Методическая статья

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53268

⸱

13 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается новый метод, который позволяет обнаруживать внутриклеточную экспрессию генов после эндоцитоза меченых флуоресценцией наночастиц непосредственно в живых клетках. Метод не требует манипуляций с клетками и не ограничен в отношении целевого гена или вида.

Аннотация

Перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) было успешно выполнено у различных видов млекопитающих, включая мышей, крыс, человека, свиней и других. Верификация клонов iPS в основном опирается на обнаружение эндогенной экспрессии различных генов плюрипотентности. Эти гены в основном представляют собой факторы транскрипции, которые расположены в ядре клетки. Традиционно доказательством их эндогенной экспрессии является иммуногистохимическое окрашивание после фиксации клеток. Этот подход требует репликации культур каждого клона на этой ранней стадии, чтобы сохранить проверенные клоны для дальнейших экспериментов. Настоящий протокол описывает подход с ген-специфичными наночастицами, который позволяет оценивать внутриклеточную экспрессию генов непосредственно в живых клетках с помощью флуоресценции. Наночастицы состоят из центральной частицы золота, связанной с цепью захвата, несущей последовательность, комплементарную мРНК-мишени, а также из погашенной репортерной цепи. Эти наночастицы активно эндоцитозируются, и мРНК-мишень вытесняет репортерную цепь, которая затем начинает флуоресцировать. Таким образом, специфическая экспрессия генов-мишеней может быть обнаружена непосредственно под микроскопом. Кроме того, излучаемая флуоресценция позволяет идентифицировать, выделять и обогащать клетки, экспрессирующие определенный ген, с помощью проточной цитометрии. Этот метод может быть применен непосредственно к живым клеткам в культуре без каких-либо манипуляций с клетками-мишенями.

Введение

В 2006 году, новый подход был описан перепрограммировать соматические клетки в плюрипотентные государства. После предварительный скрининг массива потенциальной перепрограммирования факторов фибробластов мыши могут быть успешно преобразованы в так называемой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPS) по ретровирусной трансдукции и избыточной экспрессии четырех транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) 1. Впоследствии эта методика эффективно воспроизведена с помощью соматических клеток другого вида млекопитающего, включая человека, обезьяны 2 3 4 крыс, собак, 5, 6 овец и свиней 7. Кроме того, модифицированный протоколы опуская или замены потенциально онкогенного фактора транскрипции c-MYC были опубликованы 8, 9.

Независимо от начальной перепрограммирования приблизиться к истинным плюрипотентности растущих колоний должно быть подтверждено, трудоемкий и трудоемкой задачей. Основным недостаткомбольшинства этих анализов является то, что они не могут быть выполнены на живых клетках. Штатные факторы плюрипотентности, таких как Oct4, Sox2, NANOG или Rex1 представляют факторы транскрипции, расположенные в ядре и их обнаружение требует фиксации клеток, предшествующих иммуногистохимии или лизис клеток для RT-PCR анализа 10 -. 12 После этого, эти клетки будут потеряны для будущего Эксперименты, требующие дублирующие культуры каждой колонии.

Таким образом, технология, чтобы проанализировать плюрипотентность на живые клетки является весьма желательным. Несколько подходов действительно могут быть выполнены непосредственно на живых клетках с использованием антител, направленных против мембранных антигенов на основе (например,. TRA-1-60, SSEA4) 12, флуоресцентный сообщили красители для обнаружения щелочной фосфатазы 13 или малые молекулы, которые специфически этикетке эмбриональных стволовых (ES) и плюрипотентных клеток 14. Тем не менее, эти антитела могли бы, тем не менее отрицательно влиять на клетки и каждый метOD ограничивается одной плюрипотентности маркера. Наконец, флуоресцентные молекулярные маяки, двойной антисмысловые олигонуклеотиды с крутыми структур, которые позволяют живой окрашивание клеток, были описаны 15. Хотя этот подход может быть применен ко многим генам, метод требует nucleofection из суспензии отдельных клеток, которые не применим к растущей плюрипотентных колоний.

Пару лет назад наночастицы генов конкретного были описаны для анализа сурвивина выражение в человеческих SKBR3 клеток рака молочной железы 16. Эта рукопись описывает новый инновационный подход к обнаружения маркеров плюрипотентности в живых ES и плюрипотентных клеток путем использования наночастиц золота конъюгатов. Эти наночастицы состоят из центрального золотой частицы с сочетании захвата нити, несущей комплементарную последовательность РНК и Су3-меченого репортер прядь. Флуоресцентный сигнал репортерного нити гасят центральной частиц золота. Кроме того, целесообразнонаночастицы служат положительные и отрицательные элементы управления, соответственно (рисунок 1). Для применения наночастиц просто добавляются к культуральной среде (рис 2) и проникать в клетки с помощью эндоцитоза (рисунок 3). Если РНК-мишени выражается он вытесняет репортер прядь, которая испускает флуоресцентный сигнал. Этот метод не требует манипуляций с клеткой-мишенью и экспрессии гена-мишени может контролироваться оптически под флуоресцентным микроскопом непосредственно в живых клетках. Кроме того, эта технология может быть применена к любой желаемой гена-мишени между видами в случае плюрипотентных клеток и, таким образом, может быть использован в различных областях исследований. Наконец, проточной цитометрии анализа позволяют выявить и обогащение Cy3 положительных клеток.

Протокол

1. Подготовка среда, реагенты и условия культивирования Cell

  1. Человек НЕК 293 эмбриональные клетки почки
    1. Культура клетки НЕК 293 (CRL-1573, АТСС) в F-12 среды DMEM / Ham, дополненной 5% FCS, L-глутамина (2 мМ), и пенициллин (100 Ед / мл) / стрептомицина (100 мкг / мл).
    2. Для прохода клеток, промыть клетки один раз ЗФР, добавить 0,05% трипсин / ЭДТА и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Передача клеток в 15 мл трубки, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту (300 х г) и передать примерно 5x10 5 клеток в свежей T25 культуры колбу.
  2. Мышиные эмбриональных фибробластов (МЭФ)
    1. Добавить 1 мл 0,1% раствора желатина в отдельных 6-луночных и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч. Аспирируйте жидкости и хранить при комнатной температуре до использования.
    2. Культура MEFs в DMEM с добавлением 10% FCS, L-глутамина (2 мМ), L-глюкозы (4,5 г / л), пируват натрия (1 мМ), пенициллином и (100 ед /мл) / стрептомицина (100 мкг / мл) на покрытые желатином 6-луночных планшетах.
    3. Распределить MEFs в 6-луночных планшетах, и пусть они растут до слияния. Добавить митомицин (5 мкг / мл) в течение 2,5 ч задержать клетки. Аспирируйте средний, мыть клетки дважды с полным MEF среды и добавить 3 мл MEF среды друг 6-а. Эти клетки служат в качестве фидера слоя для мышиных и свиной плюрипотентных клеток.
  3. Культура мышиных ES клеток и плюрипотентных
    1. Чтобы приготовить мыши ES культуральную среду, в дополнение DMEM среде с 15% FCS, L-глутамина (2 мМ), L-глюкозы (4,5 г / л), MEM заменимых аминокислот (1x), бета-меркаптоэтанола (0,1 мМ) и ингибирующий лейкоз фактор (1,000 ед / мл).
    2. Промыть 6 колодцев с роста арестован MEFs один раз бессывороточной DMEM, добавить 2 мл мыши ES среду и мышиные клетки плюрипотентных (20% из клеток сливной блюдо). Каждый день мыть клетки один раз бессывороточной DMEM и добавьте 2 мл свежего мыши ES среднего.
    3. Для прохода клеток, мыть каждую лунку один раз бессывороточной DMEM, добавить 00,25% трипсина / EDTA и инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Передача клеток в 15 мл трубки, центрифуги в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту (300 х г), ресуспендируют клетки в 500 мкл мыши ES среды и добавить 100 мкл суспензии 2 мл мыши ES среды в свежем 6-а с MEF фидерных слой.
  4. Культура свиньи IPS клетки
    1. Чтобы приготовить свиной IPS среды, в дополнение DMEM / Ham F-12 среды с 20% нокаут сыворотки, L-глутамин (2 мМ), MEM заменимых аминокислот (1x), бета-меркаптоэтанола (0,1 мм) и пенициллина (100 ед / мл) / стрептомицина (100 мкг / мл). Фильтруют через 0,22 мкм фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение от 2 до 3 недель. При первом использовании, добавить оФРФ (10 нг / мл конечная концентрация).
    2. Промыть 6 колодцев с роста арестован MEFs один раз бессывороточной DMEM / F-12 и добавить 1,5 мл свинья плюрипотентных средних и свиных Хэма плюрипотентных клеток (10% клеток сливной блюдо). Каждый день мыть клетки один раз бессывороточной DMEM / Ham F-12 и добавить 1,5 мл свежей свиной плюрипотентных средние.
    3. Чтобы приготовить диссоциации буфера добавить 2,5% трипсина, коллагеназы IV (10 мг / мл), нокаут сыворотки (20%) и CaCl 2 (1 мм) с Са 2+ -Free PBS. Промыть клетки дважды PBS и инкубируют с диссоциации буфера в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО 2. Передача клеток в 15 мл трубки центрифуги, в течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту (300 х G).
    4. Ресуспендируют свиные плюрипотентных клеток в 500 мкл свежей свиной IPS среды и добавить 50 мкл суспензии 1,5 мл свиной IPS среды в свежей 6-а с MEF фидерных слоя. Каждый день мыть клетки один раз бессывороточной DMEM / Хэма F-12 и добавить 1,5 мл свежей свиной IPS среды.
  5. Фидер-бесплатно культуры клеток человека плюрипотентных
    1. Разморозить исходный флакона препарат базальной мембраны при 4 ° С и разбавляют ледяной бессывороточной DMEM / Ham F-12 с 8 мг / мл, аликвоты и хранить при температуре -20 ° С до дальнейшего использования.
    2. Разморозить аликвоту основанияМембранный препарат ние при 4 ° С и разбавляют ледяной бессывороточной DMEM / F12 Хэма (90 мкг / мл). Внесите 1 мл этого раствора в 3 см культуры блюд и вихревой нежно для того, чтобы вся поверхность покрыта. Печать блюда с парафином и хранить при 4 ° С в течение одной недели. Перед использованием для культивирования клеток инкубируют блюда в течение 30 мин при 37 ° С или 3 часа при комнатной температуре, чтобы позволить полимеризации подготовки базальной мембраны.
    3. Отберите среду из блюд покрыты подготовки базальной мембраны и дважды промывали бессывороточной DMEM / Ham F-12. Добавить 1,5 мл E8 среды в блюдо культуры и человека плюрипотентных клеток (10% из клеток сливной блюдо). Каждый день мыть клетки один раз бессывороточной DMEM / F-12 и добавить 1,5 мл свежей среды E8 Хэма.
    4. Для прохода клеток, полоскать блюд дважды PBS и добавить 1 мл PBS / 0,5 мМ ЭДТА. Инкубируйте блюда в течение 5 мин при комнатной температуре. Монитор клетки под микроскопом. Примечание: При колонии начинают сгонять и APPEAR иметь отверстия они готовы для передачи.
    5. Аспирируйте жидкость, добавить 1,5 мл E8 среду и отделить клетки осторожно пипеткой вверх и вниз. Передача ячейки в 15 мл пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 1200 оборотов в минуту (300 х г), ресуспендируют в 500 мкл E8 среды и добавить 50 мкл суспензии 1,5 мл E8 среды в свежей культуральной чашке, покрытой подготовки базальной мембраны ,

2. Проектирование целевых последовательностей границ вида

  1. Выбор опорного человека, мыши и свиньи кДНК-последовательности из генов-мишеней (GAPDH, NANOG, GDF3) и выполнить анализ Clustal выравнивания нескольких последовательностей.
    Примечание: Это будет означать последовательности гомологичны между видами.
    1. Используйте следующие параметры для множественного выравнивания: штраф разрыв (фиксированный) 10, пенальти разрыв (различной) 5, переход весовой 0, диапазон штрафа разделение разрыв 8% идентичности за задержку 40, максимальное число итераций для выполнения 3.
  2. Отправить желаемых целевых последовательностей производителя (см таблицу материалов) для проектирования и изготовления зонда.
    Примечание: Производитель будет проверить совместимость желаемой последовательности с технологией. При желании последовательность не совместимы, производитель предложить альтернативные последовательности.
    1. Убедитесь, что гомологичные участки, которые могут быть использованы в качестве потенциальных последовательностей захвата пряди имеют длину 27 п.о..
      Примечание: Желательно, чтобы заказать несколько наночастиц с различными нитей захвата для выбранного гена-мишени, как только реальный сотовый эксперимент дать определенный доказательство функциональности индивидуальной последовательности. Таким образом, две различные последовательности для GAPDH и GDF3 были оценены в то время как три различных наночастиц были проверены, чтобы оценить выражение NANOG. Их расположение и точные последовательности были опубликованы в другом месте 17. Производитель коммерчески производит nanopизделия с желаемыми последовательностями и обеспечивает их в лиофилизированной форме.

3. Восстановление наночастиц и дополнения в клеточных культур

  1. Храните лиофилизированные наночастиц при получении при 4 ° С в темноте.
  2. Развести наночастиц путем добавления 50 мкл бидистиллированной воды, которая дает конечную концентрацию 100 нМ. После восстановления хранить при комнатной температуре наночастицы в темноте. Примечание: В этом состоянии они стабильны в течение по крайней мере одного года. Хранение разведенной образцов при 4 ° С может отрицательно сказаться на их стабильность.
  3. Предварительно развести наночастиц исходного раствора с PBS до концентрации 2 (клетки НЕК 293) или 8 нМ (IPS и ES клетки) на день подачи заявления. Примечание: Эта концентрация в 20 раз выше, чем конечная концентрация в культуральной чашке. В ЭС клеток и плюрипотентных клеток, 400 пМ наночастиц индуцированного флуоресцентного сигнала легко обнаружить под микроскопом. Для клеток НЕК 293, AConcentration 100 мкМ достаточно.
  4. Внесите 12,5 мкл разведенного наночастиц в 24-и содержащего 237,5 мкл полной культуральной среды клеток. Для скважин различных размеров, отрегулировать громкость, соответственно. Вихревой пластину осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение наночастиц. Инкубируйте клеток в течение ночи (O / N) при 37 ° С и 5% CO 2 в увлажненной атмосфере.
  5. На следующий день анализа клеточных культур для ген-специфического флуоресценции Cy3 с длиной волны возбуждения 546 нм (575 эмиссии - 640 нм) под флуоресцентным микроскопом. Примечание: Период, необходимый для получения достаточно сильное флуоресценции может зависеть от типа клеток и гена-мишени. В этих экспериментах, это было замечено между 16 и 20 ч после применения зонда.

4. Идентификация Cy3 Положительные Сотовые населения цитометрическим

  1. Растут НЕК 293 или мышиные ЭС клетки, используя условия, указанные в разделе 1.1 или 1.3, гespectively. За день до анализа FACS в добавление GAPDH-специфических наночастиц при различных концентрациях, чтобы клетки НЕК 293 (см фиг.6А) и 400 пМ до мышиных ЭС клеток. Инкубируйте клетки O / N при 37 ° С и 5% CO 2 в увлажненной атмосфере.
  2. Анализ клеточных культур для ген-специфического Cy-3 индуцированной флуоресценции под флуоресцентным микроскопом.
  3. Снять клетки НЕК 293, как указано в пункте 1.1.2. Центрифуга передачи в 1,5 мл пробирку и ресуспендируют в 200 мкл ледяного PBS / 0,5% BSA / 2 мМ ЭДТА (FACS буфера). Держите клетки на льду темные до анализа проточной цитометрии.
  4. Снять мышиные ЭС клетки, как указано в пункте 1.3.3. Центрифуга передачи в 1,5 мл пробирку и ресуспендируют в 200 мкл ледяного PBS / 0,5% BSA / 2 мМ ЭДТА. Держите клетки на льду темные до анализа проточной цитометрии.
  5. Нажмите на клетки через 30 мкм фильтр в предотвратить агрегацию клеток и добавить пропидий йодида (2 мкг / мл конечная концентрация) 2 миндо анализа FACS, чтобы исключить мертвые клетки.
  6. Для анализа Су3-положительных клеток, впервые изложенные иерархические ворота на FSC-A / SSC-A подмножества, ФСБ-Н / FSC-W-подмножество и SSC-H / SSC-W подмножество. Используйте вперед и стороной разброс, чтобы исключить мусор и клетки, которые не разбросаны по клеток. Исключить мертвые клетки их пропидийиодидом окрашивания отображаются PE против ПЭ-Texas Red. Выполните окончательную сортировки ворота на Су3-PE-позитивных клеток (Рис 4).

Результаты

В первой попытке проверки и установления внутриклеточного обнаружения конкретных экспрессии генов в живых клетках с использованием наночастиц мы решили провести пилотные эксперименты с использованием конструктивно выраженной ген дом по поддержанию (GAPDH) в человеческой НЕК 293 клеток. Концентрация наночастиц, используемых в этих экспериментах была выбрана в соответствии с рекомендацией производителя. Добавление GAPDH-специфических зонда к культуральной среде при 100 мкМ конечной концентрации индуцированного четкий Cy3-флуоресценции в этих клетках, которые было видно под флуоресцентным микроскопом после вывода / N инкубации (рис 5А). Два управления были включены в этих экспериментах, чтобы обосновать результат. Один управления состоит из так называемой "скремблирования" наночастицы, где репортер нить не имеет совпадающей последовательности в млекопитающих или эукариотических клетках. К "борьба" наночастиц определяет неспецифическую фона fluorescenCE из-за возможного ухудшения зонда или неполной тушения флуоресценции. Добавление скремблировани зонда произвел лишь незначительное флуоресцентный сигнал, который является незначительным (фиг.5В). Постоянно флуоресцирующих "поглощение" контроль помогает определить способность клеток для включения наночастиц эндоцитозом, которые могут меняться между различными типами клеток. Эти положительные частицы управления производится яркий флуоресцентный сигнал в клетки НЕК 293 (рис 5в). Таким образом, было подтверждено технико-экономическое обоснование технологии записать конкретную флуоресцентный сигнал внутриклеточного гена с незначительным фонового сигнала. Следует отметить, что различие между фоновым сигналом и конкретным флуоресценции уменьшается с течением времени. Фоновые увеличивается за счет зонд деградацию или неполную закалку в то время как удельный флуоресценции затухает постепенно (рис 5D). Те же GAPDH -специфические наночастицы имеютбыли испытаны в первичных культурах фибробластов мышиного, свиного и овечьего происхождения 17. Эти клетки продуцируют значительно более высокую, чем фоновый сигнал клетки НЕК 293 в то время как флуоресценция мишень-специфической довольно слаба, возможно, из-за относительно низкой пролиферативной способности этих культур.

Эти пилотные эксперименты побудило нас использовать эту технологию для обнаружения генов плюрипотентности выражения в IPS, полученных из различных видов. Для этого NANOG и GDF3 были проанализированы, оба из которых, как известно, быть выражено в плюрипотентных клеток 18. В первых клеток, полученных из плюрипотентных кончика хвоста фибробластов в Nkx2.5 сердечной энхансерной трансгенной мыши линии 19 были исследованы. Для обоих генов была получена сильная флуоресцентный сигнал (фиг.6А) и незначительной Cy-3 флуоресценции контролем скремблирования (данные не показаны). Аналогичные результаты были получены на человека и свиньи клеток (IPS Рисунок 6В и С). Важно отметить, что сигнал флуоресценции был ограничен в колонии плюрипотентных и не маркировать фибробласты, используемые в качестве фидерного слоя для мыши и свиньи IPS (см стрелки на рис 6A и C). Анализ экспрессии генов NANOG также показало, что не всякая последовательность предсказано в кремнии быть "хорошим", наконец, работает. Один из трех конструкций из NANOG Определённые наночастиц не индуцированных почти нет флуоресцентный сигнал сравним с контролем схватка, несмотря на матче последовательности 100% в мышиных плюрипотентных клеток (рис 6D). Аналогичный результат был получен на плюрипотентных клеток человека и свиньи происхождения с этим зондом (данные не показаны). Таким образом, наночастицы могут быть использованы для обнаружения экспрессии гена плюрипотентности границ вида, а функциональность каждого предназначенного зонда должна быть оценена заранее.

Многообещающие результаты наблюдений в точкемаркировка живых клеток в чашки для культивирования клеток побудило нас проанализировать экспрессию генов количественно с помощью проточной цитометрии. С этой целью GAPDH -специфические наночастицы были добавлены в переменной концентрации, чтобы НЕК 293 монослоев, чтобы сравнить эффективность маркировки внутри популяции клеток-мишеней. Согласно оценкам флуоресцентной микроскопии усиленная Cy-3 индуцированной флуоресценции наблюдали при наименьшей концентрации по сравнению с клетками, которые не получали наночастицы. Увеличение концентрации наночастиц индуцированной четко зависит от концентрации флуоресценцию клеток НЕК 293 на месте (фиг.7А). Подвергая эти клетки в анализе проточной цитометрии подтвердил зависимое от концентрации эффективность маркировки. Частота Cy3 позитивных клеток значительно возросла (более чем в семь раз), когда высокая концентрация наночастиц применялся (7В). В дальнейших экспериментах стволовые клетки от сердечных Nkx2.5усилитель трансгенных линии мыши 19 были использованы для анализа экспрессии генов плюрипотентности в с помощью проточной цитометрии. Пилотные эксперименты с 400 пМ положительного контроля поглощения дали четко Cy3 положительные живые ES колонии под микроскопом и проточной цитометрии обнаружены почти 40% Cy3 позитивных клеток (7С). В противоположность этому, сравнимой с необработанными клетками примерно 0,1% клеток, обработанных скремблировани окрашена позитивно (данные не показаны). Аналогично добавление наночастиц, специфичных к GAPDH, Nanog и Gdf3 индуцированного четкий сигнал флуоресценции в отдельных колоний в культуре клеток блюдо. Частота положительных клеток Cy3 для GAPDH, как определено с помощью проточной цитометрии было сравнимо с таковым для обоих генов плюрипотентности (7С). Этот результат вполне ожидаем, как Nanog и Gdf3 также полагают, экспрессируются в плюрипотентных ЭСК. Таким образом, эти данные четко индиCate, что клетки, экспрессирующие определенный ген может быть идентифицирован методом проточной цитометрии анализа, качественно и их относительного количества.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое представление структуры наночастиц. (А) Структура наночастицы ген-специфического. (Б) схватка наночастиц (отрицательный контроль). (С) Поглощение наночастиц (положительный контроль). Взято из Лам и др. 17, перепечатано с разрешения Wiley.

figure-results-2
Рисунок 2: Применение наночастиц на клеточных культурах Правильно разбавленный раствор наночастиц с помощью пипетки просто в культуральную среду.. После O / N инкубации генов конкретного флуоресцентные клетки видны под AF luorescent микроскоп.

figure-results-3
Рисунок 3:. Активное поглощение наночастиц по клеток через эндоцитоз (А) Клетки активно поглощают наночастицы эндоцитозом (Б) Целевая мРНК связывается с захвата нити и вытесняет флуоресцирующий репортер..

figure-results-4
Рисунок 4: Память Стратегия проточной цитометрии. (А) Стратегия НЕК 293 клеток. (Б) стратегия для мышиных ЭС клеток. Данные были получены с помощью устройства 1 для клеток НЕК 293 или устройство 2 для мышиных ЭС клеток, а затем анализировали с помощью программного средства (табл материалов).

/53268fig5.jpg "/>
Рисунок 5:. Анализ GAPDH -expression в клетки НЕК 293 GAPDH -специфический наночастиц был добавлен к клеткам 100 мкМ (конечная концентрация) и флуоресценции регистрировали после O / N инкубации (А) GAPDH -специфический наночастиц (Б.. ) Схватка (отрицательный контроль). (С) Поглощение (положительный контроль). (D) Кинетика поглощения схватки и контроля. Флуоресценции определяли при указанных временных точках после добавления GAPDH-специфических наночастиц. Масштабные бары представляют 50 мкм.

figure-results-5
Рисунок 6:. Анализ экспрессии генов Плюрипотентность в плюрипотентных клеток различных видов наночастиц специфичными для NANOG или GDF3 были добавлены к клеткам в 400 мкМ (конечная Concentration) и флуоресценции был записан после вывода / N инкубации. (A) мышиной плюрипотентных клеток. (B) человека плюрипотентных клеток. (C) свиней плюрипотентных клеток. Стрелки (A) и (C) назначают немеченый фибробластов фидерных слоев клеток. (D) флуоресценции в мышиных плюрипотентных клеток после добавления NANOG-дизайна SF3 наночастицы. Масштабные бары представляют 50 мкм.

figure-results-6
Рисунок 7: наночастиц Маркированный живые клетки могут быть идентифицированы с помощью проточной цитометрии. (А) Микроскопическое вид Cy3 положительного клеток НЕК 293 после добавления различных концентраций наночастиц. (В) Частота Cy3 положительных клеток, определенных при помощи проточной цитометрии. (С) Живая окрашивание мышиных колоний ЭС клеток и определение частоты Cy3 положительной клеток. Наночастицы были добавленыв конечной концентрации 400 мкМ в. Масштабные бары представляют 50 мкм.

Обсуждение

Данная работа описывает использование флуоресцентных помечены наночастиц, которые позволяют достоверную оценку экспрессии гена внутриклеточного непосредственно в живых клетках из разных видов млекопитающих с разнообразными гистогенетических происхождения под флуоресцентным микроскопом. Этот подход имеет несколько преимуществ по сравнению с другими известными методами. Прежде всего исследователь не ограничивается по отношению либо к гену-мишени или клеточного типа. Все антитела на основе методов обнаружения ограничивается одной эпитоп. Хотя флуоресцентные молекулярные маяки могут быть разработаны для широкого спектра генов, этот метод требует диссоциации клеток и последующее nucleofection 15. В противоположность этому, применение наночастиц геноспецифических не требует манипуляций с клеткой-мишенью, который поглощает наночастиц активнее эндоцитоза. При последующем пассирования частицы золота постепенно оставить клетки и культуральную может быть использован в downstreaм эксперименты.

Тем не менее, эта технология все еще имеет некоторые ограничения. Некоторые маркеры, очевидно, не обнаруживается из-за их углеводной природы, такие как SSEA-1 или TRA-1-81 20. В настоящее время большой массив наночастиц в продаже. Эти частицы были предварительно тестировали на их функциональности в клеточных экспериментов. Целью данной работы заключалась в разработке пользовательских зондов, которые могут быть использованы границ вида. Когда после такого подхода при проектировании или зонд для нового гена-мишени нужно быть в курсе, что функциональность в кремнии предсказал зонд должен быть тщательно оценены в пробирке. NANOG-SF3 зонд, который показал 100% -ную гомологию к последовательности гомологии не работать вообще, а NANOG-SF1 с одной несогласованной базе в мышиных и свиной последовательности производится приятный сигнал флуоресценции. Другой вопрос относится к эффективному поглощению наночастиц. Частицы введитеклетки по эндоцитоза, процесс, который зависит от размера наночастиц 21, типа клеток и статуса дифференцировки и 22 сотовой возможность выполнять phago- и макропиноцитозом 23. Оптимальная концентрация, чтобы получить удовлетворительный сигнал флуоресценции должна быть проверена для каждого отдельного применения или клеточной линии. С этой целью первый эксперимент должен быть всегда применение контроля поглощения для оценки совместимости зондов в пределах типов клеток и условий культивирования прежде чем перейти к мишень-специфической обнаружение экспрессии генов.

Критическая точка для получения надежных результатов при применении этого протокола к новому клеточной линии или популяции клеток является включение соответствующего контроля. Постоянно флуоресцирующих управления поглощение обеспечит подсказку, которые концентрации наночастиц будет индуцировать достаточное сигнал флуоресцентного в популяции клеток-мишеней. Флуоресценции должны быть оценкид на следующий день в качестве сигнала будет исчезать с течением времени 17. В то же время управление скремблирования без аналога в геноме эукариот, приложенной в идентичной концентрация должна вызвать незначительное фонового сигнала. В качестве третьего управления целесообразно использовать наночастицы для конкретного гена домашнего хозяйства (например, GAPDH, β-актина). Эти наночастицы служат в качестве положительного контроля, что этот подход может быть использован для обнаружения специфическую экспрессию генов в выбранном популяции клеток-мишеней. Если эти элементы управления оказываются удовлетворительными, можно ожидать, чтобы получить надежные конкретные флуоресцентные сигналы с помощью наночастиц, специфические для других генов-мишеней. Концентрация применяемых наночастиц также может иметь решающее значение, поскольку они, как было показано понижающей регуляции последовательность-мишень 24. Тем не менее, этот эффект требует более высокие концентрации (5 нм), чем концентрации, используемые в экспериментах, представленных здесь (400 пМ). При этой концентрации nanoflaразрешения не влияют на мРНК гена-мишени или уровни белка и концентрации, как высокие, как 2 нМ не ослабляют пролиферацию HEK293 и мышиных ЭС клеток 17. Кроме того, весь анализ экспрессии генома не выявили каких-либо существенных изменений в экспрессии генов, 25. Таким образом, при концентрациях до 1 нм nanoflares не должен иметь никаких важных побочных эффектов.

Очень перспективно применение этой технологии является возможность маркировать любую данную популяцию клеток, который отмечается по конкретной гена. Недавно наночастицы генов конкретного успешно используется для избирательного окрашивания живых желудочковых миоцитов 26, субпопуляции клеток меланомы 27, моноциты 28 и мозжечковая клеточных культур 29. Такие флуоресценции маркировку клеточные популяции могут быть отсортированы и очищали с помощью проточной цитометрии, как живые клетки. В области онкологии это можно себе представить, чтобы изолировать живые метастатические опухолевые клетки на животных моделяхна основе их выражения CEA, самое ценное для поиска потенциального метастазов способствующего гены или целевые структуры. Недавно мы показали, что действительно перепрограммировать мышиные плюрипотентных колонии могут быть идентифицированы на месте с Nanog-специфических наночастиц на основе обнаруженного интенсивности флуоресценции 17. Таким образом, идентификация действительно перепрограммировать колонии плюрипотентных может быть выполнена на высоких платформах пропускная способность, которые используют робота обнаружение флуоресценции и выбрать устройства для выявления наиболее перспективных колонии. Эта технология появляется, чтобы быть пригодным во многих областях исследований, чтобы выбрать клеточные субпопуляции конкретных и, кажется, можно применять наночастицы в высоких платформах производительность. В заключение, этот протокол представляет собой новый подход с использованием флуоресценции помечены наночастиц, который позволяет обнаруживать выражения внутриклеточного гена непосредственно в живых клетках. Эта технология может быть ценным инструментом для очистки, расширения и дальнейшего характерИзе редкие клеточные субпопуляции во многих областях исследований.

Раскрытие информации

HL получил наночастицы из EMD Millipore Corporation бесплатно. Все другие авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Линетт Хенкель за ее отличную поддержку при проведении проточного цитометрического анализа. Мы благодарим д-ра Дона Уэлдона и д-ра Виктора Кунга (Темекула, Калифорния) за критическое прочтение рукописи и полезные комментарии. Эта работа была поддержана грантами Немецкого научно-исследовательского общества, KR-3770-7/1 и KR-3770-9/1 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), исследовательским грантом Dr. Rusche Research Grant 2014 от Deutsche Stiftung für Herzforschung и Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), и Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A и DZHK B 14-013SE (M. K.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среда DMEM/Ham's F12 со стабильным глутаминомBiochrome GmbHFG4815
Сыворотка эмбриона теленкаLife TechnologiesSV30160.03
Пенициллин/стрептомицин (100x)MilliporeA2213
Пируват натрия (100x)Life Technologies11360-039
DMEM высокая глюкоза со стабильным глутаминомBiochrome GmbHFG0435
МитомицинC Roche10 107 409 001предотвращает деление клеток MEF
MEM заменимых аминокислот (100x)Life Technologies11140-050
b-меркаптоэтанолSigmaM3148
фактор ингибирования лейкемии (107 U/мл)MilliporeESG1107фактор роста для мышиных ES и iPS-клеток, предотвращает дифференцировку
0,25% Трипсин/ЭДТА (1x)Life Technologies25200-056отделяет адгезивные клеточные культуры
Нокаут-сывороткаInvitrogen10828-028добавка для iPS-культуры человека и свиньи
bFGFPeprotech100-18Bфактор роста для iPS-клеток человека и свиньи
Коллагеназа IVWorthingtonLS004188диссоциация iPS-клеток свиньи
MatrigelCorning354277эффективную поверхность для безфидерной культуры iPS-клеток человека, обозначенную в манускрипте
E8 mediumStem Cell Technologies05940определенная среда для безфидерной культивирования iPS-клеток человека на зондах
15575-038
SmartFlareEMD Millipore Corporationкастомизировала прибордля обнаружения внутриклеточной экспрессии генов в живых клетках, называемых наночастицами в манускрипте
Флуоресцентный микроскопZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 ИнкубаторThermo Scientific51026282
желатин (из свиной кожи)SigmaG6144улучшает прикрепление MEFs на поверхность
Пропидия йодид (1 мг/мл)SigmaP4864маркирует мертвые клетки в проточных цитометрических анализах
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544упоминается как устройство 1 на рисунке
4 NaviosBeckman Coulter775213упоминается как устройство 2 на рисунке 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarдля анализа данных проточной цитометрии
Matrigel EDTA 0,5 M Invitrogen программное обеспечение

Ссылки

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи