого ткани сокращений. Изображение в верхней части панели показывает время, когда весь устный конец ткани контракту (белый) на STmap, в то время как весь анальный конец растянут по жидкости (черный на STmap). Горизонтальная / боковое перемещение вертикальной черного в середине панели В STmap показывает движениепродольный слой мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Двунаправленная подвижности Шаблоны. Распространение волны могут двигаться в обоих прямохождения (полостью рта анальный) и ретроградной (анальный на устные) направлениях. Твердые черные стрелки показывают нормальную распространение ортоградное и пунктирные черные стрелки показывают ретроградной распространение. Скорость распространения как прямохождения и ретроградных сокращений в этом STmap были определены путем анализа ImageJ и были ~ 0,25 мм / сек. Анализ изображений линий (красные линии, образующие окно на видео изображение выше) STmap были установлены рядом с одного края ткани, чтобы визуализировать миогенные рябь сокращения, которые низкая амплитуда, мелкие схватки часто ориентированные прямохождения, гetrograde, или в обоих направлениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. важность правильного контрастное изображение для STmap поколения. (А) показывает неправильно контрастное изображение и STmap, а панель В показывает правильно контрастное изображение и STmap. В (А) горизонтальные полосы, полученные белые с должным контрастное изображение (B) не столь очевидны, и есть несколько артефактов (белый оттенок) из-за исходное изображение в оттенках серого бытия. В STmap генерируемого из правильно контрастное изображение (б) белые затенения артефакты серого исчезают, и распространяющиеся волны более выражены. Кроме того, черный затенение, представляющий релаксации ахEAD семенного сократительной волны можно увидеть в анальном конце STmap с каждой волны сжатия. В панели B белые стрелки иллюстрируют артефакт STmap порожденное области изображения, которые не могут быть должным образом контрастирует. Этот тип артефакта в основном за счет внутрипросветных пузырьков, которые иногда возникают в процессе подготовки ходе экспериментального протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Моторику кишечника был просмотрен и описаны с различных точек зрения, основанных на природе параметров записывается. Запись видео и пространственно-временной отображение доказал ценный инструмент, который позволяет анализ общего движения и / или приведения в движение в течение длительного сегментов кишки, а также анализ деятельности в определенных точках вдоль сегмента. Подход к видеозаписи и пространственно-временной отображения может быть в два раза и отражает области рассмотрены и природы просвета содержимого. В кишечных сегментов, где просвета содержание больше жидкости, а в проксимальном отделе толстой кишки, где содержание больше полутвердый, активность индуцируется внутрипросветного введения жидкости болюсным вливанием или. Пространственно-временные карты, изготовленные из этих видеозаписей предназначены для представления движения всей сегмента, как описано выше. В противоположность этому, в середине-дистального отдела толстой кишки Если содержимое более прочной, активность инициируется посредством введения фекальной Pelleт (с эпоксидным покрытием природный или искусственный гранул гранул) и пространственно-временные карты разработаны с учетом движения гранул через толстую кишку, как показано в статье JOVE Гофмана и др., ^13. Таким образом, настройка эксперимента и анализа являются критическими и зависят от типа стимула и области изучается. Таким образом, критические шаги для генерации и анализа пространственно-временных карт жидкости, вызванной моторики кишечника: 1) собственно удаление брыжейки от рассеченной ткани; 2) собственно калибровки изображения перед записью; 3) собственно удаление артефактов во время генерации и анализа STmap; 4) собственно установки системы анализа; и 5) набирает ловкость катетеризировать и шовные сегменты, не повреждая их.

Хотя использование STmaps диаметром просвета улучшили способность визуализации и анализа полных моделей подвижности по области кишечника, методика лучше всего использовать в сочетании сфункциональные измерения давления или сокращение мышц ^2,15,20. Например, в то время как некоторые мышечные сокращения могут изменить просвета диаметр чуть-чуть и будет видна на некоторых STmaps (например, миогенные ряби), они могут на самом деле не вызывает никаких толчок или смешивание содержимого кишечника ^25. Это не может быть известно без муфты этой методики других функциональных измерений. Кроме того, природа многих тканевых препаратов в этом типе системы (т.е. замкнутой системе просвета или постоянной просвета перфузии с помощью насосной системы) приводит к артефактам в пределах STmaps. Таким образом, пользователь должен быть в курсе, как их удельный подготовка органов и эксперимент может привести к появлению артефактов в данных и способы, чтобы избежать или исключить эти артефакты в анализе данных (например, брыжейки, вызванных вертикальные линии или темно-пикселизации из-за неспособности ткани к выталкивать жидкость из системы в закрытом подготовки просвета). Есть несколько методов для просвета перфузии втакта кишечного сегмента, кроме закрытой системе. Одним из способов является использование вместо открытую систему, которая поддерживает постоянную внутрипросветного / противодавление за счет использования повышенных трубки и / или односторонний клапан на конце анального препарата ^8-10,30. Это позволяет жидкости, чтобы выйти из подготовки во пропульсивной схватки.

Как система настроена в основном для обнаружения изменений в просвете диаметре, эти сокращения или модели моторики, которые не имеют очень большое значение просвета диаметр зачастую трудно визуализировать с помощью этого протокола. Так как изменения в пиксельных шейдеров в пределах STmap основаны на изменении просвета диаметра, структуры моторики, которые не вызывают значительных изменений в диаметре не будет визуализировать также в этом методе, если сильные схватки также присутствуют в пределах одной записи. Как описано для визуализации и анализа сокращения пульсации типа (рисунок 3), установив линии анализа в видео записи ближе тО ткань стена может устранить эту проблему. Этот метод уменьшает максимальный диаметр отображается в STmap, так схватки, что только минимально изменять диаметр ткани могут быть визуализированы. Еще один вариант решения этой проблемы меняется продолжительность видео сегменте анализируемого, чтобы исключить сокращения которые значительно влияют просвета диаметр, так что меньшие сокращения более легко визуализировать. Это приводит к потенциальной проблемы подвижности, что минимально изменяет диаметр просвета ищет похожа на отдельном STmap, где сокращения значительные изменения просвета диаметр. Это потому, что определение белых пикселей на карте на основе наименьшего диаметра в данном видео. Если там не так много различия в диаметре в видео (немного или нет сокращения круговая мышца) очень маленьких сокращений, которые не изменяют диаметр подготовки значительно может выглядеть примерно перистальтических сокращений из другого видео. Поэтому, важно рассмотреть фигуруЛегенда в правом верхнем углу карты. Если разница между максимальным и минимальным диаметрами мала, важно, чтобы сравнить STmap на видео оно было подготовлено с, чтобы определить действительность изменения оттенка пикселей, как представлено в STmap. Таким образом, экспертиза баре масштаба в сочетании с реальной записи имеет решающее значение для правильной интерпретации карты.

Видеозапись и пространственно-временное отображение кишечных и толстой сегментов были применены к различным видам, включая данио ^26, мыши ^{25,27 - 30,} крысы ^{7,9,30 - 33,} морской свинки ^{5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35,} щеткохвоста ^12,36, кролик ^2,30,37,38, курица ^39, свинья ^40,41 и ⁴² человек. Наиболее широко изученные виды является морская свинка. Это не удивительно, потому что свинки энтеральной нервной системы часа наиболее полно характеризуется и исторически она была животное наиболее изученным в пробирке в связи с пропульсивной моторики кишечника ^43. Пространственно-временная отображение в основном была применена к трубчатым сегментов кишки от мелких животных; Однако исследования, проведенные в кроликов и свиней с использованием модифицированных систем продемонстрировать применение этой методологии к более крупных животных. В случае кролика, подход идентичен мелких животных исключением того, что более крупные сегменты и ванночках были использованы ^30. Подход, используемый в свинью было использовать выводили петли кишечника с наркозом свиньи, а не погружения сегмента расчлененный ткани в ванне для органов. Кроме того, STmaps были получены с помощью кросс-корреляции, а не методом просвечивания, используемой в большинстве исследований ^40. Изолированный, vascularly перфузии подготовка петля для записи видео и пространственно-временной отображения применяется также для мелких видов, таких как крысы ^{33. Недавнее исследование Kuizenga др. это первое использование STmaps видео записывается моторики закономерности в бывших естественных сегментов кишечника человека 42; хотя, STmapping подходы были применены к анализу манометрических (давление) записей в людях в естественных условиях 3,44. Записанные узоры моторики в ткани человека аналогичны тем, которые уже записаны в моделях на животных с использованием методов и аналогичные проверки расширение этого подхода к тканей человека. Стоит отметить, что данное исследование в сочетании STmaps получены из видеозаписей с измерением мышц записанного силовых преобразователей. Измерение внутрипросветного давления по волоконно-оптическому манометрическим катетер, введенный в Экс Vivo сегменте также преобразуется в STmap, показывающий универсальность STmap визуализировать более изменений в просвета. Этот комбинированный подход корреляции напряжение мышц, внутрипросветный давление и движение стенки позволяетдля более углубленного функционального анализа STmaps генерируемых из видео записи.}

Исследования STmaps, полученных от движений стенки и изменения в просвета (также называемый Dmaps) позволили подробные описания шаблонов моторики, такие как прямоточных перистальтических волн и локализованных сегментных сокращений. В то время как эти модели были определены ранее экспериментальных методов, нынешний подход позволяет более изысканный определение локализованных движений, таких как сократительных рябь и новых анти-перистальтических сокращений ^{9,24,25,30,31,42.} Строительство STmaps и анализа изменений в подвижности рисунком были применены на ключевые вопросы в желудочно-кишечном моторики кишечника и толстой кишки. К ним относятся: дифференциация нейрогенных и миогенных сокращений и определение роли интерстициальных клеток Кахаля ^{6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42,} понимая комплексвзаимодействия между круговыми и продольными мышечными слоями ^{2,7,8,11,12,32,39,40,} исследующие эффекты внутрипросветных питательных веществ ^10,18,19, штаммы микроорганизмов ^{34 и} вязкости ^12,36 на различных форм подвижности, и понимание роли различных эндогенных нейрогуморальных агентов и экзогенных фармакологических агентов ^{2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40} в поколение и модификация подвижности. Будущее этой техники включает в себя соединения его с другими измерениями в том числе давления, электрофизиологии и натяжения / сократительной. Недавние исследования часто включают один или более из этих измерений в сочетании с видеозаписью и пространственно-временной отображения, чтобы обеспечить дополнительные детали корреляционные ^2,42. Кроме того, система может быть использована для измерения подвижности в других трубчатых и не трубчатых органов. Например, были предприняты попытки при измерении с помощью двигательной функции желудкатакая система, но техника и программное обеспечение нуждаются в уточнении для более точной количественной моторику таким не-трубчатый орган ^45. Существует никаких сомнений, что использование пространственно-временных методов картографирования отдельности и в сочетании с более традиционными методами анализа приведет к более углубленного и всестороннего понимания желудочно-кишечного в будущем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид натрия (NaCl)	Fisher	BP358	Для буфера Кребса.
Хлорид калия (KCl)	Fisher	BP366	для буфера Кребса.
Фосфат калия (KH2PO4)	Fisher	P285	для буфера Кребса.
Сульфат магния (MgSO4)	Sigma	M2643	Для буфера Кребса.
Хлорид кальция (CaCl2)	Sigma	C7902	Для буфера Кребса.
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Fisher	BP328	Для буфера Кребса.
Глюкоза	Sigma	G7021	Для буфера Кребса.
Карбкислород (95% O2/5% CO2)
Препарирующие штифты
Подносы/тарелки
Dunkin Hartley Морские свинки	River	Strain 051
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/	Свободно доступно в Интернете.
Монитор перистальтики желудочно-кишечного тракта (GIMM)	Catamount Inc., Сент-Олбанс, Вермонт		Включает в себя детали, перечисленные ниже.
Перистальтические насосы			входят в комплект поставки GIMM.
		для ванны	входят в комплект поставки GIMM.
		ванны TransIllumination	входит в комплект поставки GIMM.
Органные ванны			включены в комплект поставки GIMM.
		интенсивности подсветки	входят в комплект поставки GIMM.
		GIMM Processor ImageJ	входит в состав GIMM.
Полиэтиленовая трубка			в комплекте с GIMM.
Соединительные трубки			входят в комплект поставки GIMM.
Трубки Masterflex для перистальтических насосов			входят в комплект поставки GIMM.
Нагревательная ванна/циркуляционный насос			входят в комплект GIMM.